基因工程的步骤.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,DNA,重组技术的基本工具,基因工程的基本操作程序,基因工程的概念,基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过,等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的,_,基因工程的别名,基因拼接技术或,DNA,重组技术,操作环境,操作对象,操作水平,基本过程,结果,优点：,原理：,体外,DNA,重组和转基因,新的生物类型和生物产品,。,生物体外,基因,DNA,分子水平,剪切拼接导入表达,人类需要的基因产物,基因重组,定向改造生物体的性状（目的性强）,育种周期短，克服远缘杂交不亲和障碍,为什么基因工程能够成功呢？,基因,拼接,的理论基础,：,规则的双螺旋结构,基本单位都是脱氧核苷酸,遵循碱基互补配对原则,外源基因在受体内,表达,的理论基础,：,生物界共用一套遗传密码,DNA,重组技术的基本工具,限制性核酸内切酶,“,分子手术刀”,DNA,连接酶,“,分子缝合针”,基因进入受体细胞的载体,“,分子运输车,”,限制性核酸内切酶,“,分子手术刀”,分布：,作用特点：,切点：,举例：,Eco,RI,限制酶能识别,GAATTC,序列，并在,G,和,A,之间切开（黏性末端）,SmaI,限制酶能识别,GGGCCC,序列，并在,G,和,C,之间切开（平末端）,主要在原核生物中,特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点,磷酸二酯键,限制酶所识别的序列有什么特点,限制酶所识别的序列，无论是,6,个碱基还是,4,个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链,DNA,上的碱基是反向对称重复排列的。,DNA,连接酶与,DNA,聚合酶的比较,DNA,连接酶,DNA,聚合酶,作用实质,是否需模板,连接,DNA,链,都是催化两个脱氧核苷酸,之间形成磷酸二酯键,不需要,需要,双链,单链,DNA,连接酶,DNA,聚合酶,作用过程,作用结果,在两个,DNA,片段之间形成磷酸二酯键,将单个脱氧核苷酸加到已存在的核酸片段的,3,端的羟基上，形成磷酸二酯键,将存在的,DNA,片段连接成重组,DNA,分子,合成新的,DNA,分子,基因的载体,“,分子运输车”,载体的作用,：,常用的载体有：,1、将外源基因转移到受体细胞中去。,2、利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。,质粒，,噬菌体的衍生物，动植物病毒等,质粒,质粒是基因工程最常用的运载体，它广泛地存在于细菌中，是细菌染色体外能够自主复制的很小的环状,DNA,分子，大小只有普通细菌拟核,DNA,的百分之一,。,要对天然质粒进行人工改造,作为载体必须具备哪些条件,？,1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；,2、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；,3、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等）,4,、对受体细胞无害,1,、目的基因的获取,2,、基因表达载体的构建,3,、将目的基因导入受体细胞,4,、目的基因的检测与鉴定,基因工程的基本操作程序,一、目的基因的获取,1,、目的基因主要是指,_,编码蛋白质的结构基因,2,、获取目的基因的常用方法,（,1,）从基因文库中获取,（,2,）人工合成,（,3,）利用,PCR,技术扩增目的基因,什么是基因文库？,什么是基因组文库？,什么是部分基因文库？,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？,(1),从基因文库中获取目的基因,概念：,基因文库,（,gene library,）,基因组文库,部分基因文库,（如,cDNA,文库）,将含有某种生物不同基因的许多,DNA,片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库,(gene library),基因组文库,:,基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库,.,部分基因文库,:,基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库,.,基因组,DNA,文库与,cDNA,文库的比较,（,2,）利用,PCR,技术扩增目的基因,PCR,聚合酶链式反应,是一项生物,体外复制,特定,DNA,片段的核酸合成,技术,。通过此技术，可获取大量的目的基因。,（,3,）人工合成目的基因,二、基因表达载体的构建,核心,（,1,）用一定的,_,切割质粒，使其出现一个切口，露出,_,。,（,2,）用,_,切断目,的基因，使其产生,_,_,。,（,3,）将切下的目的基因片段插入质粒的,_,处，再加入适量,_,，形成了一个重组,DNA,分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,相同的黏性末端,切口,DNA,连接酶,1.,过程,:,质粒,目的基因,限制酶处理,一个切口,两个黏性末端,两个切口,获得目的基因,DNA,连接酶,表达载体,同一种,1.,过程,:,2,、基因表达载体的作用,a,、使目的基因在受体细胞中稳定存在,并遗传给子代,b,、同时使目的基因能表达和发挥作用,思考：,作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：,（,1,）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自,身基因的启动子,才能比较有利于基因的表达；,（,2,）通过,cDNA,文库获得的目的基因没有启动子,，只将编码序列导入受体生物中无法转录；,（,3,）目的基因,是否导入,受体生物中需要有,筛选标记,；,（,4,）为了增强目的基因的,表达水平,，往往还要增加一些其他,调控元件,，如增强子等；,（,5,）有时需,要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位,，往往要加上,可以标识存在部位的基因,（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,3.,基因表达载体的组成：,它们有什么作用？,a,、目的基因,b,、启动子,c,、终止子,d,、标记基因,位于基因的首端,是,RNA,聚合酶结合位点,位于基因的末端,终止转录,检测目的基因是否导入受体细胞,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴,细菌或病毒侵染细胞,的途径。,三、将目的基因导入受体细胞,1,、,将目的基因导入植物细胞,（,1,）农杆菌转化法,特点,:,能感染,双子叶植物,和,祼子植物,对单子叶植物无感染能力,Ti,质粒,的,TDNA,可转移至受体细胞并整合到其染色体上,转化过程,:,Ti,质粒,目的基因,构建,表达载体,导入,植物细胞,插入,植物细胞染色体,DNA,表达,新性状,转入,农杆菌,（,2,）基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体,DNA,打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,（,3,）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加,DNA,（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,2,、,将目的基因导入动物细胞,方法,:,显微注射技术,操作程序,:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,胚胎发育,新性状动物,3,、,将目的基因导入微生物细胞,常用法,常用菌,：,微生物作受体细胞原因：,过程：,Ca,2+,处理,大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收,DNA,：,Ca2+,处理,大肠杆菌,繁殖快,、多为单细胞、遗传物质相对少,将目的基因导入受体细胞,生物种类,植物细胞,动物细胞,微生物细胞,常用方法,受体细胞,原核细胞,转化过程,将目的基因插入到,Ti,质粒的,T,DNA,上,农杆菌,导入植物细胞,整合到受体细胞的,DNA,表达,将含有目的基因的表达载体提纯,取卵,(,受精卵,),显微注射,受精卵发育,获得具有新性状的动物,Ca,2,处理细胞,感受态细胞,重组表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收,DNA,分子,农杆菌转化法 显微注射技术,Ca2,处理法,体细胞或者受精卵,受精卵,(,四,),目的基因的检测与鉴定,导入检测：目的基因是否导入受体细胞,检测,表达检测,方法,转录检测,翻译检测,DNA,分子杂交,分子检测法,鉴定,抗虫鉴定,抗病鉴定,活性鉴定等,个体水平的鉴定,分子杂交,抗原抗体杂交,知识延伸,DNA,分子杂交技术,该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链,DNA,解开，把单股的,DNA,小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的,DNA,中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的,DNA,或基因。,PCR,技术,原理：,前提：,原料,方式,PCR,扩增仪,DNA,复制,一段已知目的基因的核苷酸序列,：以,_,方式扩增，,即,_,（,n,为扩增循环的次数）,指数,2,n,模板,DNA,；,DNA,引物；四种脱氧核苷酸；热稳定,DNA,聚合酶（,Taq,酶）；离子,过程,变性、退火、延伸三步曲,变性：,加热至,90,95,双链,DNA,解链成为单链,DNA,退火：,冷却至,55,60,部分引物与模板的单链,DNA,的特定互补部位相配对和结合,延伸：,加热至,70,75,以目的基因为模板，合成互补的新,DNA,链,变性,退火,延伸,(3)PCR,技术与,DNA,复制的比较,PCR,技术,DNA,复制,相同点,原理,原料,条件,DNA,双链复制,(,碱基互补配对,),四种游离的脱氧核苷酸,模板、,ATP,、酶等,PCR,技术,DNA,复制,不同点,解旋,方式,场所,酶,结果,DNA,在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,主要在细胞核内,热稳定的,DNA,聚合酶,(,Taq,酶,),细胞内含有的,DNA,聚合酶,在短时间内形成大量的,DNA,片段,形成整个,DNA,分子,原核细胞的基因结构,(,补充内容）,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与,RNA,聚合酶结合位点,启动子,终止子,不编码蛋白质。,：编码蛋白质,连续不间断,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,调控遗传信息表达,上,游有启动子，下游有终止子,真核细胞的基因结构（补充内容）,编码区,非编码区,非编码区,与,RNA,聚合酶,结合位点,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列,内含子：不能编码蛋白质的序列,：,有调控作用,上游有启动子，下游有终止子,非编码序列：,包括非编码区和内含子,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是,_,的,编码区是间隔的、,_,的,相同点,都由能够编码蛋白质的,_,和具有调控作用的,_,区组成的,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,连续,不连续,编码区,非编码区,