分析化学-色谱分析法.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,色谱法的发展和分类,色谱过程和基本原理,基本类型色谱方法及其分离机制,色谱法基本理论,1,2,高分离效能、高灵敏度、高选择性,分析速度快,应用范围广,色谱法的特点,:,色谱学的重要作用,诺贝尔化学奖：,1948,年，瑞典,Tiselins,，电泳和吸附分析；,1952,年，英国马丁,(Martin),和辛格,(Synge),，分配色谱。,应用的科学领域：生命科学、材料科学、环境科学等。（科学的科学）,药学（药物分析）：各国药典收载了许多色谱分析方法。中国药典二部，,700,多，纯度检查、定性鉴别或含量测定。,USP,，,2000+,3,二、色谱法的发展,（一）色谱法的历史,（二）色谱法的现状和发展趋势,1,新型固定相和检测器的研制,2,色谱新方法的研究,3,色谱联用技术,4,色谱专家系统,6,第二节 色谱过程和基本原理,一、色谱过程,实现色谱操作的基本条件是必须具备相对运动的两相，固定相,(stationary phase),和流动相,(mobile phase),。,色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间,多次,“,分配,”,的过程。,7,8,色谱过程,组分的结构和性质微小差异 与固定相作用差 随流动相移动的速度不等 差速迁移 色谱分离。,9,二、色谱流出曲线和有关概念,色谱流出曲线,是由检测器输出的电信号强度对时间作图所绘制的曲线，又称为色谱图。,基线,是在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线。基线反映仪器,(,主要是检测器,),的噪音随时间的变化。,色谱峰,是流出曲线上的突起部分。,正常色谱峰、拖尾峰和前延峰,10,11,对称因子,f,s,(symmetry factor),：,衡量色谱峰的对称性,12,到,20,页,到,19,页,定性参数,1,保留时间,(,retention time;,t,R,),：,从进样到某组分在柱后出现浓度极大时的时间间隔。,死时间,(,t,0,),：,分配系数为零的组分，即不被固定相吸附或溶解的组分的保留时间。,调整保留时间,(),：,某组分由于溶解（或被吸附）于固定相，比不溶解（或不被吸附）的组分在柱中多停留的时间。,13,定性参数,2,保留体积,(,V,R,),：从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大时，所需通过色谱柱的流动相体积。,14,死体积,(,V,0,),：由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间。,固定相颗粒间间隙、导管的容积、检测器内腔容积的总和。,定性参数,3,调整保留体积,(adjusted retention volume;),：由保留体积扣除死体积后的体积,15,相对保留值,(,r,),：两组分的调整保留值之比,定量参数,峰高,(peak height,；,h,),：组分在柱后出现浓度极大时的检测信号，即色谱峰顶至基线的距离。,峰面积,(peak area,；,A,),：色谱曲线与基线间包围的面积。,16,返回,柱效参数,标准差,(standard deviation,；,),：正态色谱流出曲线上两拐点间距离之半，即,0.607,倍峰高处的峰宽之半。,的大小表示组分被带出色谱柱的分散程度。,越大，组分越分散；反之越集中。,半峰宽,(,W,1/2,),：峰高一半处的峰宽。,W,1/2,=2.355,峰宽,(peak width,；,W,),：色谱峰两侧拐点作切线在基线上所截得的距离。,W,=4,或,W,=1.699,W,1/2,17,返回,总分离效能指标,分离度,(,resolution,；,Rs,),：又称分辨率。是相邻两色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。,18,分离度,设正常峰，,W,1,W,2,=4,，,则,R,=1.5,时，,99.7%,面积,(,t,R,3,),被分开，,t,R,=6,，称,6,分离,，,即基线分离,。,19,三、分配系数与色谱分离,(,一,),分配系数和保留因子,分配系数,(distribution coefficient,；,K,),是在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相,(s),与流动相,(m),中的,浓度,(,C,),之比,。,20,分配系数仅与组分、固定相和流动相的性质及温度（,和压力）,有关。是组分的,特征常数,。,分配系数与色谱分离,保留因子,(capacity factor,；,k,),：,在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相和流动相中的质量,(,m,),之比。,又称为质量分配系数或分配比。,21,还与固定相和流动相的体积有关。,保留因子与,分配系数的关系,分配系数与色谱分离,（二）分配系数和保留因子与保留时间的关系,22,t,R,=,t,0,(1+,k,),t,R,=,t,0,(1+,K,),v,=,L,/,t,R,u,=,L,/,t,0,（三）,色谱分离的前提,K,A,K,B,或,k,A,k,B,是色谱分离的前提。,23,=,t,0,(1+,K,A,),=,t,0,(1+,K,B,),t,R,=,t,0,(,K,A,K,B,),t,R,0,K,A,K,B,k,A,k,B,分配系数与色谱分离,推导过程：,第三节 基本类型色谱方法及其分离机制,分配色谱法,吸附色谱法,离子交换色谱法,空间排阻色谱法,24,一、分配色谱法,25,分配色谱法,分离原理,利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别而实现分离,。,26,溶质分子在固定相中溶解度越大，或在流动相,中溶解度越小，,则,K,越大。在,LLC,中,K,主要与流,动相的性质,(,种类与极性,),有关；在,GLC,中,K,与,固定,相极性和柱温有关。,分配色谱法,固定相,又称固定液（涂渍在惰性载体颗粒上的一薄层,液体；化学键合相（通过化学反应将各种有机,基团键合到载体上形成的固定相）。,流动相,气液分配色谱法：气体，常为氢气或氮气。,液液分配色谱法：与固定相不相溶的液体。,正相,液液分配,色谱：流动相的极性弱于固定相的极性。,反相,液液分配,色谱：流动相的极性强于固定相的极性。,27,分配色谱法,洗脱顺序 由组分在固定相或流动相中溶解度的相对大小而决定。,28,正相液液分配色谱：极性强的组分后被洗脱。,（库仑力和氢键力）,反相液液分配色谱：极性强的组分先出柱。,二、吸附色谱法,分离原理,利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附能力的差别而实现分离。,吸附过程是试样中组分的分子,(X),与流动相分子,(Y),争夺吸附剂表面活性中心的过程，即为竞争吸附过程。,29,30,31,吸附系数与吸附剂的,活性、组分的性质和,流动相的性质有关。,吸附色谱法,固定相,多为吸附剂，如硅胶、氧化铝。,硅胶,表面硅醇基为吸附中心。,经典液相柱色谱和薄层色谱：一般硅胶,高效液相色谱：球型或无定型全多孔硅 胶和堆积硅珠。,气相色谱：高分子多孔微球等,32,吸附色谱法,流动相,有机溶剂（硅胶为吸附剂）,洗脱能力：主要由其极性决定。,强极性流动相占据吸附中心的能力强，洗脱能力强，使,k,值小，保留时间短。,Snyder,溶剂强度,o,：吸附自由能，表示洗脱能力。,o,值越大，固定相对溶剂的吸附能力越强，即洗脱能力越强。,33,34,表,17-1,一些溶剂在硅胶上的,o,值,溶剂,溶剂强度,（,o,）,溶剂,溶剂强度,（,o,）,正戊烷,0.00,甲基特丁基醚,0.48,正己烷,0.00,醋酸乙酯,0.48,氯仿,0.26,乙腈,0.52,二氯甲烷,0.40,异丙醇,0.60,乙醚,0.43,甲醇,0.70,吸附色谱法,洗脱顺序,k,a,=,K,a,S,a,/,V,m,在色谱柱（,S,a,与,V,m,一定）时，,K,a,大的组分保留强，后被洗脱，,K,a,小的组分在吸附剂上保留弱，先被洗脱。,K,a,与组分的性质（极性、取代基的类型和数目、构型有关）。,35,36,以硅胶为吸附剂：极性强的组分吸附力强,。,饱和碳氢化合物为非极性化合物，不被吸附。基本母核相同，引入的取代基极性越强，则分子的极性越强，吸附能力越强；极性基团越多，分子极性越强,(,但要考虑其他因素的影响,),。,不饱和化合物的吸附力强，双键数越多，吸附力越强。,分子中取代基的空间排列,三、离子交换色谱法,分离原理,利用被分离组分离子交换能力的,差别而实现分离。,分为阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。,阳离子交换：,阴离子交换：,离子交换通式：,37,交换,再生,+,+,3,RNR,+,OH,-,Cl,RNR,+,3,Cl,OH,交换,再生,+,+,RSO,H,+,Na,+,Na,+,+,3,3,H,RSO,四、空间排阻色谱法,分离原理,根据被分离组分分子的线团尺寸 进行分离,。,也称为分子排阻色谱法。,38,39,空间排阻色谱法,根据空间排阻（,steric exclusion,）理论，孔内外同等大小的溶质分子处于扩散平衡状态：,渗透系数,：,K,p,=,X,s,/,X,m,（,0,K,p,1,）,由溶质分子的线团尺寸和凝胶孔隙的大小所决定。在一定分子线团尺寸范围内，,K,p,与分子量相关，即组分按分子量的大小分离。,40,空间排阻色谱法,固定相多孔凝胶：软质、半软质和硬质,主要性能参数,平均孔径,排斥极限（,K,p,=0,）：不能渗透进入凝胶的任何孔隙最低分子量,分子量范围：排斥极限（,K,p,=0,）与全渗透点（,K,p,=1,）之间的分子量范围围。选择凝胶时应使试样的分子量落入此范围。,41,空间排阻色谱法,流动相,要求：能溶解试样、润湿凝胶，粘度要低,水溶,性试样选择水溶液为流动相,(,称为,凝胶过滤色谱,gel filtration chromatography,；,GFC,),；,非水溶性试样选择四氢呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有机溶剂为流动相,(,凝胶渗透色谱,gel permeation chromatography,；,GPC,),。,42,空间排阻色谱法,保留体积与渗透系数的关系,43,V,m,V,0,分子线团尺寸（分子量）大的组分，,其渗透系数小，保留体积也小，,因而先被洗脱出柱,。,小结,色谱过程方程式,：,分配系数大的组分保留时间长（保留体积大），晚流出色谱柱。,K,在分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱和凝胶色谱中，分别为狭义分配系数,K,、吸附系数,K,a,、选择性系数,K,A/B,和渗透系数,K,p,，,V,s,分别为色谱柱（或薄层板）内固定液体积、吸附剂表面积、离子交换剂总交换容量和凝胶孔内总容积。,44,第四节 色谱法基本理论,45,46,要使,R,大，必须：,1,、,t,R,大,-,k,大,-,热力学,2,、,W,小,-,峰展宽小,-,动力学,47,色谱理论包括两方面,:,热力学理论,：研究分配,(,分离,),过程，塔板理论（,plate theory,）。,动力学理论,：研究各种动力学因素对峰展宽的影响，速率理论（,rate theory,）。,一、塔板理论,始于马丁（,Martin,）和辛格（,Synge,）提出的塔板模型。,分馏塔：在塔板上多次气液平衡，按沸点不同而分离。,色谱柱：组分在两相间的多次分配平衡，按分配系数不同而分离。,48,塔板理论假定：,在色谱柱内每一“塔板”,H,内，组分在两相间瞬间达到分配平衡。,流动相间歇式进入色谱柱，每次进入一个塔板体积。,分配系数在各塔板内是常数。,纵向扩散可以忽略。,49,一根色谱柱,n,=10,3,以上，,组分有微小的分配系数,(,容量因子,),差别即可实现完全分离,。,分配系数,(,容量因子,),不等是分离的前提,。,50,2,、色谱流出曲线,当塔板数很大时，流出曲线趋于正态分布曲线。,51,52,色谱峰面积,53,以,A,代替,C,0,，,h,代替,C,max,，且,W,1/2,=2.355,，,峰面积,:,A,=,h,(,2,),1/2,A,=1.065,W,1/2,h,色谱定量的参数,54,(,三,),理论塔板高度和理论塔板数,(height equivalent to a theoretical plate,或,plate height,H,),(plate number,n,),是色谱柱效参数。,理论塔板数与标准差（峰宽或半峰宽）和保留时间的关系：,55,理论塔板高度,H,=,L,/,n,56,注意：,1,、计算,n,时使标准差（峰宽或半峰宽）和保留时间,单位一致,2,、,n,的单位,有效理论塔板数和有效理论塔板高度,57,H,ef,=,L,/,n,ef,小结,塔板理论解释了流出曲线的形状,说明了组分的分配和分离过程,提出了评价柱效的指标,但某些假设与实际色谱过程不符,58,二、速率理论,塔板理论的不足：,组分在两相中不可能真正达到分配平衡；,组分在色谱柱中的纵向扩散不能忽略,;,没有考虑各种动力学因素对传质过程的影响；,无法解释柱效与流动相流速的关系；,不能说明影响柱效有哪些主要因素。,59,速率理论,1956,年，荷兰学者范第姆特,(Van Deemter),提出了色谱过程动力学理论,速率理论。,60,塔板高度,涡流扩散项,纵向扩散项,传质阻抗项,H,=,A,+,B,/,u,+,Cu,速率理论,(,一,),影响,H,的动力学因数,涡流扩散,(eddy diffusion),也称为多径扩散,61,62,速率理论,(,一,),影响,H,的动力学因数,涡流扩散,原因：柱填充不均匀,A,=2,d,p,63,A,：涡流扩散系数，其单位为,cm,。,：填充不规则因子，,填充技术和填料颗粒形状决定。,d,p,：填料,(,固定相,),颗粒的平均直径，,d,p,小，,A,小；但,d,p,太小，,和柱阻,大。,速率理论,(,一,),影响,H,的动力学因数,纵向扩散,(longitudinal diffusion),64,组分向,“,塞子,”,前后扩散，使,区带展宽。,原因：,浓度差,速率理论,(,一,),影响,H,的动力学因数,纵向扩散项,B,/,u,影响因素：,u,，,B,=2,D,m,65,B,：纵向扩散系数，其单位为,cm,2,/s,，,：弯曲因子，反映固定相颗粒对分子扩散,的阻碍。,D,m,：组分在,流动相,中的扩散系数。,速率理论,(,一,),影响,H,的动力学因数,传质阻抗,(mass transfer resistance),66,传质：溶解、扩散、转移的过程。,传质阻抗：影响传质过程的阻力。,结果,：（,非平衡状态,），使有些分子较快向前移动，而另一些滞后，引起峰展宽。,传质阻抗系数,C,，其单位,s,，包括,C,m,、,C,s,速率理论,67,速率理论（二）,流动相线速度对塔板高度的影响,A,：不受,u,影响,B/u,：,u,H,Cu,：,（,C,m,、,C,s,）,u,H,68,69,速率理论（二）,流动相线速度对塔板高度的影响,总结果：,u,较低时：,B/u,主导，,u,H,u,较高时：,Cu,主导，,u,H,u,最佳,主要内容：,色谱过程和分离原理,基本概念和计算公式：保留值、分配系数、保留因子、,n,、,H,、,R,色谱基本理论：塔板理论、速率理论,基本类型色谱机制,70,