质谱技术在蛋白质多肽化学.pptx

,*,第十一章,质谱技术在蛋白质、,多肽化学中应用,1/113,第一节,蛋白质、多肽质谱技术发展,第二节 蛋白质、多肽质谱技术介绍,第三节 质谱在蛋白质、多肽分析中应用,2/113,第一节,蛋白质、多肽质谱技术发展,3/113,一、基本原理,质谱分析法(mass spectrometry)是将化合物形成离子和碎片离子，按其,质荷比,(,/,值)不一样进行分离测定，来进行成份和结构分析一个分析方法。,蛋白质、多肽质谱是经过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪电场、磁场将含有特定质量与电荷比值(/值)蛋白质离子分离开来，经过离子检测器搜集分离离子，确定离子/值，分析判定未知蛋白质。,4/113,蛋白质、多肽质谱发展史,20世纪60年代,科学家们曾注意到质谱技术在蛋白质和肽结构分析中存在潜力，但因为离子化技术限制，近30年来，质谱技术只在,有机化合物小分子结构,测定中得到应用，而对于大分子(分子量超出1000Da)、极性分子和难气化分子，则显得无能为力。,5/113,70年代,Macfarlane等人创造了一个叫等离子体解吸(Plasma desorption,PD)离子化技术，使得质谱测定分子量范围,扩大到几千道尔顿,。,80年代初,Barber等人又引入了快原子轰击(fast atom bombardment，简称FAB)电离技术，并成功地测定了一个26肽结构，从而使得质谱技术,应用于蛋白质和肽,结构测定这一构想变为现实。,6/113,80年代末,两种更新技术得到发展，它们分别是 John Fenn 创造电喷雾电离(electrospray ionization，,ESI,)和Hillenkamp等人创造基质辅助激光解吸电离(matrix assisted laser desorption ionization,MALDI,)。,这两种技术处理了极性大、热不稳定蛋白质、多肽分子离子化和大分子量测定问题。另外，这两种质谱不论在灵敏度、准确性和在分析混合物复杂性方面都比以前技术有了显著改进，从而大大拓宽了质谱技术在蛋白质领域中应用，能够说是质谱技术在生物大分子中应用一场革命。,7/113,第二节,蛋白质、多肽质谱技术介绍,8/113,蛋白质、多肽质谱质谱技术介绍,质谱仪组成,离子源,质量分析器,检测器,串联质谱及联用技术,9/113,质谱仪组成,质谱仪普通由四部分组成：,进样系统,按电离方式需要，将样品送入离子源适当部位；,离子源,用来使样品分子电离生成离子，并使生成离子会聚成有一定能量和几何形状离子束；,质量分析器,利用电磁场（包含磁场、磁场和电场组合、高频电场、和高频脉冲电场等）作用未来自离子源离子束中不一样质荷比离子按空间位置，时间先后或运动轨道稳定是否等形式进行分离；,检测器,用来接收、检测和统计被分离后离子信号。,10/113,质谱仪组成,计算机数据,处理系统,真空系统,加速区,进样系统,离子源,质量分析器,检测器,Ionisation,source,Ion separation,Detector,Output,11/113,离子源,离子源功效,是将进样系统引入气态样品分子转化成离子。因为离子化所需要能量随分子不一样差异很大，所以，对于不一样分子应选择不一样离解方法。,通常称能给样品较大能量电离方法为,硬电离方法,，而给样品较小能量电离方法为,软电离方法,，后一个方法适合用于易破裂或易电离样品。,12/113,离子源,离子源是质谱仪心脏，能够将离子源看作是比较高级反应器，其中样品发生一系列特征降解反应，分解作用在很短时间(1s)内发生，所以能够快速取得质谱。,13/113,离子化方法,电子轰击电离 Electron Impact Ionization，EI,化学离子化 Chemical Ionization，CI,场电离，场解吸 Field Ionization FD，,Field Desorption FD,快原子轰击,Fast Atom Bombardment，,FAB,电喷雾电离,Electrospray Ionization，,ESI,基质辅助激光解析电离,Matrix-Assisted Laser,Desorption Ionization，,MALDI,大气压化学电离 Atmospheric Pressure,Chemical Ionization，APCI,14/113,离子化方法,依据不一样离子化方法，惯用适合用于蛋白质、多肽研究质谱技术方法包含FAB-MS、ESI-MS、MALDI-TOF-MS等，而其中又以,MALDI-MS,和,ESI-MS,应用最为广泛，这两个新技术显著增加了质谱范围和敏感度，从而造成了新软件和检测器发展。,15/113,FAB-MS,直到80年代FAB质谱问世，质谱技术才真正推广到蛋白质领域。,它是一个用,快速原子轰击被分散在高沸点溶剂(如甘油)中待测化合物,，从而产生分子离子。快原子产生是经过电离隋性气体Ar、Xe或He产生Ar,+,、Xe,+,或He,+,被电场加速，从而含有较大动能，以后经过Ar气室进行电荷交换反应：,Ar,+,（高动能）+Ar（热运动）Ar（高动能）+Ar,+,（热运动）,16/113,经电荷交换后低动能(热)Ar,+,被偏转出快原子流，取得高动能快速Ar原子对样品分子进行轰击，普通样品调在甘油基质之中，当快原子束轰击在涂有样品金属板上，快原子大量动能以各种方式消散，其中一些能量造成样品挥发和离解。,17/113,FAB-MS,18/113,FAB-MS特点,这种方法要求简单，灵敏较高。FAB产生分子离子非常稳定，不易裂解，是准确测定多肽化合物分子量有效方法。应用于一些较复杂混合物，能测出其各组份分子量。当然因为不易取得碎片峰，FAB质谱在测定多肽次序时碰到困难。,19/113,ESI-MS,电喷雾离子化技术,（electrospray ionization，ESI）利用,强静电场,从溶液直接产生气态离子化分子。ESI 能够与液相色谱、高效液相色谱、毛细管IEF 以及毛细管电泳等各种进样器联用。流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘。,20/113,ESI-MS,21/113,ESI-MS,ESI 普通分为正离子ESI 和负离子ESI 两类。,正离子ESI 原理,：在一个金属喷嘴针尖上加有2.5,6 kV高电压，经强电场作用，样品溶液从针尖小孔喷出，成为一个个带正电液滴。在迎面吹来热氯气流作用下，液滴表面溶剂蒸发，,液滴变小,，,液滴电荷密度骤增,。当静电排斥力等于液滴表面张力时，液滴便发生,崩解,，形成更小液滴。如此形成小液滴以类似方式继续崩解，于是，液滴中溶剂快速蒸干，产生多电荷正离子，在质谱仪内被分析纪录。,负离子EIS 过程与这类似，唯电性相反。,22/113,ESI-MS,Rayleigh,Limit,Reached,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,-,-,-,-,-,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,-,-,-,-,-,+,+,+,+,+,+,-,-,+,+,+,+,+,+,-,-,Evaporation,+,+,Charged Droplets,试样离子,准分子离子,Analyte Ions,Solvent Ion Clusters,Salts/Ion pairs,Neutrals,+,+,+,+,+,+,+,+,-,-,其它离子,23/113,ESI-MS,这种分子离子特点是分子离子往往带多个电荷。这些离子形成是靠吸附上或失去若干个质子而形成，所以在正离子或负离子谱上会观察到,(M+nH),n+,或(M-nH),n-,峰,。,对于生物大分子，在ESI谱上出来往往是一组带不一样电荷分子离子峰，依据仪器上统计下来每个峰质荷比及电荷数即可算出分子量值。,实际上从一组峰上可算出,无数个,分子量值，它们相互之间会,略有差异,，普通需在计算机上经特定程序处理，找出最靠近实际分子量值。,24/113,ESI-MS特点,优点：,处理了极性大、热不稳定蛋白质与多肽分子离子化和大分子质量、一级结构和共价修饰位点测定问题，并可用于研究DNA 与药品、金属离子、蛋白质和抗原与抗体相互作用。,缺点：,样品中盐类对样品结果影响很大，而且单个分子带电荷不一样可形成各种离子分子峰（重合峰），所以对混合物图谱解析比较困难,。,25/113,MALDI-MS,基质辅助激光解析电离,(matrix-assisted laser desorption ionization,MALDI)技术产生离子惯用飞行时间(time-off-flight,TOF)检测器来检测，所以MALDI名字常与TOF联在一起，即叫基质辅助激光解析飞行时间质谱仪,(MALDI-TOF-MS),。,简而言之，基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量仪是将多肽成份转换成离子信号，并依据质量/电荷之比(m/z)来对该多肽进行分析，以判断该多肽源自哪一个蛋白。,26/113,MALDI-MS,待检样品与含有在特定波长下吸光发光团化学基质,(matrix),混合，此样品混合物随即滴于一平板或载玻片上进行挥发，样品混合物残余水份和溶剂挥发使样品整合于格状晶体中，样品然后置于激光离子发生器,(lasersource),。,激光作用,于样品混合物，使化学基质吸收光子而被激活。此激活产生能量作用于多肽，使之由,固态样品混合物变成气态。,27/113,MALDI-TOF-MS,因为多肽分子倾向于吸收单一光子，故多肽离子带单一电荷.这些形成多肽离子直接进入飞行时间质量分析仪(,TOF,massanalyzer)。飞行时间质量分析仪用于测量多肽离子由分析仪一端飞抵另一端探测器所需要时间。而此飞行时间同多肽离子质量/电荷比值,成反比,，即质量/电荷之比越高，飞行时间越短TOF质量分析器被认为是与MALDI最正确搭配,。,28/113,MALDI-TOF-MS,29/113,MALDI-MS特点,对于一些,分子量较大,(1000000Da)或疏水性强蛋白质，MALDI比ESI更有效。,MALDI能有效地分析较复杂肽混合物或物理化学性质相差较大蛋白质混合物。只要能与所选择底物形成稳定分散体系样品都能用MALDI进行分析。,MALDI不受样品所含添加物、缓冲液或盐影响，且灵敏度也比别离子化方式高。,30/113,软电离,ESI和MALDI这两种“软电离”技术处理了极性大、热不稳定蛋白质离子化和大分子生物分子质量测定问题。而且，这两种方法在灵敏度、准确度和分析混合物复杂性方面都比以前质谱技术有了显著改进，,31/113,Yes,0.005%-0.01%,to 50 kDA,0.02%-0.03%,to 150 kDA,150 kDA,Low tolerance,(,20 mM,)for,nonvolatile buffers,alkali metal salts,detergents;online,LC-MS used for,contaminant removal,ESI,No,0.01%-0.05%,to 25 kDA,0.05%-0.3%,to 300 kDA,350 kDA,High tolerance(,50,mM,)for alkali metal,salts,phosphate,urea,etc.;tolerant of some,nonionic detergents;,intolerant of SDS,MALDI,Compatible with,on-line LC/CE-MS,Mass assignment,accuracy,MW range,Tolerance for buffers,salts,and detergents,Ionization,method,生物质谱两种主要电离方法比较,32/113,质量分析器,质量分析器,将带电离子依据其质荷比加以分离，用于纪录各种离子质量数和丰度。质量分析器两个主要技术参数是所能测定质荷比范围（质量范围）和分辨率。,扇形磁分析器,四极杆分析器,离子阱分析器,飞行时间分析器,傅里叶变换分析器,33/113,扇形磁分析器,不一样质荷比离子在磁场作用下，前进方向产生不一样偏转，从而使离子束发散。因为不一样质荷比离子在扇形磁场中有其,特有运动曲率半径,，经过改变磁场强度，检测依次经过狭缝出口离子，从而实现离子空间分离，形成质谱。,34/113,四极杆分析器,离子束在与棒状电极平行轴上聚焦，一个直流固定电压（DC）和一个射频电压（RF）作用在棒状电极上，两对电极之间电位相反。对于给定直流和射频电压，,特定质荷比离子在轴向稳定运动，其它质荷比离子则与电极碰撞湮灭。,35/113,离子阱分析器,由两个端盖电极和位于它们之间类似四极杆环电极组成。端盖电极施加直流电压或接地，环电极施加射频电压（RF），经过施加适当电压就能够形成一个势能阱（离子阱）。依据RF电压大小，离子阱就可捕捉某一质量范围离子。,离子阱能够储存离子,，待离子累积到一定数量后，升高环电极上RF电压，,离子按质量从高到低次序依次离开离子阱,，被电子倍增监测器检测。,36/113,飞行时间分析器,有相同动能，不一样质量离子，因其飞行速度不一样而分离。假如固定离子飞行距离，则不一样质量离子,飞行时间不一样,，质量小离子飞行时间短而首先抵达检测器。各种离子,飞行时间与质荷比平方根成正比,。,37/113,TOF分析器特点,TOF质量分析器,结果简单，轻易换算,，蛋白质离子在飞行管内飞行速度仅与他(m/z)-1/2成正比，所以轻易经过计算蛋白质离子在飞行管内飞行时间推算出蛋白质离子m/z值。与传统质量分析器相比，更易得到,高分辨率和高测量精度,；,速度快,，离子飞行时间仅为几个s和约100s之间；,质量范围宽,，能够直接检测到几十万道尔顿单电荷离子。,飞行时间质量分析器被认为是21世纪最有应用前景质量分析器。,38/113,傅里叶变换分析器,在一定强度磁场中，离子做圆周运动，离子运行轨道受共振变换电场限制。当变换电场频率和盘旋频率相同时，离子稳定加速，运动轨道半径越来越大，动能也越来越大。当电场消失时，沿轨道飞行离子在电极上产生,交变电流,。对信号频率进行分析可得出离子质量。将时间与对应频率谱利用计算机经过,傅里叶变换,形成质谱。其优点为分辨率很高，质荷比能够准确到千分之一道尔顿。,39/113,检测器,含有特定m/z 值离子经过质量分析器打在检测器上，在检测器上产生放大电流能够作为时间函数用来测定离子强度（丰度）和m/z。,离子源产生离子相对强度能够由检测器测量，其结果通常以,m/z 值,作为,横坐标,、,离子相对丰度,为,纵坐标,形式表示。,40/113,检测器,质谱普通能够用两种形式表示，一个是以规一化（nomalized）或者相对丰度（%RA）形式来表述，另一个是以总离子流百分数（%TIC）来描述。,在规一化质谱中，最高峰（largest peak）（比如最丰富离子，并不一定是所要研究分析物）被称为,基峰,（base peak），其高度要求为100单位，谱中其它峰相对高度都依据这个峰进行规一化，一次它们相对高度就介于0100单位之间。,41/113,串联质谱,两个或更多质谱连接在一起，称为串联质谱。,最简单串联质谱（MS/MS）由两个质谱串联而成，其中第一个质量分析器（MS1）将离子预分离或加能量修饰，由第二级质量分析器（MS2）分析结果。,42/113,Tandem MS or MS/MS has 2 mass,spectrometers in series,MS1,MS2,43/113,串联质谱,MS/MS最基本功效包含能说明MS1中母离子和MS2中子离子间联络。依据MS1和MS2扫描模式，如,子离子扫描、母离子扫描和中性碎片丢失扫描,，能够查明不一样质量数离子间关系。,最惯用就是将一级质谱分子离子(图谱称MS1)和惰性原子再一次轰击,低能碰撞诱导断裂,，low-energy collision-induced dissociation，,CID,或称碰撞辅助断裂，col1isionally assisted dissociation，CAD)，从而取得一张碎片图谱(MS2)。,44/113,三级四级质谱仪四种MS/MS工作方式,45/113,联用技术,色谱可作为质谱,样品导入装置,，并对样品进行,初步分离纯化,，所以色谱/质谱联用技术可对复杂体系进行分离分析。因为色谱可得到化合物保留时间，质谱可给出化合物分子量和结构信息，故对复杂体系或混合物中化合物判别和测定非常有效。,46/113,气相色谱/质谱联用（GC/MS,）,气相色谱流出物已经是气相状态，可直接导入质谱。因为气相色谱与质谱工作压力相差几个数量级，开始联用时在它们之间使用了各种气体分离器以处理工作压力差异。伴随毛细管气相色谱应用和高速真空泵使用，现在气相色谱流出物已可直接导入质谱。,47/113,液相色谱质谱联用（LC/MS）,液相色谱/质谱联用接口前已论及，主要用于分析GC/MS不能分析，或热稳定性差，强极性和高分子量物质，如,生物样品,（药品与其代谢产物）和,生物大分子,（肽、蛋白、核酸和多糖）。,在蛋白测序方面，LC-MS/MS得到了广泛应用。,48/113,LC-MS/MS,49/113,50/113,其它联用技术,毛细管电泳/质谱联用（CE/MS）,芯片/质谱联用（Chip/MS）,超临界流体色谱/质谱联用（SFC/MS）,等离子体发射光谱/质谱联用（ICP/MS）,51/113,第三节,质谱在蛋白质、多肽分析中应用,52/113,质谱在蛋白质、多肽分析中应用,分子量测定,蛋白质、多肽纯度判定,肽质量指纹谱,肽序列测定技术,蛋白质翻译后修饰判定,其它,蛋白质判定,53/113,分子量测定,用ESI-MS和MALDI-TOF-MS测定蛋白质和多肽分子量，准确度可达0.10.01，这远比其它方法(如SDS-PAGE、凝胶过滤、超离心等）准确。,正确测定蛋白质分子量，能够提供很多信息，如确定分子大小，从氨基酸组成份析结果求得准确氨基酸组成，验证已测定一级结构是否正确等。,54/113,分子量测定实例,采取聚丙烯酰胺凝胶电泳，高效凝胶过滤色谱以及电喷雾离子化质谱三种方法对新发觉一个蛋白质（起源于福建尖吻蝮蛇蛇毒,是一个含有类凝血酶活性弱酸性蛋白质）分子量进行了测定。,测定方法,分子量,非还原 SDS-PAGE,26.2kDa (二硫键未打开),还原 SDS-PAGE,29kDa (二硫键被还原),HPGFC,24.5kDa,ESI-MS,30298Da,55/113,分子量测定实例,天花粉蛋白一级结构测定，在86年时曾出现差错，当初测定结果表明它是由234个氨基酸残基组成，分子量为25682Da。90年，我们发觉结构测定有误，重新修正了其一级结构。它应由247个氨基酸残基组成，正确分子量为27141.32Da。,93年，用MALDL-TOF-MS和ESI-MS测定了天花粉分子量。,56/113,天花粉蛋白,（TCS）MALDI-TOF-MS,分子量图谱,57/113,天花粉蛋白（TCS）ESI-MS分子量图谱,58/113,分子量测定实例,-苦瓜子蛋白一级结构计算(包含糖部分)分子量为29156Da，用MALDI-TOF-MS测定分子量为29074Da，二者相差82Da。这种差异可能是个别氨基酸测定差错造成，预计整个结构测定不会有大错误,。,59/113,分子量测定实例,-苦瓜子蛋白其C 端用羧肽酶方法测定为-S-T-A-D-E-N，但尚不能完全确定。,苦瓜子蛋白在190位有一个色氨酸，我们用BNPS-Skatole降解色氨酸，降解后肽用HPLC分离，得到含有C 端一段小肽(59个氨基酸残基)用MALDI-TOF-MS测定其分子量为6443与计算得到59肽分子量为6442.9非常相符，所以也就证实了C 端59个氨基酸残基次序是正确。,60/113,-苦瓜子蛋白Trp降解C 端肽分子量,61/113,蛋白质、多肽纯度判定,依据质谱测定分子量作用，质谱还可用来作蛋白质、多肽纯度判定。,只要质量有差异杂质都能够被检出，此方法灵敏度高，用量少(pmol水平)、速度快，并有独到之处。,62/113,蛋白质、多肽纯度判定,实例1：天花粉蛋白C-端微观不均一，即有二个C末端，一个多一个Ala(即247个氨基酸残基)，一个少一个Ala(即246个氨基酸残基)，用ESI-MS完全能够分辨出来,63/113,实例2：,如猪胰岛素和人胰岛素混在一起，用MALDI-TOF-MS也能够清楚地分出二个峰。二者差异仅在猪胰岛素B链第30位为Ala(89.09Da)，而人胰岛素对应位置为Thr(119.12Da)，二者相差30Da（如图13-11）。这些差异用其它方法是极难检出。,64/113,蛋白质判定,肽质量指纹谱+基于串联质谱多肽测序,蛋白质判定,65/113,肽质量指纹谱,因为各种蛋白质氨基酸序列(一级结构)不一样，蛋白质被酶解后产生肽段序列也各异，,肽混合物质量数亦具特征性,，称为肽质量指纹谱(peptide mass fingerprint,PMF)，可用于蛋白质判定。,66/113,PMF 流程,67/113,肽质量指纹谱,MALDI-TOF-MS是最有效分析肽混合物质谱仪，肽混合物,不需分离,可直接分析，基质辅助激光电离方法能,耐受一定浓度盐,，仪器,灵敏度高,，标准样品1 pmol 量就足够，质量数,准确度,可达0.1 0.01，且,操作简单，分析速度快,，依仪器型号不一样,一次可分析,十几个到几十个样品。,68/113,PMF实例,蓖麻毒素(ricin),利用MALDI-TOF生物质谱技术结合肽质量指纹谱方法，经过数据库检索，建立了判定检测Ricin新方法。,69/113,MALDI-TOF质谱测定，得到Ricin分子量为62925 Da,70/113,Ricin肽质量指纹谱，共检出22条肽谱峰,71/113,将这些肽片段质谱数据用MASCOT搜索引擎在SwissProt数据库中进行PMF检索，检索参数如表1所表示。返回前5个检索结果，如表2所表示。其中符合要求结果(置信区间为得分大于66分)只有一个蛋白即蓖麻毒素:Ricin precursor(P02879，RICI_RICCO)，得分107，匹配肽段13条，肽谱试验值与理论值对比见表3，其余未检出肽段中有4条经过与理论值对照也找到了归属。,72/113,肽序列测定技术,两种经典测序方法：,DNA次序测定处理不了翻译后加工所造成氨基酸残基修饰问题；,Edman 降解不能处理N端封闭测序问题,。,73/113,蛋白梯形测序,(protein laddersequencing),使用少许链终止剂，进行快速,分步降解,，在人为控制下产生一系列肽段，其中每个肽段于下一个之间只相差一个残基；,用MALDI-TOF-MS读出肽段信息。,用此方法可在磷酸肽中定位磷酸丝氨酸残基。研究N-端封闭肽和蛋白，必须了解其C-端序列信息。,74/113,蛋白梯形测序,(protein laddersequencing),75/113,肽测序普通方法（MS/MS）,使用串联质谱，利用待测分子在电离及飞行过程中产生亚稳离子，经过分析相邻同组类型峰质量差，识别对应氨基酸残基。其中亚稳离子碎裂包含“本身”碎裂及外界作用诱导碎裂。,76/113,基于串联质谱肽序列测定,用特定蛋白水解酶作用于蛋白质，将得到肽段送入一级质谱，产生前体离子，经过一定选择前体离子在碰撞室发生,CID,。结果是前体离子肽骨架酰胺键特异性断裂，并产生了一系列可用于确定氨基酸序列,y 型和b 型,等离子。取得CID二级质谱图后可算出肽序列。,77/113,经过MS/MS分析多肽片段,78/113,N端和C端多肽,G,F,P,N,A,G,F,P,N,A,G,F,P,N,A,G,F,P,N,A,G,F,P,N,A,N-terminal peptides,C-terminal peptides,415,486,301,154,57,71,185,332,429,79/113,理论质谱图,80/113,理论质谱图与实际质谱图,81/113,理论质谱图与实际质谱图,82/113,标准肽Glu-fibMS/MS 图谱,83/113,MS/MS优点,MS/MS质谱测序,可对N 端封闭肽,进行测序;并能够经过CID 得到部分至完全序列信息后，做出MS 肽谱，这可,对修饰氨基酸残基定性，并确证其位置，包含二硫键分布,。而且质谱技术与分离技术直接相连也可,相互验证,，同时还可对,混合肽,进行测序。另外它还有,快速、灵敏,优点,。,84/113,基于MS/MS蛋白质判定,取得二级质谱图后可经过以下方法判定蛋白质：,较惯用,肽序列标签判定方法（peptide sequence tag，PST,：从一级质谱产生肽段中选择母离子，进入二级质谱，经惰性气体碰撞后肽段沿肽链断裂，由所得到各肽段质量数差值推定肽段序列，用于数据库查寻；,肽碎片离子搜索,：直接用前体离子产生未解析CID 图谱与数据库中CID 图谱比较，如Sequest、Mascot、Sonat 等算法；,从头测序法（de novo sequence），经过直接解释MS/MS 数据识别肽序列，这类系统和算法有Lutefisk、SHERENG、PEAKS、AuDeNS等。,85/113,基于MS/MS蛋白质判定,86/113,串联质谱在蛋白质组学中应用,87/113,测序其它方法,先用几个不一样蛋白水解酶对蛋白质进行酶解，,胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶,嗜热菌蛋白酶(thermo lysin),SV8 酶(staphylococcusaureusV8),各种酶解片段用HPLC 等分离得到纯肽或简单混合肽，可用MS/MS 测定其各组分次序，然后从不一样蛋白水解酶酶解片段次序，找到其重合部分，即可得到整个蛋白质次序。,88/113,蛋白质翻译后修饰判定,磷酸化修饰,糖基化修饰,巯基和二硫键定位,氨基乙酰化,泛素化修饰,89/113,磷酸化修饰,已知磷酰氨基酸类型有四种：,1O-磷酸盐，经过羟氨酸磷酸化形成，如丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。,2N-磷酸盐，经过精氨酸，赖氨酸或组氨酸中氨基磷酸化形成。,3乙酰磷酸盐，经过天冬氨酸或谷氨酸磷酸化形成。,4S-磷酸酯，经过半胱氨酸磷酸化形成。,90/113,磷酸化肽富集,分离,技术有：双向磷酸多肽谱图(2D-PP)；高分辨率凝胶电泳(2DE)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)。,对于,32,P标识磷酸化肽或蛋白可用放射自显影或磷储屏检测，提取后能够高灵敏度MALDI-MS分析；假如,32,P标识不可行，就要用LC-MS/MS分析，惯用HPLC与质谱联用。,惯用,富集,方法有：固定金属亲和色谱(IMAC)；抗体免疫沉淀；化学修饰。,91/113,质谱检测磷酸化肽和确定磷酸化位点方法,MALDI-TOF-MS 能够经过肽指纹谱(PMF)判定蛋白质，与磷酸酯酶处理相结合能够确定磷酸化位点。,原理：,磷酸酯酶处理后，磷酸化肽丢失磷酸基团而产生特定质量数改变，MALDI-TOF-MS经过检测这种,质量数改变,而确定磷酸化位点。,92/113,串联质谱(MS/MS)进行前体离子扫描，这一方法是经过检测磷酸基团产生特定片段来汇报磷酸肽存在。,原理：,磷酸化肽经CID后会产生磷酸基团,特异性片段,，这些特异性片段在用串联质谱进行前体离子扫描时可作为磷酸肽“汇报离子”。,质谱检测磷酸化肽和 确定磷酸化位点方法,93/113,串联质谱还可进行中性丢失扫描，这种方法是用MS/MS检测经CID后发生,中性丢失H,3,PO,4,(98 u)肽段。,LC-MS/MS分析磷酸化位点,傅立叶变换质谱进行电子捕捉解离,质谱检测磷酸化肽和 确定磷酸化位点方法,94/113,糖基化修饰,蛋白质糖基化可分为4类:,N-糖基化,O-糖基化,C-甘露糖化,聚糖磷脂酰肌醇锚(GPI-anchor)糖基化,95/113,糖蛋白,糖苷内切酶,还原、烷基化、蛋白酶解,MALDI-TOF-MS,糖含量,相对分子质量,ESI串联质谱,MALDI-TOF-MS,凝集素提取,氨基酸序列,糖基化位点,糖肽片段,糖蛋白结构分析示意图,96/113,糖基化位点确定,先用蛋白酶将糖蛋白酶解成含有和不含有糖链肽片段，取得糖蛋白,肽质量指纹谱,，再用糖苷内切酶将肽链切除，PMF发生,改变,，原含有糖肽段质量因为糖链丢失在质谱图上发生,位移,，经过网上,数据库检索,能够得到位移肽片段,氨基酸序列,，而在这个序列中必含有,糖基化位点,，由此我们能够确定糖蛋白分子中糖基化位点。,97/113,糖基化分析,用糖苷内切酶将糖链切除，将反应前后质谱图进行比较，就能直接表述,糖链平均质量,，而糖蛋白平均含糖量可由糖链平均质量占糖蛋白平均相对分子质量百分比来表示。,应用ESI，对PMF中肽片段进行分析，能够得到蛋白某中间片段序列，对已知蛋白，依靠此序列，判断其归属，从而对糖蛋白,氨基酸序列加以证实,。,不一样质谱方法能够产生多糖源后裂解(PSD)和碰撞诱导解离(CID)谱，这能够给出相关糖序列，分支及糖间连接等信息。,98/113,99/113,糖基化修饰,惯用糖蛋白质,分离富集,技术有:凝集素亲和技术、肼化学富集法、亲水相互作用色谱法、消除麦克尔加成反应。,基于质谱糖蛋白质判定及糖基化位点确定方法有:PNGase F 酶法、Endo H 酶法、-消除麦克尔加成反应、三氟甲基磺酸法,。,100/113,巯基和二硫键定位,原理：,利用,碘乙酰胺、4-乙烯吡啶、2-巯基苏糖醇,等试剂对蛋白质进行烷基化和还原烷基化,结合蛋白酶切、肽谱技术,利用生物质谱,准确分子量测定,可实现对二硫键和自由巯基快速定位与确定。这在含有多二硫键结构活性多肽与蛋白质研究中有主要用途。,101/113,泛素化修饰,原理：因为泛素C 末端是Arg-Gly-Gly 结构，经胰蛋白酶水解后，Gly-Gly 留在被修饰蛋白质肽链上，,使肽段质量增加114,，起到质量标识泛素化位点作用，进而经过串联质谱判定泛素化位点。,102/113,其它翻译后修饰,乙酰化,甲基化,脂基化,谷胱甘肽化,103/113,质谱其它应用,蛋白质折叠,抗原决定部位指认,蛋白和蛋白、低聚核苷酸及金属之间作用,细胞和病毒分析等,药品代谢判定,104/113,第四节,新一代质谱仪,105/113,混和质谱仪,基质辅助激光解吸电离-四极杆飞行时间质谱（MALDI-quandruple-TOF）技术,带有四级杆和飞行时间两个分析器，兼具,肽指纹图谱大规模和串联质谱可直接取得肽序列双重优点,，即可做PMF，又可经过MS/MS 做肽序列标签。,106/113,ESI-Q-TOF-MS/MS质谱仪,107/113,MALDI-TOFTOF-MS,对存放在样品靶上同一样品，数秒中就能够分别取得,PMF和肽序列信息,。,发展MALDI-TOF/TOF-MS非常主要，因为它是当前唯一可能工业化高通量判定蛋白质技术方法。,108/113,Bruker Ultraflex II MALDI TOF/TOF MS,109/113,FTICR-MS,将给或已经给蛋白质组学带来影响更为深刻。首先，因为其含有没有可比拟质量测定准确度（1 ppm），便产生了一个新判定蛋白质策略,准确质量标签法,（accurate mass tag，AMT）。,因为FTICR-MS 能够实现对完整蛋白质分析，所以直接造成,从上到下蛋白质组学,（top-down proteomics，或称为 top-down mass spectrometry）出现。,110/113,傅立叶变换离子盘旋共振质谱(,FTICR-MS),111/113,总结,现在，生物质谱被认为是大规模、高通量进行,蛋白质结构判定,首选工具，同时生物质谱已经在,蛋白质组学研究,中饰演着举足轻重作用，而且伴伴随新质谱仪出现，其在蛋白质组学中应用将越来越广泛。,112/113,Thank you！,113/113,