电镜细胞化学技术ppt课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三节 电镜细胞化学技术,1,总 论,电镜细胞化学技术（,electron microscopic cytochemistry,）,是在保持细胞结构完整的条件下，借助细胞中的化学反应，研究细胞乃至细胞器的结构与功能关系，是一种将细胞的形态与功能相结合的一门技术。,研究方法,特殊染色技术,电镜放射自显影技术,酶细胞化学技术,细胞免疫技术,2,乙醇磷钨酸染色法,应用于嗜酸性白细胞和肥大细胞中的颗粒，心房特殊颗粒，血小板,颗粒、致密颗粒等。,这些颗粒中含有碱性蛋白，能与磷钨酸特异结合在电镜下显深染。,利用,CeCl,3,与,H,2,O,2,反应生成电子致密沉淀，在电镜下观察自由基生成部位及生成量的特殊染色法。,由于高电子密度示踪剂容易在细胞间隙扩散，如果细胞发生损伤，示踪剂还可进入细胞中区，因此可利用示踪细胞化学方法观察细胞连接及细胞损伤情况。,常用示踪剂有镧和钌红。,一、特殊染色技术,利用细胞中某种化学物质或化学反应生成物，与含有重金属成分的化学试剂具有特殊的亲和力或产生特定的化学反应后所生成的电子致密物，沉积于该处，成为特殊染色产物。,Ce-H,2,O,2,法,硝酸,镧、钌红,示踪法,3,二、电镜放射自显影技术,(electron microscopic autoradiography,，,EMARG),是,电子显微镜技术,和,放射自显影,相结合的一项技术，是一种利用,放射性同位素,作为标记物对细胞化学物质进行超微结构的,定位,、,定性,或,定量,的实验技术。旨在追踪某些物质在体内、组织或细胞中的分布与代谢径路。,同位素标记生物标本,常规方法制备超薄切片,切片铺上薄薄一层乳胶（暗室）,曝光（,1-2,个月）,观察,显影,4,三、电镜酶细胞化学技术,（,celectuon micueecopuc enzyme cytochemistry),利用酶催化反应的特点，从亚微结构上来研究细胞内各种酶在超微结构水平上的定位及这些酶在细胞活动过程中的变化。,水解酶,氧化还原酶,移位酶,裂解酶,合成酶,异构酶,5,酶细胞化学技术的原理,酶底物,反应产物,反应产物,初级,捕捉剂,最终,酶细胞化学反应,酶反应,捕捉反应,样品处理的三阶段,孵育后处理,孵育前处理,孵育,取材、固定、厚切片,（保存好酶的活性和超微结构）,中心阶段,（酶反应，控制好细胞化学反应的条件）,后固定、包埋、切片,（保存好细胞化学反应的产物）,6,水解酶化学反应原理,底物,磷酸水解酶,H,3,PO,4,捕捉剂，如,Pb,2+,Pb,3,(PO,4,),2,氧化还原酶化学反应原理,7,各种细胞器的标志酶,细胞器,标志酶,内质网,核苷二磷酸酶，葡萄糖,-6-,磷酸酶,高尔基体,焦磷酸硫胺素酶，烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸酶,溶酶体,酸性磷酸酶,微体,过氧化氢酶,线粒体,细胞色素氧化酶，琥珀酸脱氢酶,细胞膜,核糖核苷磷酸酶，碱性磷酸酶,由于各种细胞器成分中含有与其功能相关的不同酶，因此可利用各种细胞器的特异酶作为该细胞器的标志，以研究该细胞器的结构和功能，为细胞器的鉴别提供新方法。,8,操作要点及注意事项,切片中既能保持细胞超微结构的完整性又要保持酶的活性。,防止酶的移位、扩散和丢失，保持反应产物于原位，并可用于观察。,能对反应产物的特异性进行分析，如采用一些酶的抑制剂或其激活剂来分析酶的特异性；或用,X,射线显微分析法分析反应产物的有关元素，以确定酶的特异性。,9,是利用抗原与抗体特异性结合原理，在超微结构水平上对抗原分子进行形态定位、定性和半定量的技术方法，该方法为研究细胞结构与功能的关系及其在病理情况下发生的变化提供了有效的手段。,四、免疫细胞化学技术,（,Electron Microscopic Immunocytochemistry,）,主要特点：,要有特异的高亲和力的抗体或高亲和力的指示物；,细胞或组织的各部位能使抗体及电子密度高的指示物进入；,进行标记时必需保留有足够的抗原性物质；,适当保存细微结构。,10,1,固定剂及缓冲液的选择,多聚甲醛加低浓度的戊二醛（,PG,固定液：,1%,多聚甲醛加,0.01%-0.05,戊二醛，,4-5h,）,过碘酸盐,-,赖氨酸,-,多聚甲醛混合固定液（,PLP,固定液）,:,适用于富含糖类的组织，对超微结构及许多抗原的活性保存较好,二甲砷酸钠缓冲剂、咪唑及其衍生物缓冲液,固定剂,缓冲液,固定方法,固定时间,1-2h,，低温，,PH 6-8,11,2,标记物,标记物条件：,电子密度高；,与抗体有亲和力或直接与抗原有亲和力,胶体金,铁蛋白：,适用于定位细胞膜表面的抗原,辣根过氧化物酶：,标记细胞内抗原,12,一种带负电荷的疏水溶液，是由氯化金在还原剂作用下聚合成特定大小的金粒。由于聚合作用而成为稳定的胶体状况，因此成为胶体金。,胶体金,优点：,能稳定并迅速的吸附蛋白，而蛋白的生物活性不发生明显改变,制备抗体,-,胶体金；,在电镜下金颗粒电子密度高、圆形且界限清晰，易于辨认；,胶体金标记物易于制备，并且根据需要制备不同大小的胶体金（,1-150nm),，因二人可以进行免疫电镜的双重或多重标记。,13,3,基本技术方法,冷冻超薄切片免疫电镜技术,将组织块经过短时间固定后浸入高浓度的蔗糖溶液，经快速冷冻固定后进行冷冻超薄切片，切片经蔗糖和,PBS,冻融和漂洗后（除去包埋介质,水），进行免疫标记，标记后经漂洗再次固定包埋，干燥后即可进行电镜观察。,14,包埋前标记法,是指先对标本进行免疫标记，然后进行包埋、超薄切片并观察结果。,优点,：,切片在免疫染色前不经四氧化锇固定、脱水、树脂包埋及高温聚合的过程，抗原活性不受影响；,免疫标记后还可进行半薄切片，在免疫反应阳性部位做定位，从而进一步提高电镜的检出率；,免疫标记完毕后用戊二醛和四氧化锇再次固定组织，使抗原抗体结合更牢固。,15,包埋前标记法,缺点：受标记抗体的穿透性限制，可采取以下措施：,切厚片（,20-80m,），以利于标记抗体的穿透,振动切片机；,增加细胞膜的通透性，可用,0.01%Saponin,或,0.1%Triton X-100,，但要严格控制应用浓度和时间。,选用相对分子质量较小的标记物。,包埋前标记法常用于细胞膜表面抗原的标记。,16,包埋后标记法,是指组织标本经固定及树脂包埋，制作成超薄切片后再进行免疫化学标记的方法。,优点,：,阳性结果重复性高、方法简便可靠；,可对同一组织块的连续切片做各种对照免疫标记，能十分准确解释免疫标记结果；,能在同一张切片上进行多重免疫标记,缺点,：,抗原在脱水、浸透及树脂包埋过程中可能被破坏，且抗原被树脂遮盖不易于抗体接触，使免疫标记的阳性率下降。,17,包埋后标记法,在包埋后免疫电镜中应用最广的包埋剂：,低温包埋剂,Lowicryl,系列；,水溶性包埋剂,LR White.,均为丙烯酸树脂，不会与抗原产生共聚合，它具有亲水性和优良的切割性能，能耐受电子束轰击。,在低温下（,-35,80,）用紫外光（,315-360nm,）聚合，避免高温堆抗原的负面影响。,18,