基因工程第二章基因工程的基本操作程序优品文档.ppt

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能使目的基因断开，大小不可控,部分酶切：,片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整,与载体连接,如果采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择,多拷贝克隆载体,；,如果采用基因产物功能检测法筛选，则,选择表达型载体,如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择,大肠杆菌作为受体细胞,；,如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则,选择能使目的基因表达的受体细胞,转化受体细胞,筛选含有目的基因的目的重组子,菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）,鸟枪法操作的改进（一）,使用这一改进方法的,前提条件,是：目的基因的酶切图谱已知。,如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体,DNA,，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率,使用特征性限制性内切酶切开染色体,DNA,鸟枪法操作的改进（二）,例如，已知某目的基因位于,1.8 kb,的,SalI,片段中，将染色体,DNA,用,SalI,切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于,1.6-2.0 kb,大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收,DNA,片段，然后与载体进行拼接,2.0 kb,1.6 kb,1.8 kb,在连接前将,DNA,片段进行分级分离,鸟枪法操作的改进,凝胶,DNA,片段回收技术,冻融法,滤纸法,吸附法,低融点凝胶法,溶解法,鸟枪法克隆目的基因的局限性,工作量较大，需要了解目的基因的背景知识,不能获得最小长度的目的基因,不能除去真核生物目的基因的内含子结构,B cDNA,法,cDNA,法克隆目的基因的基本方法,cDNA,法分离目的基因的基本程序,cDNA,法法克隆目的基因的局限性,在核糖体合成多肽的旺盛时期，首先把含有目的基因的,mRNA,的多聚核糖体提取出来，分离出,mRNA,，然后以,mRNA,为模板，用反转录酶合成一个互补的,DNA,，即,cDNA,单链，再以此单链为模板合成出互补链，就成为双链,DNA,分子。,提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子,融合蛋白形成包涵体，复性后才有活性,真核表达系统:酵母,昆虫细胞,哺乳类动物细胞,植物细胞两大类,TTP：从头合成（氨甲喋呤阻断），补救合成,（1）cDNA第一链的合成,鸟枪法克隆目的基因的基本战略,TTTTTTTTTTTTTT 3,融合蛋白（fusion protein,包涵体）,筛选含目的基因的重组子,鸟枪法克隆目的基因的基本战略,3 HOCCCCCCC,1 如何获得目的基因片段？,提取细胞总,mRNA,，,合成总,cDNA,cDNA,法克隆目的基因的基本方法,mDNA,（,1,）,c,DNA,第一链的合成,5ppp5,G,G,AAAAAAAAAAAAAA,OH,3,5ppp5,G,G,AAAAAAAAAAAAAA,OH,3,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,5ppp5,G,G,AAAAAAAAAAAAAA,OH,3,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,cDNA,第一链,引物,退火,逆转录酶,dNTPs,（,2,）,c,DNA,第二链的合成,自身引导法,置换合成法,引导合成法,c,DNA,第二链的合成,煮沸,NaOH,AAAAAAAAAAAAAA,5ppp5,G,G,AAAAAAAAAAAAAA,OH,3,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,AAAAAAAAAAAAAA,OH,3,TTTTTTTTTTTTTT,OH,3,Klenow,dNTPs,S1,自身引导法：获得的双链,cDNA 5,端会有几对碱基缺失,c,DNA,第二链的合成,DNApol dNTPs,RNaesH,5ppp5,G,G,AAAAAAAAAAAAAA,OH,3,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,AAAAAAAAAAAAAA,p,5,5,S1,AAAA,TTT,OH,3,TTTTTTTTTTTTTT,p,5,5,TTTTTTTTTTTTTT,OH,3,AAAAAAAAAAAAAA,5,5,TTTTTTTTTTTTTT,3,3,T4-DNA ligase,置换合成法：获得的双链,cDNA 5,端也会有几对碱基缺失,c,DNA,第二链的合成,dCTP,TdT,5ppp,5,G,G,AAAAA,OH,3,TTTTT,p,5,3,HO,5ppp5,G,G,AAAAA,CCCCCCC,OH,3,3,HO,CCCCCCC,TTTTT,p,5,3,HO,CCCCCCC,TTTTT,p,5,3,HO,CCCCCCC,TTTTT,p,5,5,p,GGGGGGG,3,HO,CCCCCCC,TTTTT,p,5,5,p,GGGGGGG,AAAAA,OH,3,NaOH,退火,Klenow,dNTPs,引导合成法：获得的双链,cDNA,能保留完整的,5,端序列,cDNA,法克隆目的基因的基本方法,双链,c,DNA,的克隆,双链平头的,cDNA,通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：,平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收,平头两端分别接同聚物尾，最好是,AT,同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和,S1,核酸酶处理回收插入片段,加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收,cDNA,法分离目的基因的基本程序,完备分离程序,提取细胞总,mRNA,，合成总,cDNA,，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子,筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落原位杂交法筛选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选,完备分离程序适用于,mRNA,分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子,VIII,基因等,cDNA,法分离目的基因的基本程序,特异分离程序,提取细胞总,mRNA,，琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标,mRNA,，由此合成双链,cDNA,，然后进行克隆,特异分离程序较适用于,mRNA,丰度极高的目的基因克隆如血红蛋白基因等,cDNA,法分离目的基因的基本程序,差异分离程序,利用两组细胞,mRNA,种类的差异，分离克隆差异,mRNA,所对应的,cDNA,，因而这种程序较适用于分离克隆新基因,例如：正常的大鼠,FR3T3,成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能,差异分离程序,多瘤病毒感染的,FR3T3,细胞,正常的,FR3T3,细胞,总,mRNA,总,mRNA,cDNA,双链,cDNA,单链,cDNA,提取,mRNA,合成,cDNA,合成第二链,克隆,提取,mRNA,共价交联,上柱,原位杂交,病毒诱导表达的基因,cDNA,克隆,cDNA,法克隆目的基因的局限性,并非所有的,mRNA,分子都具有,polyA,结构,细菌或原核生物的,mRNA,半衰期很短,mRNA,在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，,分离纯化困难,仅限于克隆蛋白质编码基因,C PCR,法,PCR,(,Polymerase Chain Reaction,）法，又称为聚合酶,链反应或,PCR,扩增技术，是一种高效快速的体外,DNA,聚合程序,使用,PCR,法克隆目的基因的,前提条件,是：,已知待扩增目的基因或,DNA,片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物,PCR,法定向扩增目的基因的基本原理,5,5,目的基因,5,变性,加热,5,5,引物,退火,5,5,底物,聚合,5,5,5,5,加热,变性,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,退火 引物,底物,聚合,加热,变性,引物,退火,底物,聚合,1,2,3,由,Taq DNA,聚合酶扩增的,PCR,产物中，其,3,末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是,A,，因为,Taq DNA,聚合酶对,dATP,具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取,TdT,末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的,T,载体克隆,PCR,克隆目的基因的基本程序,5,5,A,A,T,T,5,5,PCR,扩增产物,T,载体,T7,lacZ,MCS,ori,Ap,r,D,化学合成法,化学合成法的基本方法,化学合成的单元操作,DNA,化学合成的用途,化学合成法的基本方法,全基因合成,化学合成目的基因的前提条件是基因的,DNA,序列已知，有三种战略：,（,1,）小片段粘接法：,根据目的基因全序列，分别合成,12-15,碱基长的单链,DNA,小片段,混合退火,T4-DNA,连接酶连接,克隆入合适的载体,化学合成法的基本方法,全基因合成,混合退火,（,2,）补钉延长法：,根据目的基因,两条互补链,全序列，分别合成,12-15,碱基长的单链,DNA,小片段以及,20-30,碱基长的单链,DNA,中片段,T4-DNA,连接酶连接,克隆入合适的载体,Klenow,酶聚合,化学合成法的基本方法,全基因合成,（,3,）大片段酶促法：,混合退火,根据目的基因,的,全序列，分别合成,40-50,碱基长的单链,DNA,片段,T4-DNA,连接酶连接,克隆入合适的载体,Klenow,酶聚合,化学合成法的基本方法,全基因合成,上述三种方法各有利弊：化学合成,DNA,的,单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为,95%,则合成,50,个碱基长的,DNA,单链大片段的总收率只有,7.7%,生物体对简并密码子的,偏爱性,，合成系列探针,探针应具有足够的长度，通常在,17-20,个核苷酸之间,探针内部不应出现可能的,互补区域,化学合成法的基本方法,探针等寡聚核苷酸合成,在某些情况下，往往,只知道目的基因编码产物的部分氨基酸序列，而基因序列未知,，,此时需要从已知的氨基酸序列推测为其,编码的,DNA,序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或,cDNA,法得到的重组子，最终获得含有目的基因的,目的重组子。,由于大多数氨基酸拥有,简并密码子,，,故在探针序列的设计时必须考虑下列问题,:,化学合成法的基本方法,探针等寡聚核苷酸合成,某段连续的氨基酸序列,Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile,所有可能的,DNA,序列,TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA,C T GATG G G T T,C,CGA,CGG,CGT,CGC,设计的简并探针序列,TGTATGGACGAIATGA,TGTATGGATGAIATGA,TGCATGGACGAIATGA,TGCATGGATGAIATGA,A,G,此外还可以参考各种生物体的,EST,数据库进行倾向性简并序列设计,expressed sequence tag,化学合成的单元操作,化学合成,DNA,的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：,基团保护、分离、缩合、分离、去保护,五大操作单元。,从反应机理上来讲，,DNA,化学合成有,磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法,；,具体操作过程又有,液相合成和固相合成,两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，,DNA,合成仪就是根据,固相亚磷酸液三酯法,原理设计的,化学合成的单元操作,O,H,G,H,H,H,H,O,CH,2,O,DMT,P,O,Me,N,CH,Me,Me,CH,Me,Me,H,DMT,：二甲氧基三苯甲基,激活,缩合,氧化,脱取代基,玻璃珠,连接臂,DNA,化学合成的用途,合成天然基因,修饰改造基因,设计新型基因,制备探针、引物、接头,如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等,如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等,二,DNA,片段与载体,DNA,体外重组,外原基因（,DNA,片段）,很难,直接透过受体细胞的细胞膜进入受体细胞，即使进入，也会受到限制性内切酶的作用而分解。,要将外源基因导入受体细胞，必须,选择适当的载体,。,作为载体的,DNA,分子所,具备的条件：,1,、容易进入寄主细胞,2,、进入寄主细胞后能够独立进行自主的复制和表达。,3,、容易从宿主细胞中分离纯化,常用的载体：,质粒、噬菌体、病毒和粘粒,载体是外源基因进入受体细胞的工具。,DNA,重组技术,核心步骤：,DNA,片段的体外连接,本质：,涉及限制酶，连接酶等酶促反应过程,载体：,质粒和温和噬菌体,需两大酶：,DNA,限制性内切酶和,DNA,连接酶,此外：,DNA,聚合酶、逆转录酶、,DNA,修饰酶、,RNA,修饰酶、核酸外切酶、碱性磷酸酶等,TTTTTTTTTTTTTTp 5,4、mRNA差异显示法获得目的基因,融合蛋白形成包涵体，复性后才有活性,1 如何获得目的基因片段？,CGG,如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等,neo：磷酸转移酶，使G418失活,expressed sequence tag,筛选含有目的基因的目的重组子,缺乏转录后加工机制，只能表达cDNA,3 HOCCCCCCC,由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时必须考虑下列问题:,A,（3）大片段酶促法：,提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子,提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子,原核表达系统:大肠杆菌,目的,DNA,片段被限制性内切酶消化后其末端可能有,3,种形式：,带有相同的粘性末端,带有互补的粘性末端,带有平末端,(1),粘性末端的连接,(2),平末端的连接,三,DNA,重组体转入受体细胞,1,受体细胞,(,特点,),(1),转化率高,(2),保持质粒稳定,(3),营养缺陷型,(4),其他标记,不同的实验目的，使用不同的载体和受体细胞。,2,DNA,重组体进入受体细胞,人为地诱导大肠杆菌这样的受体细胞进入感受态，主要采用两种途径,(1),化学处理,(2),电击法,四、目的基因的筛选和鉴定,遗传学方法,插入灭活法,(insertion inactivation):,抗药性标志选择,标志补救 表达产物与营养缺陷互补,-,互补 蓝白斑筛选,免疫学方法,分子杂交,探针,原位杂交,PCR,限制性酶切图谱,IPTG;X-gal(5-,溴,-4-,氯,-3-,吲哚,-D-,半乳糖苷,),bp,1534,994,695,515,377,237,A B C M,表达系统,:,表达外源基因的宿主细胞,原核表达系统,:,大肠杆菌,真核表达系统,:,酵母,昆虫细胞,哺乳类动物细胞,植物细胞两大类,五、克隆基因的表达,载体有转录、翻译的元件；密码子通用,原核生物基因结构,真核生物基因结构,五、克隆基因的表达,原核表达体系,原核表达载体的标准,合适的筛选标志,强启动子,翻译控制序列,多克隆位点,启动子序列,融合蛋白（,fusion protein,包涵体）,表达的蛋白质或多肽的,N,末端由原核,DNA,编码，,C,末断由克隆的真核,DNA,编目。,大肠杆菌表达体系的不足,缺乏转录后加工机制，只能表达,cDNA,缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化,融合蛋白形成包涵体，复性后才有活性,很难表达大量的可溶性蛋白,真核表达体系,转染方法,磷酸钙沉淀,DEAE,葡聚糖介导转染,电穿孔,脂质体转染；人造膜,显微注射,筛选标志,tk,-(,胸苷激酶,)Neo,r,G418,瞬时转染 目的基因不整合进宿主基因组,稳定转染 目的基因整合进宿主基因组,tk,-,细胞突变株筛选转染细胞,胸苷激酶（,tk,）,TTP,：从头合成（氨甲喋呤阻断），补救合成,HAT,选择（,H,：次黄嘌呤；,A,：氨甲喋呤；,T,：胸苷）,tk,+,：生长,tk,-,+,带,tk,基因的质粒：生长,药物筛选转染细胞,neo,r,新霉素：细菌抗生素，干扰原核生物蛋白质合成,G418,：干扰原核、真核生物,neo,：磷酸转移酶，使,G418,失活,neo,与目的基因连锁,转染,作业：,1,如何获得目的基因片段？,2,简述基因工程的基本操作程序,3.,与原核细胞表达系统相比较,真核细胞表达系统的特点是什么,?,感谢观看,