20章基因工程.pptx

,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,第二十章,基因工程,第一节 自然界的基因重组,一、转化作用,二、转导作用,三、转位（转座）,一、Transformation转化作用,Insertion,Crossing,over,二、Transduction转导作用,转导Transduction:,由病毒介导的DNA由一个细胞向另一个细胞转移的现象。随后DNA会整合到受体细胞的基因组中。,三、基因重排,将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从而启动转录，这种方式被称为,基因重排,。,通过基因重排调节基因活性的典型例子是,免疫球蛋白,结构基因和T细胞受体基因的表达。,在所有物种中，胚系,Ig,基因的构成基本上相同。,Ig,重链和轻链,(,和,链,),基因座都由多个编码,V,区(可变区）和,C,区（恒定区）蛋白质的基因组成，并被非编码的,DNA,（连接区，J区）所分隔。,V、C、J区在胚胎期细胞中相距较远，细胞发育分化时，免疫球蛋白重链基因,DNA,重排，大量间隔序列被切除，使位于,J-C,之间的增强子序列得以发挥作用，增强基因转录。,四、（转位）转座,能将自身插入基因组新位置的DNA序列。,1 转座子的定义,（1）含短的末端反向重复序列;,（2）含编码转座酶的基因;,（3）靶位点存在 5-9 bp 的短正向重复序列。,第二节 基因克隆的工具酶,识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，与相伴的甲基化酶共同构成细菌防御机制限制修饰体系（限制外源DNA，保护自身DNA）,Hin,d,流感噬血杆菌种属 d 株 第三种内切酶,限制性核酸内切酶命名：属名、种名、株名,限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）,切割DNA后有,粘端与平端,之分或产生,平末端,识别位点常为4-6个碱基对、具有回文结构的DNA片段,AAT,GAATTC,GTACCG,TTA,CTTAAG,CATGGC,限制性核酸内切酶,5-N,GAATTC,N-3,3-N,CTTAAG,N-5,5-NG,AATT,CN-3,3-NC,TTAA,GN-5,粘末端,(,Cohensive end or sticky end）,5,突出端,EcoR1,5-N,CAG,CTG,N-3,3-N,GTC,GAC,N-5,5-N,CAG,CTG,N-3,3-N,GTC,GAC,N-5,平末端,Pvu 2,（blunt end）,错位切割,垂直切割,限制性核酸内切酶的切割频率,DNA分子中核苷酸序列是随机排列的，一个识别四个核苷酸序列的内切酶平均每隔256bp（4,4,）出现一次该酶的识别切割位点。,那么，识别6或8核苷酸序列的内切酶的切割频率是,多少？,基因工程其他常用的工具酶,酶的种类,功 能,DNA连接酶,催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接,DNA聚合酶 I,合成双链cDNA的第二条键,缺口平移制作高比活探针,DNA序列分析,填补3末端,反转录酶,以RNA为模板合成cDNA第一链,多聚核苷酸激酶,催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针,末端转移酶,在3羟基末端进行同质多聚物加尾,切除末端磷酸基团,碱性磷酸酶,Taq DNA聚合酶,PCR扩增,第三节 基因克隆的载体,载体（vector）是由在细胞中能够自主复制的分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它片段(外源基因)连接在它的上面，进行扩增或表达。,理想载体应具备的几个条件,能在宿主细胞内携带目的基因复制扩增，具有较高拷贝数。,有多个限制性内切酶单一位点，便于外源基因的插入。,有易检测的遗传筛选标记，如抗生素抗性基因，用于阳性克隆的筛选。,分子量小，允许插入外源基因的容量较大。,载体分类（按功能分）,克隆载体：用于外源DNA的克隆和扩增。,表达载体：用于外源基因的表达（转录翻译生成蛋白质）,一、克隆载体,质粒载体,噬菌体载体,病毒载体,（一）质粒（plasmid）载体,质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，一般大小约10,6,10,8,D，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。,作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。,质粒（plasmid）,是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA,分子。大小约为,数千碱基对。常,有1 3个抗药,性基因，以利于,筛选。,质粒载体,克隆的质粒载体,允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA水平上的操作。,基因表达的质粒载体,允许外源DNA的插入、储存和表达。,质粒的生物学特性：,1、,质粒DNA的构型：,SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA）,OC型 开环DNA（ocDNA）,L 型 线性DNA（cDNA）,2、不同质粒的分子量大小差异相当显著：,10,6,10,8,D,3、作为载体的质粒都含有三种共同的组分：,复制基因（replicator）、选择性记号、克隆位点,L,OC,SC,质粒DNA的复制类型：,低拷贝的质粒（1十几个）：严紧型复制控制的质粒,高拷贝的质粒（几十几百个）：松弛型复制控制的质粒,重要的大肠杆菌质粒载体,1、pBR322质粒载体；,2、pUC质粒载体；,以Amp,r,和Tet,r,为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。,（4363bp）,ori,pBR322的结构来源,pBR322质粒载体的特点：,1、具有较小的分子量；,它的分子量为4363bp。克隆载体的分子量大小不要超过10kb。,2、,具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。,pBR322 DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位点插入外源片断可以导致,tet,r,基因的失活；另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点，,Example:,a.在pBR322质粒的BamH,或Sal,位点插入外源DNA片断，切断了,tet,r,基因编码序列的连续性，使之失去活性，产生出Amp,r,Tet,s,表型的重组,pBR322,质粒，转化入Amp,s,Tet,s,的大肠杆菌细胞。先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出具Amp,r,菌落，再将它们涂布于含四环素的选择性培养基上。插入外源片断的重组质粒不能在这种培养基上生长。,b.在Pst,或,Sca,识别位点插入外源片断会导致Amp,r,基因的失活，产生Amp,s,Tet,r,表型的质粒。转化大肠杆菌之后，获得的重组子可以比较快的检测出来。其依据是Amp,r,表型的细胞可以合成 内酰胺酶，它能使青霉素转变成青霉酮酸，而这种青霉酮酸能与碘结合。在含有可溶性淀粉和四环素的富裕培养基上选择转化子，经37度培养过夜后，在此平板上加入少量的碘指示剂溶液产生青霉素 内酰胺酶Amp,r,的菌落，其周围的碘指示剂溶液变得明亮，而Amp,s,菌落无此反应。,3、具有较高的拷贝数，而且经过,氯霉素扩增,之后每个细胞中可积累10003000个拷贝。,pUC质粒载体,人们应用多克隆位点技术，在pBR322的基础上，组入了一个在其5-端带有一段多克隆位点的lacZ基因，而发展的具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。,一种典型的pUC系列的质粒载体，包括以下四个部分：,1、来自pBR322质粒的复制起点（ori）；2、氨苄青霉素抗性基因（amp,r,）,但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不在含有原来的核酸内切限制酶的但识别位点。3、大肠杆菌,-半乳糖基因（lacZ）的启动子及编码-肽链的DNA序列，此结构称之为lacZ基因；4、位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位点（MCS）区段。但它并不破坏该基因的功能。,Amp,r,ori,pUC18,(3 kb),MCS(Multiple cloning sites,多克隆位点）,Lac promoter,lacZ,MCS(Multiple cloning sites,多克隆位点）：,指人工合成的含有多种限制性内切酶单一识别切割位点的DNA序列。,乳糖操纵子结构与调控模式图,pUC质粒载体的优点,第一，具有较小的分子量和更高的拷贝数;仅保留了pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制起点；在操作过程中复制起点内部发生了自发突变造成了基因rop的缺失，它是控制质粒的特殊因子，从而使拷贝数增加，平均每个细胞500700个拷贝。,第二，适用于组织化学检测重组体；,具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的-肽链可参与-互补作用，用X-gal显色对重组子进行鉴定，而pBR322质粒的重组子要进行两步的选择。,第三，具有多克隆位点MCS区段,方便具有不同粘性末端的外源片断的插入。,穿梭质粒载体,（,shuttle plasmid vector,）,是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体。,早期发现的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体,大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体,大肠杆菌-牛乳头瘤病毒,迄今还没有发展出适用的大肠杆菌-植物细胞穿梭载体。,（二）噬菌体载体,（,Bacteriophage,，简称,phage,）,噬菌体的生命周期,噬菌体的,溶菌,生命周期,只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。,烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：,1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上。,2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞。,3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所。,4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质。,5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒。,6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来。,噬菌体的生命周期,噬菌体的,溶源,生命周期,是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体的DNA是整合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分。,现知道只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期,温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶,源生命周期。,溶源性细菌：具有一种完整的噬菌体基因组的细菌,溶源化：用温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶,源性细菌的过程,整合：噬菌体的DNA是被包容在寄主细胞染色体,DNA中,原噬菌体：在溶源细菌内存在的整合的或非整合的,噬菌体,超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一次感染并,使之溶源化的同种噬菌体再感染。,噬菌体载体,噬菌体,基因组长48.5 kb,基因组可为线状和环状两种形式(cos ends),溶菌阶段,溶源阶段,5-CGGGGCGGCGACCTCG-3,3-GCCCCGCCGCTGGAGC-5,剪切 连接,(包装过程)(侵染细菌细胞后),GGGCGGGCGACCTCG-3,5-CG +GC-5,3-GCCCCGCCGCTGGA,The phage,cos ends,环状,线状,A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2,cI,cro cII O P Q S R,att int xis gam red cIII N,COS,COS,头部基因 尾部基因 功能不明区,溶源化 重组 早期控制 阻遏 DNA合成 溶菌,生长非必须区段,cI,基因：溶源过程控制基因。,噬菌体的基因组结构,体外包装,噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将重组DNA导入,E.coli,细胞内。这是因为以,感染,方式导入细胞的频率可达10,6,10,8,/gDNA，,噬菌体的,包装限制,为野生噬菌体DNA（约48.5 kb）的,75%105%,。,由于,噬菌体包装时，当DNA的长度短于野生型的78%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降。因此只包装它的野生型DNA,（48.5KB）,的,75%105%,左右的，要求载体DNA和外源DNA长度之和在,3953kb,之间。,DNA,Protein coat,cos,cos,Nonessential,region,Long(left),arm,short(right),arm,Exogenous DNA,(20-23 kb),phage,12bp,噬菌体载体的主要类型,1.,插入式载体,一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的 派生载体。,2.替换型载体（取代型载体）,具有成对的克隆位点，在这 两个位点之间的,DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。,插入式载体：,cI基因插入失活,：如 gt10等载体，在cI基因上有,Eco,R I及,Hin,d III的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。,Lac Z基因插入失活,：如charon16A载体，在非必须区段引入lac Z基因，在lac Z基因上有,Eco,R I位点，插入失活后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。,cI,EcoR I,LA 32.7,RA10.6,gt 10,lac Z,LA 19.9,RA21.9,EcoR I,Charon 16A,替换型载体（取代型载体）,外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必需的片段(约20 kb),这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac 5作为选择标记，使用时用,Eco,R水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染,E.coli,使之在,E.coli,内繁殖，并裂解,E.coli,，形成空斑。,如 EMBL系列,Lac 5,EcoR I EcoR I,EcoR I BanH I Sal I Sal I BamH I EcoR I,MCS MCS,Charon 4A,EMBL3/4,Charon 40,替换型载体克隆外源DNA的步骤,1.应用适当的核酸内切酶消化载体，,除去可取代的DNA片段；,2.将上述所得的,DNA载体臂同外源,DNA片段的连接；,3.对重组体的DNA分子进行包装和增,殖，以得到有感染性的重组噬菌体,（左右臂连接）（三段自身连接）（插入片段）,根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选,（黏性质粒）柯斯质粒载体,柯斯质粒载体,cosmid载体,：也称粘粒、柯斯载体。,这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由,噬菌体的cos（co,hesive,s,ite,）末端,及,质粒,（plasmid）重组而成的载体。,cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。,设计构建的柯斯质粒一般长46kb。其上的cos位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。,柯斯质粒载体的特点,具有噬菌体的特性；,具有质粒载体的特性；,具有较高容量的克隆能力(40Kb)；,柯斯质粒pHC79系由质粒pBR322和噬菌体的cos位点的一段DNA构成全长4.3kb,单链DNA噬菌体载体,(M13),M13噬菌体载体,M13是一种含单链（+）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。这类载体主要用来获得大量的单链片段，这种单链片段在遗传学研究中主要用来测定序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。,RF DNA,M13载体,具有多克隆位点(MCS)，方便克隆。许多M13载体的多克隆位点与质粒载体pUC序列的多克隆位点是相同的，在克隆位点选择上更为方便。,可以定向地克隆DNA片段，克隆在M13 RF DNA分子上的双链DNA片段，到了子代噬菌体便成了单链的形式。所以如果要同时分离分子中的双链，则需要两种独立的克隆。,Blue-white selection,M13载体系列的优点,1.在这类载体的基因组中有一条饰变的-半乳糖苷酶基因片段，其中插入了一段具有密集的多克隆位点的序列；,2.M13载体系列是应用基因工程技术成对构建的，可有效地克隆双链DNA分子中的每一条链。,M13克隆载体分子结构图,噬菌粒载体,噬菌粒载体,由,质粒,载体和,单链噬菌体,载体结合而成的新型的载体系列。,它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在,辅助噬菌体,的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。,常用的噬菌粒载体pUC118和pUC119,1.具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNA，可克隆,10kb,的外源DNA片段，并易于进行分离与操作；,2.编码一个amp,r,基因作为选择记号，因此只有携带pUC118或pUC119噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才能够在含有氨苄青霉素的培养基中生长，便于转化子的选择；,3.拷贝数含量高，每个寄主可高达500个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体DNA；,4.存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；,5.由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5-端编码区，可按照IPTG组织化学显色反应试验，筛选重组子；,6.lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，这样插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达；,7.含有质粒的复制起点，在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链DNA分子,8.带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单DNA拷贝，并包装成噬菌体颗粒分泌到培养基中；,9.在pUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNA；,10.可以直接对克隆的DNA片断进行核苷酸的序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体的这一烦琐的亚克隆步骤。,pBluescript噬菌粒载体,基本结构：,1.在多克隆位点的两侧，有一对T3和T7噬菌体的启动子，可以定向指导外源基因的转录活动；,2.同时具有一个单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，在不同的情况下，可以采取不同的复制形式，分别合成单链或双链的DNA；,3.编码有一个氨苄青霉素抗性基因，供作转化子记号；,4.含有lacZ基因，可用Xgal-IPTG组织显色反应法筛选噬菌粒载体。,T7,T3,用于体外转录,（三）其他载体,酵母人工染色体载体,（yeast artificial chromosome,YAC）,细菌人工染色体,（bacterial artificial chromosome,BAC）,动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒）,人基因组十分庞大，约含310,9,bp，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）载体应运而生。YAC含有酵母染色体端粒（telesome）、着丝点(centromere)及复制起点等功能序列，可插入长度达200-500kb的外源DNA，导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要载体。,正常酵母人工染色体含有：,*四膜虫端粒（,tel),*酵母自主复制序列（ARS),*酵母着丝点(CEN),*酵母的选择标记(TRP1、URA1),YAC载体,质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒SV40（Simian Virus 40）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，使用这些病毒载体的目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表达或试验其功能、或作基因治疗等。,质粒*,受体细胞,结构,插入片断,举例,E.coli,环状,8*,p,UC18/19,T-载体pGEM-3z等,噬菌体,E.coli,线状,9-24kb,EMBL系列，,gt系列,丝状噬菌体及噬菌粒,E.coli,环状,10 kb,M13mp系列,粘粒载体,E.coli,环状,35-45kb,pJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCV,BAC(Bacterial Artificial Chro,mosome),E.coli,环状,300 kb,Pel oBAC系列,PAC(P1-derived Artificial chromosome),E.coli,环状,100-2000 kb,PCYPAC1,YAC(Yeast Artificial chromosome),酵母细胞,线性染色体,100-2000 kb,MAC(Mammalian Artificial Chromosome),哺乳类细胞,线性染色体,1000 kb,病毒载体,动物细胞,环状,SV40 载体，昆虫,杆状病毒载体,穿梭载体,动物细胞,和细菌,环状,pSVK3质粒，PBV,Ti质粒,载体的种类和特征,质粒,噬菌体,柯斯质粒,单链噬菌体,克隆DNA大片段,*,+,+,-,构建基因组文库,-,+,+,-,构建DNA文库,+,-,-,-,常规的亚克隆化,+,-,-,-,构建新型的DNA结构,+,-,-,-,序列分析,+,-,-,+,单链探针,+,*,-,-,+,外源基因在大肠杆菌中的表达,+,-,-,-,四种常用载体的比较,*外源DNA如超过10kb，则重组质粒的转化率和DNA得率都非常低,*已有个别材料可用于此目的,二表达载体,大肠杆菌（原核）表达载体,表达载体：按特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列，在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体。,表达载体除了具有克隆载体所具备的复制起始位点，抗性基因和多克隆位点外，还需具备转录和翻译所必需的元件。,如：,具有功能（强）启动子；,具有核糖体结合位点；,转录终止序列。,核糖体结合位点,启动子,转录终止子,复制,起点,P,L,启动子的表达载体,是一种最广泛使用大肠杆菌表达载体的启动子之一。,噬菌体的阻遏物操作系统,cI基因存在一个温度敏感突变等位基因。,42度时，阻遏蛋白失活；,28-30度时，,P,L,启动子完全被阻遏蛋白抑制。,通过改变温度来控制P,L,启动子的开闭,真核表达载体,真核表达载体的构建有：,原核生物的序列，来自质粒的复制起始序列、抗生素抗性标记基因。,真核生物表达调控的元件，包括启动子，增强子、转录终止和polyA加尾信号。,真核细胞的复制起始序列，可筛选标记基因等。,真核表达载体,主要包括质粒载体和病毒载体，使用的调控表达元件最初多来源于病毒,SV40病毒载体,逆转录病毒载体,腺病毒载体,腺相关病毒载体,第四节 基因克隆的一般过程,基因克隆的基本过程,1 载体的选择和制备,2 制备目的基因片段,3 目的基因和载体间的重组连接,4 重组DNA导入受体细胞,5重组子的筛选和鉴定,6 重组子的扩增或表达,一、目的基因的获取,1.用PCR技术获取基因,2.用RT-PCR（逆转录-PCR）获得基因,3.从基因组文库或cDNA文库中获取基因,4人工合成基因,是根据DNA半保留复制和DNA聚合酶的特性建立起来的体外复制扩增DNA片段的技术,1.用PCR技术获取基因,（,聚合酶链式反应,polymerase chain reaction）,Kary B.Mulis 1985年发明,获1993年诺贝尔化学奖,可将微量的目的DNA在体外扩增100万倍以上,PCR技术,2.用RT-PCR（逆转录-PCR）获得基因,以mRNA为模板，先进行逆转录得到cDNA（complementary DNA，cDNA），再进行的PCR反应,模板为mRNA,需逆转录酶,产物为cDNA,RT-PCR与PCR区别,3.从基因组文库或cDNA文库中获取基因,基因组文库,（genomic DNA library）,含有某种生物体全部基因片段的重组DNA克隆群体,cDNA文库（cDNA library）,含有某一组织细胞中的全部mRNA信息,基因文库,gene library,文库构建,提取染色体DNA,DNA片段,插入适当的克隆载体,转入受体菌扩增,基因组文库,基因组文库的构建,机械法或限制性内切酶切割,细胞总mRNA,反转录酶,cDNA,插入合适载体,转入受体菌,cDNA文库,cDNA文库的构建,基因文库构建示意图,4人工合成基因,已知目的基因的碱基序列可用DNA合成仪合成基因片段，然后用其他反应将基因片段连接起来,优点,可修饰基因,可在基因两端设计接头,可选择各种宿主生物偏爱的密码子,二、克隆载体的选择与制备,1.根据克隆片段的大小。,2.根据实验目的（表达或扩增）,等等,三、目的基因与克隆载体的连接,（一）粘性末端连接,1.利用相同的酶切位点单酶单切点,用同一种酶分别切割目的基因/载体，然后进行连接。,优点：,二者产生相同的粘性末端，彼此很易按碱基配对退火，在ligase作用下生成DNA分子重组体。,如：gene EcoR vector EcoR,问题与解决办法：,（1）自身环化,粘性末端自发形成双链，连接产物含大量的目的基因和载体自身环化的假重组体若转化则出现假阳性克隆。,解决办法是,用高浓度的DNA（目的基因：载体为3：1）和碱性磷酸酶（AP：BIP/CIP）处理载体，去除5P使之不能自身环化，缺口在宿主内可得到修复。,（2）不能定向克隆/插入,由于是单一位点，目的基因可以以不同方向插入载体。对于克隆扩增问题不大，因为克隆上去的基因再重组时又要切下来；对于表达载体目的基因必须按53方向克隆在启动子下游而不能反之。,2.利用相同的酶切位点双酶双切点（定向克隆）,优点（1）避免载体/目的基因的自身环化，提高连接效率；（2）可控制外源基因插入方向。,构建表达载体时最好使用双酶双切点，这样方式也称定向克隆。,如：目的基因和载体都有EcoR，Pst酶切位点，产生各自互补粘端，分别配对连接。,3.通过同聚物加尾连接,同聚物加尾是指用末端脱氧核苷酸转移酶将某种脱氧核苷酸加到目的基因的3末端的羟基上（poly dC)，又将与之互补的脱氧核苷酸（poly dG)加到载体3末端的羟基上，制造出粘性末端。,dC：dG同源多聚尾是连接DNA片段克隆cDNA的有效方法。,4.加人工接头连接,人工接头（linker，接头）,是指人工合成的，连接目的基因两端的含有某些限制酶位点的寡核苷酸片段，如含EcoR的linker与目的基因的连接图（p371）。,5.聚合酶链反应特异引物连接,利用PCR技术，将PCR引物的5端加上限制性内切酶的切点。,6.T载体（A/T克隆法）,在克隆PCR产物cDNA时可采用这一方法。,（1）cDNA末端添加AA 利用Taq pol延伸活性，以不依赖模板的方式在已完成延伸的,PCR产物的3端添加AA（利用DNA pol活性可成）,。,（2）末端为TT的线性化的T载体可用下述2种方法得到：,Mbc、Xcm或Hph酶切产生单个T突出末端；,将T加到酶切产生的平端的载体上；,T载体已商品化。,（二）平头末端的连接,平端的4个来源,载体,目的基因,连接或克隆策略,少数限制酶如Hae对称切产生平端,cDNA,目的基因载体平端平端连接,机械剪切DNA产生平端,cDNA,加人工接头连接（cDNA/vector）,逆转录生成cDNA是平端,cDNA,用衔接接头取代人工接头连接（cDNA/vector）,5端突出，用酶切平，或用酶填平3端；3端突出只能切平，不能填平产生平端,cDNA,cDNA,通过同聚尾连接(cDNA/vector),（一）序言,1.导入目的,（1）克隆扩增,rDNA导入宿主细胞，利用宿主的生理条件，克隆扩增，克隆片段随着载体（如质粒）一起扩增获得扩增DNA片段（如细菌分裂繁殖）。,（2）克隆表达,利用宿主的生理条件，生产基因工程产品或开展基因治疗。,受体细胞 接受rDNA分子的细胞称作受体细胞或宿主细胞。,（1）原核细胞 既可以复制扩增，也可以基因表达。,（2）真核细胞 一般只用作基因表达系统。,四、重组DNA（rDNA）导入受体细胞,2.受体细胞的基本条件,(1)易接纳rDNA分子；(2)对载体复制扩增无严格限制；(3)不降解，不修饰外源DNA分子。,3.转化和转染,（transformation/transfection）,rDNA导入原核细胞的过程称转化，导入真核称转染。,（二）rDNA导入大肠杆菌,1.氯化钙转化法,感受态细胞,2.电穿孔法,转化效率高于方法1,3.体外包装感染法,适用于,载体和柯斯质粒,（二）rDNA导入哺乳动物细胞,1.DNA-磷酸钙共沉淀,2.病毒感染法,3.显微注射法,4.脂质体介导法,五、转化菌的筛选,（一）噬菌感染E.coli可以溶菌生长，形成很亮的噬菌斑，,溶源生长多少也有溶菌，形成噬菌斑挑选噬菌斑即可分析鉴定转化子。,（二）质粒转化E.coli 可用含抗生素的平板筛选，挑选阳性克隆分析鉴定转化子（图8-3）。,六、DNA重组体的筛选,转化子不一定就是重组子。,转化菌中有一部分是重组子，质粒载体就是粘端基因的重组体，含有载体抗生素抗性基因，可在含抗生素平板上存活。,而酶切不完全或酶切后载体未与目的基因重组而自身环化导入host中去的另一部分就可能不是的，但因含抗生素抗性基因也可在抗生素平板上生长，所需要rDNA筛选。确定外源DNA片段是否插入并与载体连接。,五 重组体的筛选与鉴定,（一）遗传学方法,1.抗生素抗性筛选（插入失活）,此法适用于带有抗生素抗性标记基因的克隆载体，,将外源DNA插入到 其一抗生素基因序列内，该基因就失活，据此特性，设计一套药物平板，可筛选出重组子。,插入失活应用举例,1.PBR322 含Amp,r,和tet,r,后者含BamHI和SalI 2个单一限制酶切点，具有Amp,r,和tet,r,表型。（双抗）,2.在tet,r,任何一个酶切点插入外源基因片断，都会导致tet,r,失活。,3.将含有插入外源基因的 PBR322的细菌先涂布于含Amp的琼脂板上，存活者必定是转化子。（Amp,r,）,4.将存活菌复印在tet的琼脂板上，对照2个平板，凡在Amp平板上生长而在tet上不生长的菌落，必定是带有外源基因的重组子。,五 重组体的筛选与鉴定,（一）遗传学方法,2.遗传标记补救筛选,A,二氢叶酸还原酶（DHFR)标记基因,用于外源基因导入哺乳动物细胞后阳性克隆的筛选。,B.互补（蓝白菌落筛选或称,x,gal,筛选）,载体Puc系列（PUC18/19）,带有E.coli DNA的短区段，含：,(1)Lacz(N)即编码半糖苷酸N端的 146个AA信息也称,多肽；,(2)编码区插入一个MCS并不破坏阅读框，使少数几个AA插入到 该酶的 N端而不影响其功能；,(3)Plac可以启动Lacz的 转录，表达，但受阻pr.阻遏，IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）能够去阻遏。,JM103受体菌含lacz(c)可以编码半乳糖苷酶的 C端部分,互补 当载体转入JM103 lacz(n)与,lacz(c)互补，编码具有活性酶pr使底物X-gal生色（5溴4氯3吲哚半乳糖苷产生兰菌落）。,当MCS插入外源gene片断时，几乎无一例外产生无,互补能力的 氨基酸片段（插入酶失落）导致白菌落产生。,PUC,19,Plac,LacZ(N),MCS,JM 103,外源基因片段插入,白菌落,IPTG,lacz(c),X-gal,蓝菌落,-半乳糖苷酶,图-互补,C.噬菌斑筛选,噬菌体系列载体包装外源DNA后的重组分子的长度必需是其野生型长度的75%-105%时，方能形成有活性的噬菌体颗粒，在培养平板上出现清晰的噬菌斑。,不含外源DNA的单一载体DNA因其长度太小不能被包装成活的噬菌体颗粒，感染细菌后不形成噬菌斑。,（二）免疫学方法,western blotting，检测外源基因的表达产物。,（三）分子生物学方法,1.限制性内切酶酶切图谱分析,基本流程是:,挑选平板转化菌落小量培养快速提取质粒.,酶切rDNA和载体对照电泳分析即可判断所选菌落是否含有重组DNA分子.,EcoRI,PBR325-APOAI,PUC19-APOAI,加样孔,2.7kb,5.4kb,0.89kb,图 pUC19-APCAI和pBR325-APOAI质粒DNA及其EcoRI酶切产物的琼脂糖电泳图,PUC,19,2.核酸探针杂交检测法,3.聚合酶链反应（PCR),4.测序,第五节 克隆基因的表达,一、原核生物表达体系,（一）大肠杆菌表达体系,组成,1.目的基因：真核生物目的基因的cDNA(CDS)；,2.,载体,：大肠杆菌表达载体（包含三要素）,3.受体菌株：遗传改造的基因工程菌,（二）、提高外源基因表达水平的策略,1.促进蛋白质合成,选用强启动子。,调整SD序列和起始密码子之间的距离。,利用温度敏感或药物诱导启动子来协调宿主菌的生长周期和表达周期。,2.抑制蛋白降解,融合蛋白表达。,使用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌突变体。,3.维持和恢复蛋白质特异空间结构,控制目的蛋白占总细菌蛋白的量，防止形成包涵体。,大肠杆菌表达体系,优越性,：,1.对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解；,2.是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体；,3.许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达；,4.大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。,大肠杆菌中表达体系的不足,：,1.真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。,2.真核基因的转录信号同原核的不同。,细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。,3.真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基因mRNA稳定性。,4.许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰（正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中并不存在；,5.细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。,原核细胞表达载体,pBV220、pET等,多种载体有商品化供应,原核细胞RNA聚合酶可以识别的启动子,原核细胞转录终止子,原核细胞核糖体结合位点,其他调控序列,结构特点,克隆基因在原核生物中表达的必要条件是携带克隆基因的载体具备原核生物中所需要的以下表达调控序列:,表达质粒,载体pET的结构,适用于结构复杂的大分子蛋白，尤其那些空间结构和生物学活性依赖于糖基化或磷酸化等修饰的蛋白质。,常用的真核表达体系有酵母，昆虫和哺乳类动物细胞等。,二、真核生物表达体系,（一）真核表达载体,主要包括质粒载体和病毒载体，使用的调控表达元件最初多来源于病毒。,SV40病毒载体,逆转录病毒载体,腺病毒载体,腺相关病毒载体,真核细胞表达系统的优缺点,优点,重组质粒转染的细胞具有遗传的稳定性和可重复性。,可表达需要翻译后修饰的蛋白。,可表达基因组DNA，也可表达cDNA。,可表达分泌性蛋白。,蛋白产物对宿主细胞的影响不大，且自身也很少降解。,缺点,表达系统相对复杂,成本高,生长周期长,演讲完毕，谢谢观看！,