Liposome脂质体表征.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2016/6/7,#,脂质体及其在化妆品体系中的,表征,时,晓,芳,2016.6.8,背景介绍,脂质体,(liposomes,),：,将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊。也称类脂小球或液晶微囊,。,脂质体,的概念,磷脂,亲水的头部,磷酸骨架,水溶性分子（胆碱、,丝氨酸,、,季胺盐等,）,疏水的,尾部,胆固醇,脂质体,两条脂肪酸链,，（,10-24,个,C,原子，,0-6,个双键）,磷脂结构示意图,胆固醇的结构图,脂质体,的,组成,双,分子结构：,磷脂分子的亲水端,呈弯曲,的弧形，形似“手杖”，,与胆固醇,分子的,亲水基团,相,结合，,形成,“,U”,形结构。两个“,U”,形结构,相对排列,，则形成双分,子结构,卵磷脂与胆固醇在脂质体中的排列形式,胆固醇与磷脂的排列示意图,脂质体,的,结构,脂质体形成示意图,脂质体,的,形成,单室脂质体,小单,室,SUV,20-100nm,大单室,LUV 100-1000nm,多室脂质体,MLV,15m,洋葱,式、管状、球形、,椭球形,结构和粒径,脂质体,的分类,-,结构和粒径,多囊脂质体,MVV,15m,缓,释效应和储库效应,洋葱式,管状,球形、椭球形,多囊,Akbarzadeh et al.Nanoscale Research Letters.2013,8:102,脂质体材料,中性磷脂,负电荷磷脂,（酸性磷脂）,正电荷脂质,胆固醇（,Ch),大豆甾醇及其葡萄糖苷,磷脂酰胆碱,（,PC,）,磷脂酰乙醇胺（,PE,）,鞘磷脂（,SM,）,磷脂酸（,PA,）,磷脂酰甘油（,PG,）,磷脂酰肌醇,(PI),磷脂酰丝氨酸,(PS),硬脂酰胺（,SA,）,胆固醇衍生物,大豆甾醇葡萄糖苷,(SG,）,大豆甾醇,SS,脂质体,的,材料,不同材料，形成不同结构的脂质体,磷脂酰胆碱,(phosphatidyl,choline,PC,),脂质体,的材料,-,中性磷脂,(a),全饱和磷脂,（紧密排列）,(b),非饱和磷脂,（不能紧密列）,磷脂脂肪链的饱和度对磷脂膜排列的影响,天然的,PC,a,.,从蛋黄、大豆、牛心脏和脊髓提取,b.,每一种,PC,具有不同长度、不同饱和度,的脂肪链,植物性,PC,的脂肪链具有,高度不饱和性,动物性,PC,的脂肪链大部分是,饱和,的,合成的,PC,二棕榈酰胆碱（,DPPC),、,二硬脂酰胆碱,(DSPC),二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（,DMPC,),特性,：,头部,基团小；,非,饱和的,PE,容易形成非双层结构型,-,六角相,（制备特殊脂质体,）,六角相,磷脂酰乙醇胺（,PE,）,脂质体,的,材料,-,中性磷脂,磷脂酰乙醇胺,(phosphatid ethanolamine,PE,),特性,：,酰胺键和羟基基团之间形成氢键相互作用，因此，比,PC,具有更高秩序的胶相,。,SM,脂质体,的,材料,-,中性磷脂,鞘磷脂,（,sphingomyelin,SM,）,磷脂酸,(phosphatidic acid,PA,),磷脂酰肌醇,(,phosphatidyl inositol,PI,),磷脂酰丝氨酸,(,phosphatidyl,serine,PS),负电荷,磷脂（,酸性磷脂）,脂质体,的,材料,-,负电荷磷脂,电荷增加脂质体透皮吸收,磷脂酰胺,(,S,tear amide,SA,),胆固醇衍生物,CDBA,和,CTBBA,脂质体,的,材料,-,正电荷脂质,Liu XM,Yang B,etc.Biochim Biophys Acta,2005,1720(1-2),28-34.,Liu XM,Yang B,etc.Chem Mater,2005,17(11),2792-2795.,包,裹物质,脂溶性药物,定位于双分子层脂质膜间,两性化合物,定位于水相,与膜内部交界磷脂上,水溶性,药物,包裹,在水相,不能,包,裹物质,在水相和有机溶剂中都不溶的物质,在两种介质中溶解性都非常好的物质,脂质体,的包裹作用机理,单室脂质体,多室脂质体,脂质体与细胞的相互作用：吸附、脂交换、内吞、融合,脂质体,与细胞的相互作用,在,护肤品领域，一般是指用卵磷脂类形成双分子层微囊，把需要被皮肤吸收利用的原料包裹在,其中,；,将,对皮肤有养护作用的原料，用卵磷脂包裹后，有这样几个好处：,提高吸收效率,脂质体细胞,膜的磷脂双分子层的结构非常接近,，提高脂质体,的经皮吸收,效率。,对,被包裹物质提供,保护,脂质体,可以将油性原料分散在亲油层中，也可以将水性原料包裹在脂质体,球心。而,磷脂则可以将有效成分与空气隔离开，使有效成分更长久的保存，延长产品的保质期，也可以延长涂抹在皮肤上后,的有效时间。,降低,配方,难度,由于,卵磷脂,独特的亲油亲水性，脂质体可以随意分散在水中，不增加乳化工作。,脂质体作为化妆品载体的应用原理,亮剑之旅,拓展训练课程,磷脂药物,复合物,磷脂凝胶,脂质体,前体,化妆品领域衍生的脂质体类型,脂质体,形式,柔性,脂质体,角质,脂质体,醇质体,脂质体,变换形式,化妆品：脂质体,的透皮吸收,和缓释,作用是,重点，修复性，保护性，增效性,膏霜类,化妆品一般加多室或多囊脂质体,脂质体,的理化性质,相变温度,(phase transition temperature,Tc),脂质体,升高温度,至,一定温度,膜,的物理性质改变,膜的横切面增加、双分子层厚度减少,、膜流动性,增,加,脂质双分子层中酰基侧链排列改变,有序,排列变为无序排列,相变温度,Tc,脂质体,的理化性质,相变温度,T,c,Tc,以下时，为“胶晶态”（脂肪链全反式，排列紧密，刚性和厚度增加）,Tc,以上时，为“液晶态”（脂肪链伸缩、弯曲、外扭）,磷脂发生相变时，“胶晶态”,“,液晶态”“液态”共存，,出现相分离，使膜的流动性增加，易导致内容物泄漏。,相变温度与脂质体膜稳定性,脂质体,的理化性质,相变温度,T,c,脂质体应用的局限性,稳定性,形貌,粒度,Zeta,电位,包封率,磷脂含量,脂质体表征,电镜,法,常规电镜法,Fig 1,脂质体的,TEM,测试项目,样品制备,缺点局限性,常规,TEM,1.,样品一般需要使用磷钨酸染色（负染）,2.,将样品用稀释到合适的浓度，,1Wt%,左右,3.,用毛细管滴到铜网上，晾干或烘干,1.,脂质体干燥过程中会发生结构变化。,2.,对小颗粒分辨率不高。,100nm,左右,。,常规,SEM,1.,将含有脂质体的样品滴在干净的硅片上面,2.,晾干或者烘干,3.,对其进行喷金处理（增强样品的导电性）,1.,只能看表面结构，不能区分脂质体和其它纳米颗粒,2.,脂质体不导电，需要喷金处理。,AFM,1.,把样品稀释为浓度,1Wt%,左右,2.,样品滴在云母片上,3.,放置待溶剂挥发干后进行测试,只能看表面结构，,X,Y,轴不灵敏，分辨率低,探针难控制,Fig 1,脂质体的,TEM,Fig 3,脂质体的,AFM,Fig 2,脂质体的,S,EM,常规电镜法缺点：,1.,样品干燥后失去原貌,2.,分辨率不高，不能区分脂质体和其他纳米颗粒,。,Aline F,Xavier,Daiana K Deda2,et al.IJABPT,2016,7(2),303-313,Ruan L P,Zhang H Y,Luo H L,et al.Science in China Series B:Chemistry,2009,方案一：冷冻,制样,及,扫描,电镜,传输系统,(Cryo-SEM),低温扫描电镜样品制备及观测过程,样品独立制备,与,分析,：镀,膜仪真空镀膜后保持真空状态转移到,SEM,，在制备与分析,之间无,污染样品,转移。,保留样品原貌,分辨率较高,优势,缺点：只能,观测表面结构,Cryo-TEM,方案二：冷冻,制样,及,透射,电镜,传输系统,(,Cryo-TEM,),低温,透射,电镜,样品制备及观测过程,高压冷冻仪可,与超薄切片机,及冷冻样品杆配合,，进行,低温,透射电镜观测,测试,方法：,将蘸在铜网上的样品溶液或分散液的液膜,急速冷冻，即在铜网上形成玻璃态水膜，,无冰晶产生。,在样品传输、进样、,TEM,观察的过程中始终,保持低温。,对于囊泡类样品的观察，通常,使用,这种方法。,保留样品原貌,分辨率较高,优势,可观测不同类型的,脂质体内部结构,+,方案二：冷冻,制样,及,透射,电镜,传输系统,(,Cryo-TEM,),外部资源：,中国科学院上海生命科学研究院,中国科学院上海巴斯德研究所,同济大学,Sugikawa K et al.Angewandte Chemie International Edition,2016.,Jonas Gustafsson et al.Biochimica et Biophysica Acta 1995,方案三：类细胞切片制样,+,常规电镜技术,SEM&TEM,类冷冻切片制样法：,类似冷冻切片与细胞切片制备的方法，对化妆品样品进行固定包埋（石蜡包埋），,然后进行切片，然后将其放在铜网或硅片上进行制样，对,脂质体成像。,分辨率能达到纳米级别,细胞切片法常常用来区分亚细胞结构,样品制备简单，成本低，资源广,脂质体的形貌大小的表征,独创的方法,ACS applied materials&interfaces,2015,7(14):7526-7533.,Yigong Shi al.Structure of a yeast spliceosome at 3.6-angstrom resolutionJ.Science,2015,349(6253):1182-1191.,方案四：高分辨冷冻透射电镜,(HR-Cryo-TEM,),2013,年，冷冻电镜技术在照相技术和软件分析的图像处理技术方面取得突破性,进展成为,施,一公实验室诺奖级工作,-,剪切体的结构解析的关键性,工具,HR-Cryo-TEM,诺贝尔奖热门,2014,年全球科技十大进展,结构生物学的突破性工具,最高分辨率达,2.2,优势,区分不同结构和类型的蛋白质,分辨率达到原子水平,SCIENCE,3481147-1151(2015),FEBS Journal 280(2013)2845,区分不同结构和类型的脂质体,方案四：超高分辨冷冻透射电镜,(HR-Cryo-TEM,),局限性：外部资源少,国家蛋白质科学中心,-,上海,脂质体表征,荧光,法,方案五：胆固醇荧光标记,+,荧光共聚焦显微镜,胆固醇与脂质体异性结合，对胆固醇进行荧光修饰，通过,confocal,观测,荧光脂质体,结构,缺点：分辨率较低，可能无法达到几十纳米级别,超高分辨率荧光显微镜,优点：专属性，排除其他物质干扰，外部资源多,Sung T C et al.Scientific reports,2016,6.,Shi X et al.Polymer Chemistry,2013,方案五：胆固醇荧光标记,+,荧光共聚焦显微镜,超高分辨率荧光显微镜（分辨率达到分子级别,1nm,左右，,2014,年诺贝尔化学奖,）,STORM,技术的开创者庄小威,2014,诺贝尔化学奖,方案六：胆固醇荧光标记,+,超高分辨荧光显微技术,Stefan W.Hell,W.E.Moerner,Eric Betzig,X.Zhuang,，,Science 317,1749-1753(2007),Nature Methods 3,793-795(2006),Science319,810-813(2008),低,分辨荧光显微镜和超高分辨荧光显微镜,图片,的对比,局限性：外部资源少,方案六：胆固醇荧光标记,+,超高分辨荧光显微技术,优点：突破,光学极限的,分辨率：,1nm,左右，,具有专属性，可作为通用的方法,北大工学院席鹏课题组,上海交大李小卫课题组,Seeing is Believing,分辨率非常重要,大小,形貌,结构,Conclusion:,化妆品终体系中脂质体的表征方案,一,、,假设,脂质体加入化妆品体系之后仍然稳定存在，则使用,Cryo-TEM,或者切片法检测，这两种方法保留了脂质体的原貌，理论上可以分辨出脂质体的双层结构。受配方体系中其他添加剂的影响不大，而且对体系纯度要求不高。,二,、,对于一些特例。比如低倍的,Cyro-TEM,或者切片法观测不到脂质体,不确定是否稳定存在于体系中，可以尝试使用荧光法。该方法对样品纯度没有要求。如果在共聚焦显微镜不能看到完整的脂质体形状，说明脂质体极大可能已经被破坏，那么这样的脂质体在体系中发挥不了增溶的作用，已经没有太大的实用价值。,三,、,如果在共聚焦显微镜下可以看到完整的脂质体形状，可以进一步尝试,高分辨,Cryo-TEM,或者,超高分辨,荧光显微镜进行观察。,对于复杂样品体系，需要多种表征方法一起反复确认，以保证观测结果的可靠性。,激光粒度仪,DLS,脂质体表征,激光粒度扫描仪,-,水合,粒径,原理,：在不同的角度上测量散射光,的强度，得到样品粒度分布,体积分布与数量分布之间的转换关系,颗粒平均粒径表示方法,体积（,D4,3,）,表面积（,D3,2,）,数量,不同颗粒均值对颗粒分布的,不同特征敏感,脂质体的水合粒径表征，应根据具体的样品体系选择合适的表示方法,激光粒度扫描仪,-,水合,粒径,包封,率,脂质体表征,脂质体的,包封率,测定,方法,原理,特点与适用范围,缺点,HPLC,法,参照磷脂含量测定,适用范围广，,可同时用于磷脂含量和包封率测定,/,透析法,利用,半透膜分子大小差别，通过及时更换外相达到分离的目的,简单，稳定性好，可处理大量样品，适合小粒径，稳定性好的脂质体,耗时较长,，,所耗介质较多,微柱,离心法,利用游离药物与含药脂质体的重力差异进行分离，计算包封率,所需样品少，适用于水溶性和脂溶性药物，分离时间短，可用于中间过程检测,离心,时间长,1h,以上,；,重现性差,；,离心力导致脂质体中物质渗,漏,凝胶柱层析法,利用脂质体与游离药物分子质量和粒径大小的差异进行分离,适用于脂溶性药物，较大脂质体粒径（,200nm,）,所需样品量大，操作繁琐，洗脱时间长造成渗漏,荧光淬灭反应法,1.,具有荧光的物质,在高浓度时发生“自淬灭”,在某一低浓度范围内,荧光强度又和浓度成正比。,2.,高浓度包封于脂质体内水相中荧光物质保持自淬灭无荧光产生,而未包封在脂质体外水相中浓度降低荧光重现,3.,通过荧光检测器测定荧光值,准确测定最初脂质体包封和未包封的荧光物质浓度计算得到包封率,可处理大量样品，检测物需有荧光性物质或可生成荧光性物质，直接测定,需注意荧光物质的酸碱溶解性，荧光物浓度不可过高（荧光强度低浓度下成线性关系）,电子自旋共振光谱法,当添加顺磁性试剂如铁氢化物时,外部标记物的电子自旋谱带会显著加宽,;,还可以利用包裹在脂质体内部的标记物与游离标记物间扩散系数的不同来测定包封率,所需样品量小,不需分离脂质体和游离药物,准确、稳定,可避免分离带来的误差,需加入顺磁性试剂,(,铁分析波长,248.3nm,此波长被检测物不能有吸收,),或分子标记物,核磁共振法,1HNMR,外,相,标记的游离药物显示出,pH,敏感的化学位移，而内水相标记的药物则没有。根据游离药物的量和总量计算得到包封率,适用于水溶性和脂溶性药物，结果精确,需要对药物进行标记,样品处理方法：,用透析法，超速离心法或凝胶柱层析法分离游离,A,。,2.,对脂质体进行破乳后测包裹的,A,含量。,反相液相色谱法,测定包封率,包封率（,%,）,=W,包,/W,总,100%,包封率（,%,）,=,（,1-W,漏,）,/,W,总,100%,Thanks,！,