共聚焦显微镜-汇报.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基本介绍,中文名称：,激光扫描共聚焦显微镜,英文名称：,Confocal Laser Scanning Microscopy;CLSM,定义：,利用,激光,点作为荧光的激发光并通过扫描装置对标本进行连续扫描，并通过空间共轭光阑（针孔）阻挡离焦平面光线而成像的一种显微镜。是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器。,应用学科：,细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）,共聚焦显微镜的原理简介,（,Confocal Laser Scan Microscope,CLSM,）,从某种意义上讲，共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜，它对传统的光镜从以下几方面作了改进,在显微镜基础上配置,激光光源,，,扫描装置,，,共扼聚焦装置,和,检测系统,而形成的新型显微镜。,利用共聚焦光路和激光扫描获得生物样品的显微断层图象，动态扫描记录、图像处理及,三维立体构建,、,成份分析,等软件。,原理简介,激光共聚焦显微镜构成,激光器,光电倍增管,检测器,显微镜,步近器,计算机,电子图像,软件,共聚焦显微镜的特点,光源,共聚焦技术,点扫描技术,信号放大 电子图像,软件,共扼聚焦原理图,激光器,扩光器,样品,滤光片,针孔,检测器,入射光,发射光,长通滤光片,入射光,发射光,长通滤光片,激光器,扩光器,样品,滤光片,针孔,检测器,入射光,发射光,长通滤光片,激光器,扩光器,样品,滤光片,针孔,检测器,普通光学显微镜与激光共聚焦显微镜的区别,3,、点与面扫描技术,共聚焦显微镜：将样品分解成二维或三维空间上的无数点，用十分细小的激光束（点光源）,逐点逐行扫瞄、成像,，通过计算机软件组合，最后得到一个整体平面的或立体的像。普通光镜：是在可见光源下一次性成像。,4,、图像信号及处理：,光电倍增管放大信号，计算机采集和处理光信号。计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像，得到的图象是数字化的，可以在电脑中进行处理，再一次提高图象的清晰度。,共聚焦显微镜的应用,高清晰成像,半定量荧光强度分析,荧光探针表达量测定,分层扫描,多种荧光标记同时检测,荧光标记物绝对定量分析,扩展应用,高清晰成像,激光共聚焦显微镜因使用共扼光路使非焦平面的光线被抑制，减少了成像的干扰，以及使用光色较纯的激光，所以成像分辨率可达普通光学显微镜的,1.4,倍。,可以清晰的表现某些细微结构。,人眼分辨率：,0.2mm,光学显微镜分辨率：,0.25mm,电子显微镜分辨率：,0.2nm,共焦显微镜分辨率：,0.18mm,牛肺动脉内皮细胞,，,微管,高清晰成像,牛肺动脉内皮细胞，,微管,高清晰成像,鼠成纤维细胞,单克隆,anti,-tubulin,标记,高清晰成像,检测人类癌细胞表皮生长因子,高清晰成像,培养的,293,细胞绿色荧光蛋白,高清晰成像,培养的人肝癌细胞哑叮橙染色,高清晰成像,透射光扫描（,DIC,）,利用激光透射扫描成像，用特殊滤光片达到相差显微镜的效果，可获得清晰的具有,立体感,的图片,树突状细胞,培养细胞,荧光表达量测定,Sunil S et al.,Extracellular polymeric substances and structural stability,of aerobic granule,Water Research,42(2008)16441650,分层扫描（切片扫描）,按,共扼聚焦,的原理，通过调节针孔的大小，可控制样品扫描层面的厚度。即样品中相当薄的一层被探测到，而其他层面不影响成像。,分层扫描（切片扫描）,当观测较厚样品时，普通透射光不能透过样品，则可以通过切片扫描检测荧光的方法来观测。,入射光,被检测层面,整个样品,白光（不能透过）,发射光,分层扫描（切片扫描）,较厚层面 较薄层面,人血管内皮细胞,PI,标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。,分层扫描（切片扫描）,较厚层面,（平滑肌损伤可见）,较薄层面,兔动脉血管内皮细胞,PI,标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。,分层扫描（切片扫描）,连续分层扫描，可得到,CT,片类似的效果，对样品,Z,轴的结构进行分析。经计算机数据重组，可观测,空间结构,，,空间定位,，,三维重组,。,利用专用,图象处理软件,，还可以实现其他许多数据分析。,植物切片三维重建,多色荧光标记检测,普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光，要观测多种荧光标记的样品需要多次观测，对样品损伤大。激光共聚焦显微镜可以多激光多通道同时扫描，多通道同时探测。,Mouse 3T3 cells,红色：,ethidium homodimer1,，染核,绿色：,BODIPY FL phallacidin,，染肌丝蛋白,牛肺动脉内皮细胞,蓝色：,Hoechst 33342,染,DNA,红色：,PI,，染核仁,RNA,绿色：,Alexa Fluor 488,染肌丝蛋白,藤黄微球菌,绿色：活菌,红色：死菌,染色：,LIVE/DEAD,Bac,Light Bacterial Viability Kit,猴胚肾细胞内弓形虫繁殖,吖叮橙染色,绿色为,DNA,红色为,RNA,激光共聚焦显微镜的,优势,在结构方面,激光做光源，光色纯，波长固定，成像效果好，分辨率高，图象清晰，荧光检测信噪比高,可实现分层扫描,可实现连续扫描，可动态记录变化,可多根激光管同时扫描，多色荧光同时成像,扫描速度快，对样品损伤小,激光共聚焦显微镜的优势,在应用方面,形态观察,-,高清晰成像,半定量,-,荧光强度分析,荧光探针表达量测定,定位研究,-,分层扫描,多种荧光标记同时检测,荧光标记物绝对定量分析,扩展应用,-,如，,FRAP,法、细胞切割、细胞筛选等,激光共聚焦显微镜的,优势,在效果方面更灵敏：,共聚焦显微镜采用了光电倍增技术，可将很微弱的荧光信号放大。只要有信号就能被检测到。,定位更精确：,不仅可以定位到细胞水平，还可以定位到亚细胞水平、和分子水平。这也是荧光标记的抗体被称为分子探针的原因,定量测量：,静态的定量测量,对于不同组的样品，可以单纯比较一种成分，也可以同时比较两种甚至三种成分。也可以在同一张切片上比较不同成分含量。,动态的定量测量,共聚焦显微镜还能对,活细胞内的特定成分,（如：钙、钠、氢等）进行动态变化测量，并给出动态变化曲线；还可以同时测量几种成分，并给出含量比值。,激光共聚焦显微镜的,优势,在效果方面,快速性：,由于利用光源光束点扫描，检测过程快，时间短，计算机精确控制激发光强度，光漂白和荧光淬灭作用很小。,数据图像可及时输出或长期储存：,用计算机代替了普通的照相机，得到的图像是数字化的，不存在暴光方面及胶卷冲洗方面的问题（如荧光太弱，无法暴光；或曝光过程中荧光淬灭等）；而且图像可进一步加工处理。,激光共聚焦显微镜的,优势,在效果方面,共聚焦显微镜应用领域,（一）细胞生物学：细胞结构：细胞骨架，细胞膜结构、流动性、受体，细胞器结构和分布变化，细胞凋亡、细胞周期等。,（二）生物化学：酶、核酸、荧光原位杂交、受体分析。,（三）药理学：药物对细胞的作用及其动力学分析。,（四）生理学：膜受体，离子通道，细胞内离子含量、分布及其动态分析,。,共聚焦显微镜应用领域,（,五）遗传学和胚胎学：细胞生长、分化，细胞组织的三维结构，染色体分析，基因表达，基因诊断,（六）神经生物学：神经组织、细胞结构，神经递质的成分、运输和传递，递质受体，离子内外流。,（七）微生物学和寄生虫学：细菌、寄生虫形态结构（表面和内部结构）；,（八）病理学研究及病理学临床诊断：活检标本的快速诊断，肿瘤诊断，自身免疫性疾病的诊断，宫颈上皮细胞涂片诊断,Bing-Jie Ni at al.,Microbial and Physicochemical Characteristics of Compact,Anaerobic Ammonium-Oxidizing Granules in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket,Reactor,APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,76(2010)26522656,CLSM imaging of activated sludge A(2 days of anaerobic starvation at 4 1C)(a)and sludge B(5 days of,anaerobic starvation at 41C)(b).,C.Lopez et al.,Evaluation of microscopic techniques(epifluorescence,microscopy,CLSM,TPE-LSM)as a basis for the quantitative,image analysis of activated sludge,Water Research 39(2005)456468,我的实验计划,微生物分布,污泥结构三维重构,污泥分层结构,