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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,专题26基因工程,高考生物,(北京市专用),1/116,考点1基因工程工具与操作程序,1.,(北京理综,5,6分)用,Xho,和,Sal,两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段,酶切,位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述,不正确,是,(),图1酶切位点图,图2电泳结果示意图,A.图1中两种酶识别核苷酸序列不一样,B.图2中酶切产物可用于构建重组DNA,C.泳道中是用,Sal,处理得到酶切产物,D.图中被酶切DNA片段是单链DNA,五年高考,2/116,答案D,图1中,两种限制性核酸内切酶酶切位点不一样,说明两种限制性核酸内切酶识别,核苷酸序列不一样,A正确。图2中,两种酶酶切产物都为DNA片段,都可用于构建重组DNA,B,正确。结合图1酶切位点图,判断两种酶切DNA后得到DNA片段数;再结合泳道电泳,结果知,泳道是用,Sal,处理得到酶切产物,C正确。能被限制性核酸内切酶酶切DNA片,段仍为双链DNA,D错误。,知识拓展,为何当代基因工程不使用同一个限制酶?,为预防载体或目标基因发生本身环化,我们惯用不一样限制酶分别处理目标基因和载体,使目,基因两侧及载体各自含有两个不一样末端。,3/116,2.,(北京理综,5,6分)为了增加菊花花色类型,研究者从其它植物中克隆出花色基因C(图1),拟将其与质粒(图2)重组,再借助农杆菌导入菊花中。,以下操作与试验目标,不符,是,(),A.用限制性核酸内切酶,Eco,R和连接酶构建重组质粒,B.用含C基因农杆菌侵染菊花愈伤组织,将C基因导入细胞,C.在培养基中添加卡那霉素,筛选被转化菊花细胞,D.用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上,4/116,答案C,本题主要考查基因工程相关知识。因为C基因两端及质粒上均存在限制酶,Eco,R,酶切位点,所以,可采取限制酶,Eco,R 和DNA连接酶构建重组质粒;用含C基因农杆菌,侵染菊花愈伤组织(即农杆菌转化法),能够将C基因导入细胞;因为质粒上存在潮霉素抗性基,因(标识基因),所以,能够在培养基中添加潮霉素,筛选被转化菊花细胞,C符合题意;可用分子,杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上。,5/116,3,.(北京理综,5,6分)在应用农杆菌侵染植物叶片取得转基因植株常规试验步骤中,不需,要,是,(),A.用携带目标基因农杆菌侵染植物细胞,B.用选择培养基筛选导入目标基因细胞,C.用聚乙二醇诱导转基因细胞原生质体融合,D.用适当百分比生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织生芽,答案C,用农杆菌转化法取得转基因细胞需经植物组织培养取得转基因个体,不需要经,过原生质体融合过程,C错误。,6/116,4,.(天津理综,4,6分)为到达对应目标,必须,经过分子检测是,(),A.携带链霉素抗性基因受体菌筛选,B.产生抗人白细胞介素-8抗体杂交瘤细胞筛选,C.转基因抗虫棉植株抗虫效果判定,D.21三体综合征诊疗,答案B,依据受体菌是否对链霉素产生抗性进行携带链霉素抗性基因受体菌筛选,不需,要分子检测,A错误;用特定选择培养基筛选出杂交瘤细胞,还需要进行克隆化培养和抗体检,测,才能取得足够多能分泌抗人白细胞介素-8抗体杂交瘤细胞,B正确;转基因抗虫棉是否,含有抗虫特征,需要做抗虫接种试验,C错误;21三体综合征可经过用显微镜直接观察体细胞,中21号染色体数目标方法进行检测,D错误。,7/116,5.,(天津理综,10,14分)甲型流感病毒为RNA病毒,易引发流感大规模流行。我国科学家在2,0创造了一个制备该病毒活疫苗新方法,主要步骤以下。,(1)改造病毒部分基因,使其失去在正常宿主细胞内增殖能力。以病毒RNA为模板,逆转录,成对应DNA后,利用,技术扩增,并将其中一些基因(不包含表面抗原基因)内个别编码,氨基酸序列替换成编码终止密码子序列。与改造前基因相比,改造后基因表示时不,能合成完整长度,所以不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其它基因,分别构建重组质粒,并保留。,(2)构建适合改造病毒增殖转基因宿主细胞。设计合成一个特殊tRNA基因,其产物反密,码子能与(1)中终止密码子配对结合,并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与,连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞,进行分子杂交判定,筛选取得成功表示上,述tRNA转基因宿主细胞。,(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中重组质粒导入(2)中转基因宿主细胞,并在补加,培养基中进行培养,则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA,翻译出改造,病毒基因完整蛋白,产生大量子代病毒,用于制备疫苗。,8/116,特殊tRNA基因转录时,识别其开启子酶是,(单项选择)。,A.病毒DNA聚合酶,B.宿主DNA聚合酶,C.病毒RNA聚合酶,D.宿主RNA聚合酶,(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖,没有致病性,所以不经灭活或减毒即可制成疫,苗。与不具侵染性流感病毒灭活疫苗相比,该病毒活疫苗优势之一是可引发,免,疫,增强免疫保护效果。,答案,(1)PCR多肽(或蛋白质),(2)载体总RNA,(3)非天然氨基酸(Uaa)D,(4)细胞,9/116,解析,本题主要考查基因工程相关知识。(1)利用PCR技术体外扩增DNA。若将基因中个,别编码氨基酸序列替换为编码终止密码子序列,则改造后基因转录合成mRNA中,终,止密码子提前出现,将不能控制合成完整长度多肽(或蛋白质)。(2)目标基因只有与载体连,接后才能导入宿主细胞。可提取宿主细胞总RNA进行分子杂交判定,以筛选取得成功表示,题述tRNA转基因宿主细胞。(3)由(2)知,转基因宿主细胞含有特殊tRNA基因转录tR-,NA,该tRNA反密码子可与终止密码子配对,并可携带非天然氨基酸(Uaa),所以培养基中需,补加非天然氨基酸(Uaa)。病毒中基因进行转录时,识别其开启子酶是宿主RNA聚合,酶。(4)因该病毒疫苗含有侵染性,故可引发细胞免疫。,疑难突破,1.由(1)中“个别编码氨基酸序列替换成编码终止密码子序列”可知,改造后,基因表示时不能合成完整长度多肽。,2.,由(2)中特殊tRNA能与终止密码子配对结合,并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)可知,转基因,宿主细胞可利用非天然氨基酸Uaa,所以培养基中需加入非天然氨基酸Uaa。,3.灭活了病毒已不含有侵染性,所以,只能引发体液免疫;而具侵染性病毒可引发细胞免,疫。,10/116,6.,(课标全国,38,15分)回答以下问题:,(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌,细胞中进行了表示。该研究除证实了质粒能够作为载体外,还证实了,(答出两点即可)。,(2)体外重组质粒可经过Ca,2+,参加,方法导入大肠杆菌细胞;而体外重组噬菌体,DNA通常需与,组装成完整噬菌体后,才能经过侵染方法将重组噬菌体,DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中,可作为重组噬菌体宿主细胞是,。,(3)真核生物基因(目标基因)在大肠杆菌细胞内表示时,表示出蛋白质可能会被降解。为防,止蛋白质被降解,在试验中应选取,大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化,过程中应添加,抑制剂。,11/116,答案,(1)体外重组质粒能够进入受体细胞;真核生物基因可在原核细胞中表示(2)转化,外壳蛋白(或答噬菌体蛋白)细菌(3)蛋白酶缺点型蛋白酶,解析,本题主要考查基因工程相关知识。(1)体外重组质粒能够进入受体细胞,且重组质,粒在不一样细胞中能正常表示,说明目标基因在不一样细胞中表示机制相同,生物界共用一套遗,传密码。(2)基因工程中,受体细胞为大肠杆菌细胞时,惯用Ca,2+,处理大肠杆菌,使之处于感受态,即Ca,2+,参加转化法。噬菌体DNA与外壳蛋白组装成完整噬菌体。因噬菌体宿主是细菌,故只有细菌可作为重组噬菌体宿主细胞。(3)为预防目标基因表示蛋白质被破坏,可选取,不能合成蛋白酶大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化过程中加入蛋白酶抑制剂能够保,护蛋白质不被水解。,知识归纳,目标基因导入受体细胞方法,(1)若受体细胞为植物细胞:基因枪法、花粉管通道法、农杆菌转化法。,(2)若受体细胞为动物细胞:显微注射法。,(3)若受体细胞为大肠杆菌:感受态细胞法。,12/116,7.,(课标全国,40,15分)某一质粒载体如图所表示,外源DNA插入到,Amp,r,或,Tet,r,中会造成对应,基因失活(,Amp,r,表示氨苄青霉素抗性基因,Tet,r,表示四环素抗性基因)。有些人将此质粒载体用,Bam,H酶切后,与用,Bam,H酶切取得目标基因混合,加入DNA连接酶进行连接反应,用得,到混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有未被转化,有被转化。被转化大肠杆,菌有三种,分别是含有环状目标基因、含有质粒载体、含有插入了目标基因重组质粒大,肠杆菌。回答以下问题:,(1)质粒载体作为基因工程工具,应具备基本条件有,(答出两点即可),而,13/116,作为基因表示载体,除满足上述基本条件外,还需含有开启子和终止子。,(2)假如用含有氨苄青霉素培养基进行筛选,在上述四种大肠杆菌细胞中,未被转化和仅含,环状目标基因细胞是不能区分,其原因是,;,而且,和,细胞也是不能区分,其原因是,。在上述筛选基础上,若要筛选含有插入了目标基因重组质粒大肠杆菌,单菌落,还需使用含有,固体培养基。,(3)基因工程中,一些噬菌体经改造后能够作为载体,其DNA复制所需原料来自,。,答案,(1)能自我复制、含有标识基因(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上,均不生长含有质粒载体含有插入了目标基因重组质粒(或答含有重组质粒)二者均含,有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均能生长四环素(3)受体细胞,14/116,解析,(1)质粒作为载体应具备基本条件有:能自我复制、含有标识基因、含有一至多个限,制酶切割位点等。(2)由题意可知,未被转化和仅含环状目标基因细胞中均不含有氨苄青,霉素抗性基因,所以在含有氨苄青霉素培养基上均不能生长。质粒载体上含有氨苄青霉素,抗性基因和四环素抗性基因,插入了目标基因重组质粒中仅含有氨苄青霉素抗性基因,所以,含有质粒载体和含有插入了目标基因重组质粒细胞均能在含有氨苄青霉素培养基上,生长,但前者能够在含有四环素培养基上生长而后者不能,所以可用含有四环素培养基,筛,选出含有插入了目标基因重组质粒大肠杆菌单菌落。(3)噬菌体属于病毒,病毒增殖过程,中所需原料、酶等均来自受体细胞。,知识归纳,标识基因关键点总结:普通将一些抗性基因作为标识基因;标识基因主要作用,是判定和筛选含有目标基因受体细胞;标识基因表示产物对什么物质有抗性,在筛选培养,时则在培养基中加入什么物质;标识基因若被插入了外源DNA片段,则该标识基因会被破,坏。,15/116,8.,(江苏单科,32,9分,0.306)胰岛素A、B链分别表示法是生产胰岛素方法之一。图1是该,方法所用基因表示载体,图2表示利用大肠杆菌作为工程菌生产人胰岛素基本流程(融合,蛋白A、B分别表示-半乳糖苷酶与胰岛素A、B链融合蛋白)。请回答以下问题:,图1,图2,16/116,(1)图1基因表示载体中没有标注出来基本结构是,。,(2)图1中开启子是,酶识别和结合部位,有了它才能开启目标基因表示;氨苄青霉,素抗性基因作用是,。,(3)构建基因表示载体时必需工具酶有,。,(4)-半乳糖苷酶与胰岛素A链或B链融合表示,可将胰岛素肽链上蛋白酶切割位点隐藏在内,部,其意义在于,。,(5)溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端肽键,用溴化氰处理对应融合蛋白能取得完整,A链或B链,且-半乳糖苷酶被切成多个肽段,这是因为,。,(6)依据图2中胰岛素结构,请推测每个胰岛素分子中所含游离氨基数量。你推测结果,是,理由是,。,答案,(1)终止子,(2)RNA聚合作为标识基因,将含有重组质粒大肠杆菌筛选出来,(3)限制酶和DNA连接酶,(4)预防胰岛素A、B链被菌体内蛋白酶降解,(5)-半乳糖苷酶中含多个甲硫氨酸,而胰岛素A、B链中不含甲硫氨酸,(6)最少2个两条肽链一端各有一个游离氨基,氨基酸R基团中可能还含有游离氨基,17/116,解析,(1)完整基因表示载体应包含目标基因、开启子、终止子、标识基因等,图1中没有,标注出终止子。(2)开启子是RNA聚合酶识别和结合部位,可驱动转录出mRNA;氨苄青霉素,抗性基因属于标识基因,可利用含氨苄青霉素培养基筛选出含有重组质粒大肠杆菌。(3),构建基因表示载体需用限制酶分别切割目标基因和质粒,再用DNA连接酶将二者连接形成重,组质粒。(4)利用-半乳糖苷酶与胰岛素A链或B链融合表示意义是将胰岛素肽链上蛋白,酶切割位点隐藏在-半乳糖苷酶内部,从而预防胰岛素A链或B链被大肠杆菌体内蛋白酶降,解。(5)依据溴化氰作用特点可知,溴化氰可将-半乳糖苷酶切成多个肽段,但不会切割胰岛,素A、B链,这与肽链中含有甲硫氨酸数量相关。(6)因为每条肽链一端都含有一个游离,氨基,所以蛋白质分子中游离氨基数量=肽链数+R基上游离氨基数,故可推测胰岛素(由A、,B链组成)最少含有2个游离氨基。,易错警示,基因表示载体几个组成部分中,开启子和终止子是常考查内容,也是易与,mRNA上起始密码子和终止密码子相混同知识。防止将“游离氨基”与“氨基残基”,混同。,18/116,9.,(江苏单科,33,8分,0.448)荧光原位杂交可用荧光标识特异DNA片段为探针,与染色体,上对应DNA片段结合,从而将特定基因在染色体上定位。请回答以下问题:,图1,19/116,图2,(1)DNA荧光探针制备过程如图1所表示,DNA酶随机切开了核苷酸之间,键从而,产生切口,随即在DNA聚合酶作用下,以荧光标识,为原料,合成荧光标识,DNA探针。,(2)图2表示探针与待测基因结合原理。先将探针与染色体共同煮沸,使DNA双链中,键断裂,形成单链。随即在降温复性过程中,探针碱基按照,标准,与染色体上,特定基因序列形成较稳定杂交分子。图中两条姐妹染色单体中最多可有,条荧,光标识DNA片段。,(3)A、B、C分别代表不一样起源一个染色体组,已知AA和BB中各有一对同源染色体可被荧光探针标识。若植物甲(AABB)与植物乙(AACC)杂交,则其F,1,有丝分裂中期细胞中可观察到,个荧光点;在减数第一次分裂形成两个子细胞中分别可观察到,个荧光点。,20/116,答案,(1)磷酸二酯脱氧核苷酸,(2)氢碱基互补配对4,(3)62和4,解析,本题主要考查DNA结构、复制、有丝分裂和减数分裂相关知识。(1)DNA酶可,使DNA分子断裂成为片段,为限制酶,其作用为切开两个核苷酸之间磷酸二酯键。合成,DNA分子原料为4种脱氧核苷酸。(2)DNA分子受热变性,氢键断裂,解旋为单链。探针碱,基与染色体上特定基因序列按照碱基互补配正确标准,形成杂交分子。因为每条染色单体,含有一个DNA分子,一个DNA分子能够有2条荧光标识片段,所以两条姐妹染色单体中最多,有4条荧光标识片段,但只能观察到两个荧光点。(3)植物甲与植物乙杂交后代F,1,为AABC,在,有丝分裂中期已完成了DNA复制,而且A和B都能够被荧光探针标识,所以可观察到6个荧光,点。F,1,AABC在减数第一次分裂形成两个子细胞分别含有A、AB,所以分别可观察到2和4,个荧光点。,21/116,以下为教师用书专用,10.,(广东理综,25,6分)下列图为培育转基因山羊生产人-酪蛋白流程图。,以下叙述正确是(双选),(),A.过程所用人-酪蛋白基因可从人cDNA文库中取得,B.过程可选取囊胚期或原肠胚期胚胎进行移植,C.过程可使用胚胎分割技术扩大转基因山羊群体,D.过程人-酪蛋白基因在细胞质内进行转录、翻译,答案AC,胚胎移植普通选桑椹胚或囊胚期胚胎进行移植,不能选取原肠胚,B错误;基因,转录发生在细胞核内,D错误。,22/116,11.,(广东理综,25,6分)利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂流程如图所表示,以下,叙述正确是(双选),(),A.过程需使用逆转录酶,B.过程需使用解旋酶和PCR获取目标基因,C.过程使用感受态细胞可用NaCl溶液制备,D.过程可利用DNA分子杂交判定目标基因是否已导入受体细胞,答案AD,由mRNA形成cDNA需要逆转录酶,A正确;过程需要使用限制酶和PCR技术获,得并扩增目标基因,B错误;过程使用感受态细胞可用CaCl,2,溶液制备,C错误;工程菌是指用,基因工程方法,使外源基因得到高效表示菌类细胞株系,所以过程可利用DNA分子杂交鉴,定目标基因是否已导入受体细胞,D正确。,23/116,12.,(重庆理综,6,6分)以下相关人胰岛素基因表示载体叙述,正确是,(),A.表示载体中胰岛素基因可经过人肝细胞mRNA反转录取得,B.表示载体复制和胰岛素基因表示均开启于复制原(起)点,C.借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因受体细胞筛选出来,D.开启子和终止密码子均在胰岛素基因转录中起作用,答案C,因为人肝细胞中胰岛素基因不能表示,所以无法利用肝细胞mRNA反转录取得胰岛,素基因,A项错误;表示载体复制开启于复制原点,胰岛素基因转录开启于开启子,B项错误;,抗生素抗性基因是标识基因,作用是检测受体细胞中是否含有目标基因,从而将含有胰岛素基,因受体细胞筛选出来,C项正确;开启子是RNA聚合酶识别和结合部位,是转录起点,而终,止密码子位于mRNA上,在翻译中起作用,D项错误。,24/116,13.,(课标全国,38,15分)真核生物基因中通常有内含子,而原核生物基因中没有,原核生,物没有真核生物所含有切除内含子对应RNA序列机制。已知在人体中基因A(有内含,子)能够表示出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答以下问题:,(1)某同学从人基因组文库中取得了基因A,以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A,其原,因是,。,(2)若用家蚕作为表示基因A受体,在噬菌体和昆虫病毒两种载体中,不选取,作为载体,其原因是,。,(3)若要高效地取得蛋白A,可选取大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比,大肠杆菌含有,(答出两点即可)等优点。,(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A,可用检测物质是,(填“蛋白A基,因”或“蛋白A抗体”)。,(5)艾弗里等人肺炎双球菌转化试验为证实DNA是遗传物质做出了主要贡献,也能够说是基,因工程先导,假如说他们工作为基因工程理论建立提供了启示,那么,这一启示是,。,25/116,答案,(1)基因A有内含子,在大肠杆菌中,其初始转录产物中与内含子对应RNA序列不能被,切除,无法表示出蛋白A(2)噬菌体噬菌体宿主是细菌,而不是家蚕(3)繁殖快、轻易培,养(4)蛋白A抗体(5)DNA能够从一个生物个体转移到另一个生物个体,解析,本题主要考查基因工程相关知识。(1)从人基因组文库中取得基因A中含有内,含子,而大肠杆菌属于原核生物,故大肠杆菌不能切除基因A初始转录产物中与内含子对应,RNA序列,故基因A在大肠杆菌中无法表示出蛋白A。(2)因为病毒对宿主细胞感染含有特,异性,噬菌体只能寄生在细菌细胞中,不能感染家蚕细胞,故应选取可感染家蚕昆虫病毒作为,载体。(3)与真核生物相比,大肠杆菌等原核生物含有繁殖快、轻易培养、遗传物质相对较少,等优点。(4)检测基因A是否翻译出蛋白A,普通用抗原抗体杂交方法,即用蛋白A抗体,与从细胞中提取蛋白质进行杂交,观察是否出现杂交带。(5)肺炎双球菌转化试验实质是,S型菌DNA进入R型菌体内,并可在R型菌体内完成表示,这证实了DNA能够从一个生物个体,转移到另一个生物个体,为基因工程奠定了基础。,知识拓展,真核生物基因中通常有内含子,原核生物基因中不含有内含子,所以原核生物不,能切除内含子转录RNA序列,故基因工程中不能将真核生物基因直接导入原核生物,而常,使用反转录方法先取得真核生物cDNA(不含内含子),再进行下一步操作。,26/116,14.,(江苏单科,33,9分)下表是几个限制酶识别序列及其切割位点,图1、图2中标注了相关,限制酶酶切位点,其中切割位点相同酶不重复标注。请回答以下问题:,图1,限制酶,Bam,H,Bcl,Sau,3A,Hin,d,识别序列及,切割位点,ATC C,C CTA,ATC A,A CTA,GATC,CTAG,GCT T,T TCG,27/116,图2,(1)用图中质粒和目标基因构建重组质粒,应选取,两种限制酶切割,酶切后载体和,目标基因片段,经过,酶作用后取得重组质粒。为了扩增重组质粒,需将其转入处于,态大肠杆菌。,(2)为了筛选出转入了重组质粒大肠杆菌,应在筛选平板培养基中添加,平板上长出,菌落,惯用PCR判定,所用引物组成为图2中,。,(3)若,Bam,H酶切DNA末端与,Bcl,酶切DNA末端连接,连接部位6个碱基对序列为,对于该部位,这两种酶,(填“都能”、“都不能”或“只有一个能”)切开。,(4)若用,Sau,3A切图1质粒最多可能取得,种大小不一样DNA片段。,28/116,答案,(1),Bcl,和,Hin,d连接感受,(2)四环素引物甲和引物丙,(3)T GATC C,A CTAG G,都不能,(4)7,29/116,解析,本题主要考查基因工程相关知识。(1)分析4种限制酶识别序列可知:,Bam,H和,Bcl,识别序列中含有,Sau,3A识别序列,这三种酶切割DNA后能够产生相同黏性末端。为,确保质粒上含有标识基因,切割质粒时不能选取,Bam,H和,Sau,3A,应选取,Bcl,和,Hin,d两,种限制酶切割;酶切后载体和目标基因片段,需用DNA连接酶连接形成重组质粒,为了扩增,重组质粒,需将其转入处于感受态大肠杆菌中。(2)重组质粒中四环素抗性基因结构完整,氨,苄青霉素抗性基因结构被破坏,在筛选平板培养基中添加四环素能够筛选出转入了重组质粒,大肠杆菌。PCR扩增目标基因时,需用引物甲和引物丙两种引物。(3),Bam,H酶切产生黏,性末端为,Bcl,酶切产生黏性末端为,经DNA连接酶连接后,连接部位6,个碱基对序列为,此序列不能被,Bam,H和,Bcl,识别,所以不能被两,种酶切开。(4)图1质粒中含有,Sau,3A酶3个识别序列,如图:(A、B、C分别表示相邻切点间,DNA片段),30/116,用,Sau,3A酶切,若在一个切点处切割可得到:B+C+A、C+A+B、A+B+C三种DNA片段(但其,大小相同),若在两个切点处切割可得到:A、B+C、A+C、B、A+B、C六种DNA片段(其大小,均不一样);若在三个切点处均切割,可得到A、B、C三种大小不一样DNA片段,总而言之,用,Sau,3,A酶切质粒最多可能取得7种大小不一样DNA片段。,疑难突破,准确识别出,Bam,H酶和,Bcl,酶识别序列中含有,Sau,3A酶识别序列,是准确解,答本题关键。注意第(4)小题中要考虑到,Sau,3A酶可能打开1个切点、2个切点和3个切点,三种情况。,31/116,15.,(课标全国,40,15分)图(a)中三个DNA片段上依次表示出了,Eco,R、,Bam,H和,Sau,3A三种限制性内切酶识别序列与切割位点,图(b)为某种表示载体示意图(载体上,Eco,R、,Sau,3A切点是唯一)。,图(a),图(b),32/116,依据基因工程相关知识,回答以下问题:,(1)经,Bam,H酶切后得到目标基因能够与上述表示载体被,酶切后产物连接,理,由是,。,(2)若某人利用图(b)所表示表示载体取得了甲、乙、丙三种含有目标基因重组子,如图(c)所,示。这三种重组子中,不能在宿主细胞中表示目标基因产物有,不能表示原因是,。,图(c),33/116,依据基因工程相关知识,回答以下问题:,(1)经,Bam,H酶切后得到目标基因能够与上述表示载体被,酶切后产物连接,理,由是,。,(2)若某人利用图(b)所表示表示载体取得了甲、乙、丙三种含有目标基因重组子,如图(c)所,示。这三种重组子中,不能在宿主细胞中表示目标基因产物有,不能表示原因是,。,图(c),(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来酶,常见有,和,其中既能连接黏性末端又能连接平末端是,。,34/116,答案,(1),Sau,3A两种酶切割后产生片段含有相同黏性末端(每空2分,共4分),(2)甲和丙(2分)甲中目标基因插入在开启子上游,丙中目标基因插入在终止子下游,二,者目标基因均不能被转录(3分,其它合理答案可酌情给分),(3),E,coli,DNA连接酶T,4,DNA连接酶T,4,DNA连接酶(每空2分,共6分,其它合理答案可酌情给,分),解析,(1)分析图(a)可知,限制酶,Sau,3A与,Bam,H切割DNA后形成黏性末端相同,故经这,两种酶切割得到产物能够用DNA连接酶进行连接。(2)构建基因表示载体时,为确保目标基,因能在宿主细胞中成功表示,目标基因应插入在开启子和终止子之间,据此可判断甲、丙均不,符合要求,目标基因均不能被转录。(3)常见DNA连接酶有,E,coli,DNA连接酶和T,4,DNA连接,酶,其中T,4,DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。,解后反思,本题与高考理综新课标卷第40题相类似,从而提醒我们:能够从历年高考真,题中窥探国家考试中心出题者命题方向与角度。,35/116,16.,浙江自选,18(一)下面是关于取得能产生人干扰素大肠杆菌问题。请回答:,(1)用限制性核酸内切酶识他人干扰素基因和质粒中一段特定,并切割,然后用,连接形成重组DNA。该质粒是一个含抗生素抗性基因,核酸分子。,A.双链环状B.单链环状,C.双链线状D.单链线状,(2)将含人干扰素基因重组质粒导入到大肠杆菌,经含有,培养基筛选等过程,最终,取得能产生人干扰素大肠杆菌。,答案,(1)核苷酸序列DNA连接酶A(2)抗生素,解析,(1)限制性核酸内切酶能够识别特定核苷酸序列并切割每一条链中特定部位两个,核苷酸间磷酸二酯键,然后用DNA连接酶连接形成重组DNA。该大肠杆菌质粒是一个很小,双链环状DNA分子。(2)因为该质粒含有抗生素抗性基因,所以能够在含有抗生素培养基,中进行筛选,最终取得能产生人干扰素大肠杆菌。,评析,本题考查基因工程原理及生态工程相关知识。难度较小。,36/116,17.,(福建理综,33,10分)GDNF是一个神经营养因子,对损伤神经细胞含有营养和保护作,用。研究人员构建了含,GDNF,基因表示载体(如图1所表示),并导入到大鼠神经干细胞中,用于,干细胞基因治疗研究。请回答:,图1,37/116,图2,(1)在分离和培养大鼠神经干细胞过程中,使用胰蛋白酶目标是,。,(2)构建含,GDNF,基因表示载体时,需选择图1中,限制酶进行酶切。,(3)经酶切后载体和,GDNF,基因进行连接,连接产物经筛选得到载体主要有3种:单个载体,自连、,GDNF,基因与载体正向连接、,GDNF,基因与载体反向连接(如图1所表示)。为判定这3种,连接方式,选择,Hpa,酶和,Bam,H酶对筛选得到载体进行双酶切,并对酶切后DNA片段,进行电泳分析,结果如图2所表示。图中第,泳道显示所判定载体是正向连接。,(4)将正向连接表示载体导入神经干细胞后,为了检测,GDNF,基因是否成功表示,可用对应,与提取蛋白质杂交。当培养神经干细胞到达一定密度时,需进行,培养以得到更多数量细胞,用于神经干细胞移植治疗试验。,38/116,答案,(1)使细胞分散开(2),Xho,(3)(4)抗体传代,解析,(1)因动物细胞体外培养时有接触抑制现象,故需用胰蛋白酶处理动物组织,使细胞分散,开。(2)目标基因两端及载体DNA分子中都有,Xho,酶识别核苷酸序列,故构建基因表示载,体时,应用,Xho,酶切割DNA分子。(3)图示可知载体中酶,Hpa,与,Xho,切割点距离为100 bp,GDNF,基因切割成600 bp和100 bp两种DNA片段,由正向连接重组载体中,GDNF,基因方向与,Hpa,、,Xho,酶切割结果可知,正向连接重组载体被酶,Hpa,和酶,Xho,切割后,将得到6 0,00 bp和700 bp两种DNA片段,即为。(4)可用抗原抗体杂交原理,对目标基因是否表示进,行检测。当培养液中细胞到达一定密度后,可分瓶进行传代培养,以取得更多数量细胞。,39/116,考点2PCR技术及基因工程应用,1.,(江苏单科,32,8分)为生产含有特定性能-淀粉酶,研究人员从某种海洋细菌中克隆了,-淀粉酶基因(1 656个碱基对),利用基因工程大量制备-淀粉酶,试验流程见图。请回答以下,问题:,(1)利用PCR技术扩增-淀粉酶基因前,需先取得细菌,。,(2)为了便于扩增DNA片段与表示载体连接,需在引物,端加上限制性酶切位点,且常在两条引物上设计加入不一样限制性酶切位点,主要目标是,。,40/116,(3)进行扩增时,反应温度和时间需依据详细情况进行设定,以下选项中,设定与引物,相关,设定与扩增片段长度相关。(填序号),变性温度退火温度延伸温度变性时间,退火时间延伸时间,(4)下列图表示筛选取得工程菌中编码-淀粉酶mRNA 部分碱基序列:,5-AUGCCAUCAACAAAUACUAACACUU,-3,图中虚线框内mRNA片段包含,个密码子,如虚线框后序列未知,预测虚线框后第,一个密码子最多有,种。,(5)取得工程菌表示-淀粉酶后,为探究影响酶活性原因,以浓度为1%可溶性淀粉为底,物测定酶活性,结果以下:,缓冲液,50 mmol/L Na,2,HPO,4,-KH,2,PO,4,50 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L Gly-NaOH,pH,6.0,6.5,7.0,7.5,7.5,8.0,8.5,9.0,9.0,9.5,10.0,10.5,酶相对,活性%,25.4,40.2,49.8,63.2,70.1,95.5,99.5,85.3,68.1,63.7,41.5,20.8,依据上述试验结果,初步判断该-淀粉酶活性最高条件为,。,41/116,答案,(1)基因组DNA(2)5使DNA片段能定向插入表示载体,降低自连,(3)(4)813,(5)pH为8.5,缓冲液为50 mmol/L Tirs-HCl,解析,(1)由题干信息可知某种海洋细菌含有-淀粉酶基因,所以在扩增-淀粉酶基因前需先,从细菌中提取细菌基因组DNA。(2)因为引物作用是引导子链延伸,将脱氧核苷酸连接,到引物上时,是与引物3端相连,由此确定需在引物5端加上限制性酶切位点。常在两,条引物上加入不一样限制酶切位点主要目标是使DNA片段能定向插入表示载体,预防本身,相连。(3)进行PCR扩增时,退火温度与引物长短和碱基种类相关。延伸时间长短设定与,扩增片段长度相关。(4)密码子是指mRNA上决定一个氨基酸三个相邻碱基,该mRNA,上5端为AUG(起始密码子),所以可依据三个碱基是一个密码子来分析图中虚线框中碱基,可得出共有8个密码子。因为虚线框后第一个密码子已经固定为U,所以还有2个碱基未知,共可能有种数为4,4=16,又因为UAG、UGA、UAA为终止密码子,所以决定氨基酸密码,子最多有13种。(5)据表格数据可知:-淀粉酶在pH为8.5、缓冲液为50 mmol/L Tris-HCl条,件下相对活性为99.5%,初步判断此条件下酶活性最高。,42/116,2.,(天津理综,9,20分)玉米自交系(遗传稳定育种材料)B含有高产、抗病等优良性状,但难以直接培育成转基因植株,为使其取得抗除草剂性状,需依次进行步骤、试验。,.取得抗除草剂转基因玉米自交系A,技术路线以下列图。,(1)为预防酶切产物本身环化,构建表示载体需用2种限制酶,选择标准是,(单项选择)。,Ti质粒内,每种限制酶只有一个切割位点,G基因编码蛋白质序列中,每种限制酶只有一个切割位点,酶切后,G基因形成两个黏性末端序列不相同,酶切后,Ti质粒形成两个黏性末端序列相同,A.B.,C.,D.,(2),下表是,4,种玉米自交系幼胚组织培养不一样阶段结果。据表可知,细胞脱分化时使用激,素是,自交系,幼胚最适合培养成愈伤组织作为转化受体。,43/116,激素结果自交系,2,4-D(2.0 mg/L),6-BA(0.5 mg/L),IBA(2.0 mg/L),愈伤组织形成率(%),芽分化率(%),根诱导率(%),甲,99,13,90,乙,85,80,87,丙,88,83,12,丁,16,85,83,44/116,激素结果自交系,2,4-D(2.0 mg/L),6-BA(0.5 mg/L),IBA(2.0 mg/L),愈伤组织形成率(%),芽分化率(%),根诱导率(%),甲,99,13,90,乙,85,80,87,丙,88,83,12,丁,16,85,83,(3)农杆菌转化愈伤组织时,T-DNA携带插入其内片段转移到受体细胞。筛选转化愈伤组,织,需使用含,选择培养基。,(4)转化过程中,愈伤组织表面常残留农杆菌,造成未转化愈伤组织也可能在选择培养基上生,长。含有内含子汇报基因只能在真核生物中正确表示,其产物能催化无色物质K展现蓝,色。用K分别处理以下愈伤组织,出现蓝色是,(多项选择)。,A.无农杆菌附着未转化愈伤组织,B.无农杆菌附着转化愈伤组织,C.农杆菌附着未转化愈伤组织,D.农杆菌附着转化愈伤组织,(5)组织培养取得转基因植株(核DNA中仅插入一个G基因)进行自交,在子代含G基因植株,中,纯合子占,。继续筛选,最终选育出抗除草剂纯合自交系A。,45/116,答案,(1)A(2)2,4-D乙(3)除草剂(4)BD(5),解析,(1)利用双酶切可有效预防出现限制酶切割后产物(目标基因、载体)发生本身环化,及目标基因与载体任意连接现象。这要求每种限制酶在Ti质粒内只有一个切割位点,含目,基因DNA片段被两种限制酶切割形成黏性末端碱基序列不一样。(2)细胞脱分化形成愈,伤组织。表格信息显示,使用了2,4-D促使细胞脱分化。作为转化受体幼胚,不但要易脱分,化,而且还要易再分化生芽、生根,故乙幼胚最适合培养成愈伤组织作为转化受体。(3)构建,基因表示载体中有抗生素抗性基因和除草剂抗性基因(除草剂抗性基因位于T-DNA片段,上),因利用农杆菌转化法转基因时,只有T-DNA整合到植物细胞染色体DNA上,故需使用含除,草剂培养基筛选转化愈伤组织。(4)因“含有内含子汇报基因只能在真核生物中正确,表示”,只有细胞内含有汇报基因(成功转化)愈伤组织,用K处理后出现蓝色,故选BD。(5)转,基因植株相当于携带G基因杂合子,转基因植株自交,后代有3/4植株携带G 基因,其中纯合子,占1/3。,46/116,易错警示,转基因植物培育过程中,筛选成功转化植物受体细胞标准,利用农杆菌转化法完成植物细胞转基因时,因只有Ti质粒T-DNA整合到受体细胞染色体,DNA上,故筛选转化植物受体细胞只能借助T-DNA片段上特殊基因作为筛选标准,而Ti质,粒上非T-DNA片段未导入植物受体细胞,在对转化后受体细胞筛选时不能以此作为选择,标准。,47/116,3.,(江苏单科,33,8分)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在金属结合蛋白,某研究小组计划,经过多聚酶链式反应(PCR)扩增取得目标基因,构建转基因工程菌,用于重金属废水净化处,理。PCR扩增过程示意图以下,请回答以下问题:,(1)从高表示MT蛋白生物组织中提取mRNA,经过,取得,用于PCR扩增。,(2)设计一对与,MT,基因两端序列互补配正确引物(引物1和引物2),为方便构建重组质粒,在引物,48/116,中需要增加适当,位点。设计引物时需要防止引物之间形成,而造成引物自连。,(3)图中步骤1代表,步骤2代表退火,步骤3代表延伸,这三个步骤组成一轮循环。,(4)PCR扩增时,退火温度设定是成败关键。退火温度过高会破坏,碱基,配对。退火温度设定与引物长度、碱基组成相关,长度相同但,引物需要,设定更高退火温度。,(5)假如PCR反应得不到任何扩增产物,则能够采取改进办法有,(填序号:升高退,火温度降低退火温度
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