基因工程5-PCR.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,DNA-生命的蓝图,Kary B.Mullis,(1944-),，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。他原本是要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用,两个,引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法.,很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖，Mullis是其中之一,Mullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成.DNA，,第一节 PCR技术原理和工作方式,一、PCR的基本原理,引物,dNTP,耐热,DNA,聚合酶,模板,DNA,变性（,denaturation,）：,90,98,；,退火（,annealing,）：,37,72,；,延伸（,extension,）：,72,。,基本要素,扩增步骤,5-GGTATCAT-3,3-CCATAGTA-5,5GGTA-OH（引物1）,5 ATGA-OH（引物2）,9098,3-CCATAGTA-5,5-GGTATCAT-3,3772,3-CCATAGTA-5,5-GGTATCAT-3,5GGTA-OH,OH-AGTA5,7075,5-GGTATCAT-3,3-CCATAGTA-5,5-GGTATCAT-3,3-CCATAGTA-5,9098,3772,3-CCATAGTA-5,5-GGTATCAT-3,5GGTA-OH,OH-AGTA5,7075,5-GGTATCAT-3,3-CCATAGTA-5,5-GGTATCAT-3,3-CCATAGTA-5,3-CCATAGTA-5,5-GGTATCAT-3,(略),(底物DNA),(略),(略),PCR扩增特异性DNA片段全过程,二、PCR反应体系,1、脱氧核苷三磷酸（dNTP）,dATP、dGTP、dCTP、dTTP是PCR的原材料，通过PCR过程聚合成互补链DNA。,贮存浓度：2.5mM,使用浓度：200,M,使用浓度不当会影响扩增的产量、特异性和保真度。,2、缓冲液（buffer）,标准10,：140mM Tris-HCl（pH8.8）,48mM MgCl,2,40mM (NH4),2,SO,4,30,g/ml BSA,16mM DTT,不同厂家生产的DNA聚合酶所用到的buffer不同。,3、引物（primer）,最佳引物使用浓度为0.1,M 1.0 M 之间。引物浓度太低，扩增产物太少；引物浓度太高，易出现非特异性扩增反应。,一般贮存浓度：10,M,使用浓度：0.4 M,引物设计要求:,设计的引物的核苷酸序列必须与模板链,3,端的一段核苷酸序列互补,且,3,端必须有游离的,-OH,基团；,引物一般由,2030,个核苷酸组成，,4,种核苷酸尽可能随机分布，,GC,含量应达,4060%,；,引物中应尽量避免回纹序列出现；,引物中最好含有进一步操作中可利用的限制性核酸内切酶识别序列。,Tm（解链温度）值的计算公式：,引物长度,20nt时：Tm=4（G+C）+2（A+T）,引物长度20nt时：Tm=81.5+0.41（GC）%,600/L,PCR过程中选择退火温度时，一般为（Tm 5）,4、模板DNA,作为PCR 的靶DNA一般是一个待扩增的特定双链DNA片段，应知道其两端2030bp的核苷酸序列，供设计一对引物之用。PCR的模板是一条单链DNA片段，其3端具有与引物杂交的序列。,5、耐高温DNA聚合酶,Taq,DNA,聚合酶,来自嗜热古细菌,Thermus aquaticus,。该菌1967年从温泉中分离，最适生长温度70。现市场上销售的是该基因在E.,coli,细胞中的表达产物。,特征,：,相对分子质量为9410,3,，为单分子酶，具较强的53DNA聚合酶活性和较弱的53外切酶活性，缺乏3 5外切酶活性。最适pH9.0，最适反应温度75。合成出错几率8.9,10,-5,1.1,10,-4,。,Pwo,DNA,聚合酶,来自喜温性古细菌,Pyrococcus woesei。,现市场上销售的是该基因在E.,coli,细胞中的表达产物。,特征：,相对分子质量为9010,3,，具较强的53DNA聚合酶活性，兼35外切酶活性。耐热性更高，保真度比,Taq,DNA聚合酶高10倍。,Tth,DNA,聚合酶,来自喜温性真细菌,Thermus thermophilus,HB8。具较强的53DNA聚合酶活性，缺乏3 5 外切酶活性。最适pH9.0，最适反应温度75。Mg,2+,存在时，以DNA为模板合成DNA，Mn,2+,存在时，可以RNA为模板合成cDNA，用于RT-PCR系统。,Vent DNA,聚合酶,来自嗜热高温球菌,Thermococcus litoralis,。相对分子质量8510,3,。100时该酶半衰期为1.8hr，具有3 5 外切酶校对活性。合成的准确度比用,Taq,DNA 聚合酶高5,15倍。,Pfu,DNA,聚合酶,来自激烈热球菌,Pyrococcus fariosus。,保真度较高。,KOD,DNA,聚合酶,特征：,具有强力的35核酸外切酶活性，与Taq DNA聚合酶相比，保真度比后者高50倍左右。合成速度比Taq DNA聚合酶快2倍，比Pfu DNA聚合酶快6倍。耐热性比Taq DNA聚合酶好，在100、1小时的热处理后仍可保持约70的活性，故根据需要可以将热变性步骤的温度设定值提得更高，这对处理GC含量高的模板等具有特异性高级结构的样品非常有利。,高保真,DNA,聚合酶,Pfx50,高保真,DNA,聚合酶,(,Invitrogen,),Phusion,高保真,DNA,聚合酶,(,Finnzymes,),Phusion采用一种新的蛋白融合技术，与一种独特的双链DNA结合蛋白融合后，可以和模板更加紧密的结合，触发更为强劲和快速的扩增，它甚至可以用于结合那些最难被结合的模板,持续扩增能力（processivity，决定最大扩增长度）是Pfu酶的10倍，Taq酶的2倍。,优点：,a.反应速度大大加快；,b.扩增更加强劲，产率更高；,c.非常适合对长片段进行扩增。,d.保真度高，,出错率比Taq酶低50倍，比Pfu酶低6倍,。,Phusion DNA聚合酶的结构示意图：双链的DNA结合结构域（紫色）被融合到一个新的类似于Pfu的酶上（绿色）,商用混合,DNA,聚合酶,为了提高扩增的保真度或扩增较长DNA片段，将Taq DNA聚合酶的强启动能力和具有35外切酶活性高温DNA聚合酶的高持续活性和校正功能结合起来，可以达到很好的效果。,例如：,Ex,Taq,DNA,聚合酶,Ex,Taq,Hot start DNA,聚合酶,LA,Taq,DNA,聚合酶,LA,Taq,Hot start DNA,聚合酶,三、PCR反应程序,1、常规程序,9098,预热30sec5min；,9098 变性15 30sec；,40 60 退火30sec；,72 延伸1min（1kb）；,72 延伸7 10min；,4 保存。,2035,循环,2、复性（退火）和延伸温度,3、反应时间,4、循环次数,5、PCR反应液的配制,反应底物和产物在DNA扩增中不断发生变化，最终将会导致聚合反应进入,平台期,，平台期出现的时间与聚合酶的特性有关。研究表明，利用Klenow片段进行20次扩增后进入平台期，累积产物拷贝数为210,5,，当采用Taq DNA聚合酶时，扩增25次后才进入平台期，拷贝数可达410,6,。,出现平台期的原因可能有：,后期循环酶浓度或聚合时间不足；,引物耗尽；,dNTP耗尽；,产物浓度过高，以致dsDNA解链后又迅速退火，不能与引物结合。,第二节 PCR产物的克隆,一、在PCR产物两端添加限制性酶切位点,为了使 PCR 产物能够方便的装载到克隆载体上，可在扩增的过程中在其两端添加,限制性酶切位点,。在设计引物时，除了考虑正常的特异性序列外，在引物的 5 末端添加酶切位点的序列以及保护序列。在选择酶切位点的种类时，要保证所选的酶切位点在扩增的 DNA 片段内部不存在。如果对扩增的 DNA 片段的序列不清楚，可优先选用切割频率相对较少甚至酶切位点为 8 个碱基序列的酶切位点。,二、A/T克隆法,Taq,DNA 聚合酶具有,末端转移酶的活性,，可在 DNA 片段的 3 末端添加一个核苷酸，通常为 A。因此，,Taq,DNA 聚合酶扩增的产物可与 T-载体进行粘端互补连接，达到高效克隆的目的。T-载体最初由 Promega 公司开发出商品，并一直沿用到现在。这些载体特点是，将普通的克隆载体切成线状，并使之在 3 末端含有一个凸出碱基 T。,在 DNA 的 3 末端添加一个 T 碱基的方法有很多，如用末端转移酶和底物 ddTMP 可以产生单个 T 的突出末端；有些识别不对称序列的限制性内切酶，如,Mbo,、,Xcm,和,Hph,，在切割 DNA 后可直接产生一个 3 突出的 T；用,Taq,DNA 聚合酶和高浓度的 dTTP 也可产生 3 突出的 T。,A/T 克隆法现在也有了新的发展，Invitrogene 公司开发了一种将,拓扑异构酶,与 T-载体相结合的 PCR 产物快速克隆系统 pCR-TOPO，无需 DNA 连接酶做连接。从 Vaccinia 病毒来的拓扑异构酶可以结合在双链 DNA 的特异位点上，并可在一条链上于 5-CCCTT 序列之后打开磷酸二酯键，释放出的能量可催化 DNA 切口处的 3 磷酸基团与拓扑异构酶 的第 274 位的酪氨酸（Tyr）残基共价结合，同样这个共价键又会受到切口处 5 羟基的攻击，进行可逆反应，恢复切口处磷酸二酯键，重新将 DNA 连接起来。pCR-TOPO 载体就是根据拓扑异构酶 的这一性质来开发的，pCR-TOPO 载体也是一种 T 载体，只是在其 3末端的突出 T 上共价结合了一个拓扑异构酶 ，当带 3 末端的突出 A 的 PCR 产物与该 T 载体互补配对时，拓扑异构酶 就将该缺口连接起来。,pCR-TOPO 载体的工作模式图,pPCR-Script Amp SK（+）克隆载体,该载体从 pBluescript SK（+）噬菌粒改造而来，只是将多克隆位点中的,Xba,和,Spe,位点改成,Srf,位点（GCCC/GGGC）。克隆 DNA 片段时，先将载体用,Srf,切成线状，再与目标 DNA 片段混合作连接反应。在连接体系中除了添加,T4 DNA 连接酶,外，还加入,Srf,酶。在这个反应体系中，当载体发生自连后，,Srf,酶又会将其切开，载体就处于酶切与连接的动态平衡中。只有当载体与目标 DNA 片段连接后，酶学反应才能稳定下来，从而将总体的反应平衡向载体与目标 DNA 片段连接这个方向倾斜。,用于克隆具3-5外切活性的DNA聚合酶扩增的PCR产物.,三、平末端DNA片段的克隆,pPCR-Script Amp SK（+）酶切与连接动态平衡示意图,pCR,-Blunt,克隆载体,pCR,-Blunt,是另一种用于提高克隆平末端片段效率的载体，该载体最大特点是在,lacZ,基因的下游融合了一个,ccdB,基因，该基因对大肠杆菌是致死的。该载体大小为,3.5kb,，含卡那霉素抗性基因和,Zerocin,抗性基因。在克隆外源平末端,DNA,片段时，先将该载体切成线状，再与目标,DNA,连接，转化大肠杆菌。如果载体发生自连，获得这些载体的大肠杆菌宿主细胞就会死亡，只有当外源,DNA,片段与载体连接后，,ccdB,基因的表达受到阻断，重组质粒才能在大肠杆菌中存在下来。,ccd,:control of cell division，抑制细胞分裂系统。,ccdB蛋白：细胞毒性蛋白，干扰DNA旋促酶的活性。,ccdA蛋白：ccdB蛋白的抑制蛋白。,第三节 PCR扩增未知DNA片段,染色体步查：,指从生物基因组或基因组文库中的已知序列出发，逐步获得或探知其相邻的未知序列或与已知序列呈共线性关系的目的序列的核苷酸组成的方法和过程。,反向,PCR,利用接头的,PCR,热不对称交错,PCR,1、反向PCR（inverse PCR）,当一个未知序列位于已知序列的上游，为了扩增该未知序列，一般可用已知靶序列的一个引物（即与3端互补的引物）进行单向PCR线性扩增。而反向PCR技术则可利用两个靶序列引物对未知片段进行常规PCR扩增，反向PCR包括以下三步：,用限制性内切酶消化待测线性,DNA,模板；,使酶切后的线性,DNA,连接成环状；,用与已知序列两端互补的一对引物进行,PCR,循环，扩增出未知序列。,反向PCR原理示意图,2、利用接头的PCR,主要用于mRNA的PCR扩增,3、热不对称交错PCR,（thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR）,一种利用随机引物进行染色体步查的技术。,在利用特异引物和随机引物进行PCR中一般有3种产物生成：,由特异性引物和简并引物扩增出的产物；,由同一特异性引物扩增出的产物；,由同一简并引物扩增出的产物。,在,TAIL-PCR,反应中，后,2,种目标产物可通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应来消除。,TAIL-PCR,的基本原理：,利用目标序列旁的已知序列设计,3,个嵌套的特异性引物,(,specialprimer,，简称,sp1,，,sp2,，,sp3,，约,20bp),，用它们分别和,1,个具有低,Tm,值的短的随机简并引物,(,Arbitrarydegenerate,prime,，,AD,，约,14bp),相组合，以基因组,DNA,为模板根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物。,第四节 与反转录相关的PCR,反转录 PCR(Reverse transcriptase-PCR，RT-PCR)：,是一种将cDNA合成与PCR技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法，主要用于对表达信息进行检测或定量分析,还可以用来检测基因表达差异而不必构建cDNA文库克隆cDNA。,RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。,在实际应用中，RTPCR又常常分为一步法RTPCR和两步法RTPCR。,一、cDNA末端的快速扩增,（rapid amplification of cDNA end，RACE）,RACE只需知道mRNA内很短的一段序列即可扩增出其cDNA的5(5RACE)和3端(3RACE)。该法的主要特点是利用一条根据已知序列设计的特异性引物和一条与 mRNA的PolyA(3 RACE）或加至第一链cDNA3端的同聚尾(5RACE)互补的通用引物，由于同聚体并非良好的PCR引物，同时为了便于RACE产物的克隆，可向同聚体引物的5端内加入一内切酶位点。所用的cDNA模板可以使用多聚dT引物延伸合成(3，5-RACE均可)。,二、差异显示PCR,（Differential Display PCR，DD-PCR）,DD-PCR是一种用于检测相似生物材料的基因表达谱差异的一种方法。生物的不同组织器官、不同的发育阶段、不同的生理状态以及基因突变或外源基因导入都会导致基因表达谱的变化，DD-PCR可以检测几乎所有表达的基因，是鉴定基因表达差异的最灵活和最完善的方法。,优点：,快速、方便,可以检测表达量极低的mRNA，但其技术条件要求较高，所扩增的mRNA的质量不能有差异,即mRNA不应降解。目前这一方法已广泛应用于生物表型相关基因的克隆及比较研究。,基本原理：,所有真核生物的成熟mRNA都含有不同长度的poly(A)尾巴,根据poly(A)内部的2个核苷酸排列的不同,可以将所有的mRNA分子分为12类（见左图）。,根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即MNTTTTTTTT,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成12种cDNA，然后再用随机引物,以这12种cDNA分别做模板进行PCR扩增（见中图和右图），那么与表型相关的mRNA就很容易被发现并克隆出来。,DD-PCR示意图,箭头所示为特异扩增产物,第五节 PCR产生DNA指纹,通过PCR技术可以方便快捷地鉴定生物样品中是否含有特定的DNA序列，从而广泛用于物种或品系的鉴定，以及临床样本的诊断、病原物的污染鉴别和法医鉴定等。最简单的就是设计一对或几对引物，通过PCR扩增来检测样品中特定DNA的存在。但在许多情况下通过一对或几对引物的PCR扩增难以对遗传背景相似或相近的样品进行区分或做出鉴定。通过特定的引物设计或扩增方式来产生样品DNA指纹图谱，在一定程度上可以解决这个问题。,一、随机扩增多态性DNA,（random amplified polymorphic DNA，RAPD）,在常规 PCR 扩增中所用的引物一般是序列特异性的，是针对某个基因或 DNA 序列而设计的。其长度一般 20 nt左右。随着引物的长度缩短，在基因组 DNA 上出现与之互补配对序列的几率进一步增加，用于 PCR 扩增后产物的数量也随之增加。当引物的长度缩短到一定程度后，单一引物就可以扩增出多个 DNA 产物。根据这一现象，美国杜邦公司的 Willianms 等人于 1990 年设计出一种建立随机扩增多态性 DNA，即 RAPD 的方法。,原理：,以人工合成的的随机寡核苷酸（通常为910nt）片断为引物，以基因DNA为模板进行PCR扩增，这样这一引物介导DNA成几何级数扩增，不同个体之间出现遗传上的多态性。所得的多态性DNA经琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，表现出用EB染色或银染即可检测的扩增产物。,优点：,引物不需要特异基因组结构，合成一套引物可用于不同种群的基因组分析；,需要的DNA量少(2550ng)；,简单，易操作，易实现自动化；,标记没有放射性（染色常用溴化乙锭或银染）；,周期短，成本低；,标记数目多。,缺点：,RAPD为显性标记，不能提供完整的信息；,易受实验条件影响；,稳定性差；,结果不能区分纯合体和杂合体。,应用：,用于遗传图谱的建立，与统计学结合也可用于遗传关系分析，但是鉴于RAPD一些缺点，使它不能用于许多带有高度信息的更便于应用的变异种群的分析当中。因此，RAPD技术有待进一步的发展。,二、扩增片段长度多态性,（amplified fragment length polymorphism,AFLP）,AFLP分析是针对基因组 DNA 的限制性酶切片段进行选择性 PCR 扩增从而建立 DNA 指纹的技术，属于以 PCR 反应为基础的分子标记。与 RAPD 相比，结果的重复性进一步提高，蕴藏的信息以及指纹的精度也进一步加大。,原理：,首先将基因组 DNA 以两种限制性内切酶完全切割，然后将合成的并与这两个限制酶产生的末端相对应的接头与酶切 DNA片段的两端连接。然后以含有接头序列和酶切位点序列的引物，对连接产物作 PCR 扩增。最后利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行 PCR 产物分离，从而产生 DNA 指纹。,AFLP反应程序主要包括,模板DNA制备,，,酶切片段扩增,及,凝胶电泳分析,这3个基本步骤。各步骤具体的过程有：,1.首先制备高分子量(HMW)基因组DNA，选择6个碱基识别位点的限制性内切酶(通常是,Eco,RI或,Pst,I或,Sac,I)。,2.酶切后的限制性片段在T4连接酶的作用下与特定的接头相连接，形成带有接头的特异性片段。,3.DNA片段的预扩增。,4.在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的选择性扩增。,5.PCR产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上电泳。,6.多态性比较分析，特异片段回收克隆分析。,AFLP的缺点：,此技术受到专利保护，应用受到限制，试剂盒价格昂贵。,操作中常要利用同位素标记，对样品,DNA,质量要求严格。,AFLP反应流程：,AFLP原理示意图,