Signaling-pathway-in-response-to-DNA-damage-3幻.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,DNA 损伤,真核细胞的DNA分子处在内环境及外环境DNA损伤,物的不断攻击下，这些DNA损伤物或可直接损伤一个,碱基或打断DNA主链，或使DNA链发生交联。如，正,常细胞代谢中或受到离子辐射时产生的氧化自由基可,使DNA受损伤。,真核生物经长期进化，已建立了完整的DNA损伤修,复机制，以应对各种代谢及外环境中的DNA损伤因素对DNA的损伤。,DNA损伤的后果及其应用：,后果：,1）,引起肿瘤,：从流行病学研究，动物模型，以及许多与DNA损伤修复有关的基因突变引起的人类肿瘤易患综合征的观察中早已证实,DNA损伤可导致肿瘤。,2）,DNA损伤是许多临床治疗副作用的原因。,如，骨髓抑制，胃肠道反应，头发脱落，均与DNA损伤诱导的细胞死亡有关。,3）,DNA损伤,引起其它疾病,。,应用：,DNA损伤被用于治疗肿瘤,：许多肿瘤治疗的措施，如放疗，许多化疗药物，都通过损伤DNA来达到治疗目的。,Michael B.Kastan&Jiri Bartek.,Nature,2004,432:316-323,肿瘤，衰老，遗传病等,DNA损伤及其后果示意图,1.DNA修复及细胞的反应,细胞有一套完整的DNA修复机制来应对DNA损伤因素的不断攻击所造成的损伤。由于DNA损伤的多样性，修复机制也各有不同。,1.1.,DNA修复,DNA修复 指双链DNA上的损伤得到修复的现象。现在已知在生物体中有三种DNA的修复：（1）光恢复修复：由紫外线所造成的DNA损伤（胸腺嘧啶二聚体），由于光恢复酶的催化，在可见光照射后恢复成完整无损的状态（2）切除修复：嘧啶二聚体或某种碱基损伤可以被切除然后通过相对的一条完整无损的DNA链作为模板重新进行合成，在这个被切除的部分中填上正常的碱基排列在大肠杆菌中切除修复是由内切核酸修复酶，DNA多聚酶IDNA连接酶依次地进行作用的结果。（3）重组修复：尽管双链DNA上发生了损伤（这种修复可以修复以下多种损伤），但生物还是能够形成完整无损的后代DNA，这是生物的耐受性（tolerance）之一由于DNA上发生损伤，在以它作为模板所产生的新的DNA中，相对原来发生损伤的地方就会出现缺口，从原来另一条完整无损的链（sister strand）上可以切下相应的核苷酸部分填到这个缺口中去，这就是重组修复的机制。除上述这些修复机制以外，似乎还存在着例如重新合成修复（de novo synthesis repair）、再结合修复等等的DNA的修复机制即使在上述的修复现象中，其分子机制的细节也随生物种类的不同而有相当的差别。尽管如此，不过几乎所有的生物从病毒到人都具有DNA修复的能力。已知缺乏切除修复的突变体对射线和化学诱变剂具有非常高的敏感性，此外突变和癌变的频度也会增高但是重组修复有缺乏时，射线和化学诱变剂不能诱发它们产生突变,1.2.,细胞对DNA损伤的反应：,细胞周期受抑制,(cell-cycle arrest),死亡,(apoptosis)除DNA损伤物外，细胞必须应付其它Stresses,如间断的或持续的暴露于低水平的氧或营养。细胞利用不同的信号通路应对这些环境变化，各种机制有其共性。,我们将重点介绍面对DNA损伤及其它影响DNA复制的stresses 时细胞调节细胞周期进程的一些机制，尤其高等真核生物的DNA损伤修复之信号传导。,2.信号通路,2.1.,ATM 及 ATR启动的信号,细胞对不同DNA损伤有相应的反应。,为配合修复DNA损伤,细胞在修复前及修复期间也控制其它的细胞过程，如DNA复制或有丝分裂。在复制半途发生损伤对细胞而言是一挑战，但细胞仍可停止或放慢DNA复制等待损伤被修复。,DNA损伤后细胞周期进程可以瞬时停止也是真核细胞的一个优势，这样可限制子代细胞的接受遗传性突变，也增加细胞的存活。,ATM,(ataxia telangiectasia mutated),及ATR(ATM-and Rad3-related),的激活是DNA损伤后抑制细胞周期进程的最早，最重要信号。,ATM kinase 主要被DNA损伤激活，ATR 激活 是细胞对DNA复制叉（复制过程中形成的DNA结构）形成受抑制做出反应所需的重要步骤。复制叉形成受抑制可能是DNA损伤及其它,stresses 刺激的结果（因为DNA损伤导致,复制叉形成受抑制）。,ATM 与 ATR 协同参与许多细胞应激反应及其它复杂反应(see Fig)。,e.g.,MB Kastan&Bartek.Nature,2004,432:316-323,修复机制失常,遗传病,ATM,ATR 激活及发挥作用示意图,ATM 与ATR 二者皆为大分子量蛋白激酶,(分别为350,kDa,，301 kDa)，它们磷酸化无数底物，从而发挥生物学作用。,在非应激状态，,ATM 与ATR,并不刺激细胞生长抑制通路。,在暴露于应激刺激时，二者可被瞬间激活。,缺乏ATM的病人，小鼠及细胞可存活,提示ATM kinase并不是正常细胞周期或细胞分化等重要细胞功能必需的。非应激状态，,ATM kinase活性低。ATM主要帮助细胞应对影响DNA或染色体结构的细胞应激。,Ser-1981是ATM的单一，重要的损伤诱导磷酸化位点，该位点的磷酸化是ATM能够作为一快速，敏感的Checkpoint Pathway,开关的分子基础。在非应激细胞，ATM 形成同源二聚体，,Ser-1981 被包绕在二聚体内（非磷酸化状态），因此其激酶活性被抑制。,C Stevens,NBL Thangue,.,DNA Repair 3(2004)10711079,正常细胞,DNA损伤细胞,DNA损伤对细胞的影响,及ATM的作用,DNA DSB 导致ATM protein 构象变化并刺激ATM磷酸化自身的 Ser-1981,使二聚体解离。激活的ATM 单体磷酸化无数底物,无论它们是核/胞浆穿梭蛋白,如,p53,或位于DNA断裂的现场（位置）的蛋白,如,NBS1,(Nijmegen breakage syndrome 1),BRCA1,(breast cancer 1),及,SMC1,(structural maintenance of chromosomes 1,)，引起Cell-Cycle Arrest并修复损伤的DNA。诱导快速，广泛的ATM分子间自磷酸化的,构象变化并不需要ATM二聚体到达DNA损伤位点，而是在距DNA断裂位置一定距离，ATM二体可感受到的一些染色体结构的变化引起,。这种感受的机制不明。有研究认为多蛋白复合体MRE11(meiotic recombination 11)/RAD50/NBS1(MRN)对离子辐射后的ATM激活起促进作用 至少在低剂量离子辐射下如此 这一发现有助于阐明ATM的激活机制。,ATM对底物进行磷酸化需要：,(1)ATM homodimer解离;(2)被阻断的ATM kinase domain的解放;(3)激活的ATM monomer 必须到达底物所处的位置，如DNA断裂位点.,当到达DNA断裂位点时,激活的ATM 磷酸化重要底物如 NBS1,BRCA1 及SMC1。如果ATM 被激活后不能到达 DNA 断裂位点,ATM仍可磷酸化其它底物，如 p53。,DNA 损伤通过两个步骤引起ATM激活及其底物磷酸化:,(1)染色体结构变化,诱导,分子间ATM自磷酸化及同源二体解离;(2)激活的ATM 单体被招募到底物所处位置，有些底物位于DNA损伤位置(Fig)。,关于ATR，,ATR kinase的单独出现 不足于执行其细胞功能。,除ATR外,其它几种蛋白或复合体必须被招募到单链DNA位点辅助ATR发挥作用。它们包括：,clamp-loading,RAD17-containing complex,RSR,RSR参与,RAD9RAD1HUS1(911)的Loading，,sliding clamp onto chromatin,还有 claspin 蛋白,后者被单独招募到染色体。这些过程均需ATR催化的 CHK1磷酸化，均为为激活appropriate cell-cycle checkpoints所需(Fig)。,ATR/ATRIP complex也许被RPA招募到ssDNA。最佳的底物磷酸化及对细胞周期的抑制依赖其它蛋白如 claspin,RSR complex 及 9-1-1 complex。如图 Fig.1所示,这些通路通常相互配合，不同的通路间可以交叉。,Fig ATM-及ATR指导的细胞周期抑制被诱导的机制。DNA 断裂导致无活性ATM二体解离。ATM monomer 及其底物的定位有几种蛋白调节，这些蛋白包括,MRN complex,MDC1,53BP1,及 Brca1。,(ATRIPATR interacting protein),2.3.,信号的转导,为有效传导信号并安排/策划对DNA损伤的整体细胞反应,checkpoint kinases,ATM 及 ATR 与其它两类蛋白密切合作。,Checkpoint mediators,(also known as,adaptors,),Transducer kinases,CHK1 and CHK2,(Fig),下游 checkpoint targets调控性的磷酸化 在细胞周期，DNA修复及细胞死亡过程发挥功能的不同效应蛋白,的磷酸化,可被蛋白激酶磷酸化，或被转导激酶磷酸化。或者，这些效应物的不同残基由 ATM/ATR 或CHK1/CHK2 磷酸化(Fig3)。,2.3.1。信号转导的效应物激酶CHK1 及 CHK2,ATM 与ATR的主要底物是 checkpoint-transducer serine/threonine kinases(effector kinases)CHK2 and CHK1。考虑到,ATMCHK2 及ATRCHK1 通路分享许多底物（或均可作用于,checkpoint effector proteins,）,ATM 及 CHK2 对产前发育无关紧要,ATR 或CHK1完全缺乏则可引起胚胎死亡。,从一个最近研究可对此现象得出合理的解释，该研究发现,ATRCHK1对正常的细胞周期的一些基本过程的调节，包括控制DNA复制或启动有丝分裂。,2.3.2.ATM/ATRCHK2/CHK1影响细胞周期,在正常的细胞周期,哺乳动物细胞只可在G1 早期到中期生长因子去除或生长抑制信号介入的情况下从细胞周期退出。这样的现象发生在细胞跨过 RB/E2F 控制的限制点之前,此后细胞注定进行DNA复制及细胞分裂。,然而,ATM/ATRCHK2/CHK1-controlled checkpoint network 对基因毒性应激的反应可瞬时延缓G1，S，G2 期的进行，或甚至使细胞在进入S期前长时间抑制在G1或G2期,。考虑到无错误DNA复制及染色体分离对维持基因组完整性及预防肿瘤的重要性，这些最易于改变的细胞周期阶段受广泛的checkpoint,效应机制保护就不令人意外。,3.细胞周期限制点（Checkpoint）,cell-cycle checkpoint 指细胞周期中细胞主动停留在某一状态，直到细胞完成前一过程如DNA复制或有丝分裂并满足所有进入下一期的需求。,Checkpoint 中介物的作用,1).MDC1,(,mediator of DNA damage checkpoint 1,),在功能上作为磷酸化的 H2AX(-H2AX)与,MRN complex 的组分,NBS1间的分子桥,为这些蛋白及其它,checkpoint 及 DNA 修复蛋白(包括激活的ATM 及 BRCA1)间在损伤位置附近相互作用,提供一平台。,2).53BP1,(,p53 binding protein 1,)，与p53结合并增强其转录活性。,3).BRCA1,大的多结构域蛋白，其C端有两个随机 的,BRCT,(Brca1 carboxy-terminal)结构域。BRCT 结构域 是蛋白质与磷酸化蛋白结合单元，为中介蛋白如何促进DNA损伤位点附近,checkpoint 及修复蛋白间相互作用提示一可能的机制。,哺乳动物细胞缺乏上述三蛋白中的任何一个将增加细胞对 DNA损伤物,S-phase 内及 G2/M 细胞周期 checkpoints的损伤的敏感性。,4).,Histone H2AX,一种跨越双链断裂DNA染色体区段的标志性修饰,其作用为招募信号通路中介物至DNA损伤位点。,Fig 3 DNA 双链断裂诱导的细胞周期Checkpoint通路,红色者为肿瘤抑制基因，绿色为原癌基因。ATM 及ATR 磷酸化信号传导网络中不同组分，或直接磷酸化（由红色P 表示）或通过转导激酶CHK2 及 CHK1(黑色 P)。BRCA1 蛋白也参与细胞周期抑制及同源重组DNA修复过程,p53 控制参与细胞死亡与DNA修复的基因之表达。细胞周期,被效应通路,阻滞/阻断的Phase及持续时间在途中已标示,包括由,p53介导的持久抑制,(senescence)。,ATM/ATR 及 CHK2/CHK1 调控的,checkpoint 网络也影响细胞周期之外的其它细胞反应，如DNA修复，转录，染色体组装，及细胞死亡,。,3.1.,G1 及 G1/S checkpoint 反应,DNA损伤时，贯穿G1期，处于统治地位,checkpoint,反应是,ATM(ATR)/CHK2(CHK1)p53/MDM2-p21 pathway,(Fig),这一通路可诱导持续的，有时甚至是永久的G1 Arrest。细胞周期中,ATM 及CHK2 的表达是相对持续的，它们的作用只有在接近,G1/S transition时变得重要。,ATM/ATR,直接磷酸化p53,transcription factor N-terminal 转录激活区,特别是在同一结构域的,Ser15,，,Thr18,及,Ser20,也有,另外的,p53 序列可作为CHK1/CHK2 的目标。正常情况下结合,p53 并促进其降解的,ubiquitin ligase,MDM2,在DNA损伤后也是,ATM/ATR及CHK2/CHK1的目标,。,p53 与Mdm2的,这些修饰对,p53蛋白的稳定性，积累，以及其转录激活活性有重要的调节作用。,p53 转录因子的主要目标是,p21,后者使促进,G1/S transition 的 cyclin E/Cdk2 kinase静默,引起G1 arrest。细胞因此不能启动DNA合成，也使,RB/E2F pathway,不能被激活,引起持久的G1 阻断/滞。所以,G1 checkpoint response 以两个重要的肿瘤抑制基因通路为目标,即 p53 与 pRB 通路。人类肿瘤 中这两个通路最常处于失调状态也验证了这一理论。,在G1晚期,ATR 及 CHK1表达的增加,作为E2F-依赖的S-phase 转录促进程序的一部分,。Cyclins E 与 A,以及 cyclin E(A)/CDK2 kinase的激活物 CDC25A phosphatase 也在G1晚期被诱导。,ATR/CHK1(but not ATM/CHK2),通过几个,温和的,CDC25A苏氨酸残基磷酸化，然后通过泛酸依赖的，蛋白酶体介导的降解在正常的细胞周期中将,CDC25A维持在适当的水平。,在对基因毒性应激反应时，此生理机制因,CHK1 and CHK2活性增高而被加强,导致CDC25A下调及其后的 cyclin E(A)/CDK2 complexes活性受抑制。不管同步的,checkpoint kinases 刺激的,CDC25A 及p53 磷酸化的程度如何(Fig),这些事件对细胞周期的影响是快速的，这与行动缓慢的p53 pathway不同,并不需要转录及新合成的蛋白的积累。所以，,CHK1/CHK2CDC25A checkpoint,是快速的,p53不依赖的，它延迟 G1/S transition 也使短暂的（仅几小时）,除非持久地 p53-dependent 机制 延长 G1 arrest。,CDC：cell division cycle,G1 Checkpoint Pathway-,ATM-CHK2-CDC25A-CDK2 axis forms a rapid response system;,ATR-CHK1-CDC25A-CDK2;,CDC25A-CDK4;,ATM-CHK2/ATR-CHK1-P53-p21 pathway,(Oncogene,22:5834,2003),3.2.,S-phase checkpoint 通路,至少有两条通路减慢DNA合成，二者均被 ATM/ATR 通路控制。,1）,CDC25A-degradation cascade,(described previously).位于其下游的CDK2 activity 的抑制阻断 CDC45 在 chromatin Loading。CDC45 是,DNA pol 被招募到预复制复合物必须的，因此CDK2活性的抑制防止新的DNA合成起始。,2）ATM介导的NBS1磷酸化，尤其,cohesin protein SMC1 Ser343，957，966 的磷酸化对DNA修复意义重大。NBS1 及SMC1缺陷细胞对辐射的敏感性 与ATM不能磷酸化SMC1效应蛋白有关。,S Checkpoint Pathway-,ATM-CHK2-CDC25A-CDC45 axis forms a rapid response system,BRCA1 as a ATM target,Mre11-NBS1-RAD50 complex is required for radioresistant DNA synthesis(RDS),MDC1,a newly discovered BRCT-repeat protein as a mediator to recruit repair proteins(Nature 421:952;961 2003),SMC(Genes Dev 16:560,2002),E2F,3.3.,G2 checkpoint,G2 checkpoint(also,G2/M checkpoint,)防止细胞在有DNA损伤的情况下进入有丝分裂期。G2 checkpoint 的重要目标是,cyclin B/CDK1 kinase,的有丝分裂促进活性，,在,stresses后,cyclin B/CDK1 kinase,被,ATM/ATR-,CHK1/CHK2 通路控制,。,CDC25 激活CDK1，,CHK1/CHK2,和/或,p38-kinase,介导,CDC25 磷酸酶家族,的亚细胞隔离，降解及抑制。另外,CDC25C,和/或,cyclin B/CDK1上游调控物,如,Polo-like kinases,PLK3 与PLK1似可被DNA损伤诱导的机制调节。与在S phase checkpoint所起作用类似，,53BP1 及BRCA1,也可调节G2-checkpoint responses。,G2 checkpoint维持期可能也部分依赖于BRCA1 及 p53,调节的转录，导致细胞周期抑制蛋白如,p21，GADD45a,(growth arrest and DNA-damage inducible 45 alpha)及,1433 sigma 蛋白,的上调。即使缺陷的（如p53 突变）肿瘤细胞也趋向于在DNA损伤后选择性的积累于G2期，提示p53-independent mechanisms 对G2抑制（Arrest）是足够的。同时，这一现象鼓舞大家把干扰 G2 checkpoint 作为有力的致敏癌细胞对放疗及药物诱导的DNA损伤的手段。,G2(G2/M)Checkpoint Pathway-,A key effector of G2 checkpoint is CDC2(CDK1):,ATM-CHK2-CDC25C-CDC2 axis,ATR-CHK1-CDC25C-CDC2 axis,ATR-CHK1-CDC25A-CDC2 axis,Weel-CDC2 inhibition,PLK1(-)and PLK3(+)(polo-like kinase family)play a crucial roles in initiation and exit from mitosis,P21-PCNA-CDC2-Cyclin B complex excludes CDC25C(-),DNA 损伤信号传导简图,DNA损伤,ATM/ATR,p53 ChK1,p21 Cdc25,G1/S arrest G2/M arrest,REF,1 Michael B.Kastan1&Jiri Bartek.Cell-cycle checkpoints and cancer.Nature,2004,432:316-323,2 Oncogene,2003,22:5834,p53-Deficient Cells Rely on ATM-and ATR-Mediated Check-point Signaling through the p38MAPK/MK2 Pathway for Survival after DNA Damage.Reinhardt,et al;,Cancer Cell.2007 Feb;11(2):175-89.,Example,DNA 损伤时，,p53-Deficient 细胞的存活依赖于ATM/ATR-,p38MAPK/MK2,通路介导的Checkpoint信号。,Backgroud,真核细胞在,DNA,损伤时，一套复杂的信号网络被激活，,抑制细胞周期进程，有利,DNA,修复。,ATM-ChK2,ATR-ChK1,是两个主要信号通路。,3.,正常细胞，,p53-p21,通路是,DNA,损伤时控制,G1 Check-,point,的主要通路。,肿瘤细胞,p53-p21,常缺陷，导致,G1 Checkpoint,缺陷。因此，,肿瘤细胞面对,DNA,损伤时完全靠,S,及,G2/M,Chechpoint,维持,基因组完整性。,5.,最近有报道应激激活的蛋白激酶,p38MAPK,对转化的,MEFs,及,Hela,细胞在,UV,辐射下的,G2/M,Chechpoint,控制很重要。作者,实验室最近发现,MK2,是,p38MAPK,的重要下游效应激酶并证实,该通路对,UV,诱导的细胞周期,Checkpoint,是必要的。,待解决问题：,P38-MK2,通路对,DNA,损伤（除,UV,外）的细胞反应有无调节？,如何调节？,Abstract,In response to DNA damage,eukaryotic cells activate ATM-Chk2 and/or ATR-Chk1 to arrest the cell cycle and initiate DNA repair.We show that,in the absence of p53,cells depend on a third cell-cycle checkpoint pathway involving p38MAPK/MK2 for cell-cycle arrest and survival after DNA damage.MK2 depletion in p53-deficient cells,but not in p53 wild-type cells,caused abrogation of the Cdc25A-mediated S phase checkpoint after cisplatin exposure and loss of the Cdc25B-mediated G2/M checkpoint following doxorubicin treatment,resulting in mitotic catastrophe and pronounced regression of murine tumors in vivo.We show that the Chk1 inhibitor UCN-01 also potently inhibits MK2,suggesting that its clinical efficacy results from the simultaneous disruption of two critical checkpoint pathways in p53-defective cells.,A-D,DNA损伤诱导,MK2及p38活化。,E.MK2 诱导是p38 依赖的。,F.免疫组化，gama-H2AX,DNA 损伤Marker,G.Cisplatin，Camp诱导的MK2为ATR依赖,Doxorubsin 诱导的MK2为ATR/ATM依赖,UV诱导ATR/ATM不依赖的MK2激活,DNA损伤毒物激活P,38-MK2 通路,基因毒素诱导的DNA损伤时，,DNA损伤毒物激活P,38-MK2 通路。,ATM-/-ATR-/-,Figure1.The p38MAPK/MK2 Pathway Is Activated by DNA-Damaging Drugs,(AD)Kinetics of p38MAPK and MK2 activation.U2OS cells were treated with 10 M cisplatin(A),10 M camptothecin(B),10 M doxorubicin(C),orDMSO control(D)for the indicated times.Cell lysates were probed for total and phosphorylated/activated forms of p38MAPK and MK2(MK-2)byWestern blotting.-actin served as a loading control.,(E)MK2 activation is p38MAPK dependent.U2OS cells were treated with the p38MAPK-specific inhibitor SB203580(10 M)or DMSO vehicle for 30min prior to exposure to chemotherapeutic drugs as in(A)(D).Total and phosphorylated/activated p38 and MK2 were determined by immunoblotting as above.,(F)Activation of MK2 parallels the formation of H2AX nuclear foci.U2OS cells were either mock treated or incubated with cisplatin(10 M),camptothecin(10 M),or doxorubicin(10 M).Cells were immunostained 1 and 4 hr later using an antibody against-H2AX and counterstained with DAPI.Scale bar,2 m.,(G)Summary of the requirement for ATM and/or ATR for the activation of MK2.,ATM-p53-p21通路是正常细胞DNA损伤时,控制G1 Checkpoint的主要机制。P38-MK2,是否也通过此通路起作用哪？,P21 诱导是MK2不依赖的，因为MK2Knock-,down后p21仍可被诱导。,所以，P38-MK2并非通过p53-p21起作用。,B）MK2诱导对抑制Cisplatin,诱导的细胞凋亡是必须的,C）MK2诱导对抑制Doxo,诱导的细胞凋亡是必须的,结论：P53-缺陷细胞，MK2 是细胞受DNA损伤刺激后细胞存活,必须的。MK2 并非通过p53-p21起作用。,Figure2.,p53,-Deficient MEFs Require MK2 for Survival after DNA Damage,(A)p21 induction is independent of MK2 activation.,p53WT/WT,and,p53/,MEFs stably expressing luciferase shRNA or MK2 shRNA were treated with 10 M cisplatin or 10 M doxorubicin.MK2 activation and components of the p53 pathway were monitored by SDS-PAGE and Western blot analysis.,(B and C)Clonogenic survival assay.,p53WT/WT,and,p53/,MEFs stably expressing luciferase shRNA or MK2 shRNA were mock treated or treated with increasing doses of cisplatin(B)or doxorubicin(C)for 4 hr,washed in PBS,trypsinized,and replated at 5000 cells/10 cm dish.Fourteen days later,surviving colonies were fixed,stained with crystal violet,and counted.Assays were performed in triplicate for each condition and normalized to mock-treated cells.Mean values with error bars denoting standard error of the mean are shown.Asterisks denote statistically significant differences(two-tailed Students t test,p 0.04).,MK2 knock-down 通过诱导灾难性有丝分裂信号事件使,p53,-Deficient MEFs（非野生型）对Cisplatin 及Doxorubicin 的抗增殖作用更敏感。,P53-deficient cells 受D,NA损伤物刺激后，其存活有赖于MK2。机理？作者设想,可能是MK2抑制灾难性有丝分裂(mitotic catastrophe，指细胞不顾其DNA处于损,伤状态而进入有丝分裂，导致细胞凋亡信号被诱导)，MK2Knock-down后诱导,灾难性有丝分裂。本图实验即为证实此假设。pHH3 为有丝分裂Marker，gama-,H2AX为DNA损伤marker,Caspase-3 为细胞凋亡marker。,Figure3.Depletion of MK2 Sensitizes,p53,-Deficient MEFs to the Antiproliferative Effects of Cisplatin and Doxorubicin by Inducing Mitotic Catastrophe,p53WT/WT,and,p53/,MEFs stably expressing RNAi hairpins against luciferase(A and C)or MK2(B and D)were treated with low-dose cisplatin(1.0M)or doxorubicin(0.1 M)for 30 hr,fixed and stained with antibodies against phospho-histone H3,-H2AX,and cleaved caspase-3.Positive staining for-H2AX in combination with phospho-histone H3 and cleaved caspase-3 labeling is indicative of mitotic catastrophe and was only observed in MK2-depleted,p53/,cells(D,arrows).The arrowhead in that panel shows a-H2AX-positive cell that does not stain for either phospho-histone H3 or cleaved caspase-3.Scale bar,5 m.,P38-MK2对实体肿瘤面对DNA损伤时的存活一样重要,A Ras转化的p53-deficient MEFs 细胞MK2 Knockdown。,B 转化细胞注入裸鼠皮下，每两天测一次肿瘤直径大小，12天时腹腔注DNA损伤物，,继续测肿瘤直径，结果作成曲线。,C MK2Knockdown使肿瘤对DNA损伤物Cisplatin及Doxorubicin更敏感。,D Panel B及C 的结果为肿瘤重量测定结果进一步证实。,结论：,MK2 knock-down 促进肿瘤细胞有丝分裂并使肿瘤细胞对Cis及Doxo诱导的凋亡更敏感。,Figure4.MK2 Depletion Enhances Regression of Established Tumors after DNA-Damaging Chemotherapy in a Murine Model,(A),H-Ras-V12,-transformed,p53/,MEFs(,Ferbeyre etal.,2002,)were infected with lentiviruses encoding U6 promoter-driven luciferase shRNA or MK2 shRNA,and CMV promoter-driven GFP.Three days postinfection,GFP-expressing cells were selected by FACS and cultured for an additional 3 days.Efficiency of MK2 knockdown in the entire GFP-positive population was then assessed by immunoblotting of total cell lysates.,(B)Following subcutaneous injection of 106 shRNA-containing cells into the flanks of NCR nude outbred mice,tumor growth was measured every 2 days,starting at day 6 postinjection.Arrow indicates the start of intraperitoneal administration of DMSO,2 mg/kg cisplatin,or 4 mg/kg doxorubicin on day 12,given three times/week.Mean tumor sizes with error bars denoting standard deviation are shown.In the abs