微生物学与生物技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1、微生物的概念：,一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称。,它们都是一些个体微小（一般 0.1mm）、构造简单的低等生物(单细胞或结构较为简单的多细胞生物、甚至没有细胞结构的生物)。,一、什么是微生物,2、微生物类群,细胞型：,原核：,细菌、古生菌、放线菌、蓝细菌、支,原体、立克次氏体,真核：,真菌、显微藻类、原生动物,非细胞型：病毒、类病毒和朊病毒,细菌,个体小、结构简、胃口大、食谱广、繁殖快、易培养、数量大、分布广、种类多、级界宽、变异易、抗性强、休眠长、起源早、发现晚,3、微生物的特点,1、小,个体微小,m级:光学显微镜可见（细胞）；,nm级:电子显微镜下可见（细胞器、病毒）。,2、简,构造简单,单细胞、简单多细胞、非细胞（分子生物）。,3、低,进化地位低,微生物的“生物界之最”,个体最小,形态最简,胃口最大,食谱最广,繁殖最快,数量最多,变异最易,抗性最强,休眠最长,种类最多,分布最广,起源最早,发现最晚,界级最宽,基因工程,基因操作的基本步骤,二、,DNA,重组技术的基本工具,1.分子手术刀限制性核酸内切酶,2.分子缝合针DNA连接酶,3.分子运输车运载体,1.“分子手术刀”限制性核酸内切酶（简称限制酶）,大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶,能识别GAATTC序列,，并在,G和A,之间切开。,限制酶,“分子手术刀”限制性核酸内切酶,限制酶,黏性末端：被限制酶切开的DNA两条,单链的切口,，带有几个,伸出的核苷酸,，他们之间正好,互补配对,，这样的切口叫,黏性末端,。,平末端,：,当限制酶,从识别序列的中心轴线处切开时，,切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,限制性核酸内切酶,1.特点,：,特异性，即一种酶只能识别特定核苷酸序列，并在特定的切点使,两个核苷酸之间的,磷酸二酯键,断开,。,2.分布,：,主要在微生物(原核生物)中。,3.结果,：,产生,黏性末端,（碱基互补配对）或,平末端,。,4,.种类,：4000种,5,.举例,：,大肠杆菌的一种限制酶（EcoR,),能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开形成黏性末端，Sma,能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切割形成平末端,。,1.要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？,思考：,要切两个切口，产生四个黏性末端。,2.如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就可以合成重组的DNA分子了。,2.“分子缝合针”DNA连接酶,DNA连接酶可把黏性末端之间的,缝隙“缝合”,起来，是把梯子两边扶手的断口,磷酸二酯键,连接起来，这样一个重组的DNA分子才能形成。,DNA连接酶根据来源不同分为两类：,1.从大肠杆菌中分离得到：,E.,coli,DNA,连接,酶，只能将双链DNA片段互补的,黏性末,端,之间连接。,2.从T,4,噬菌体中分离到：T,4,连接酶，既,可以“缝合”双链DNA片段互补的,黏性末,端,，又可以“缝合”双链DNA片段的,平末,端,，但连接平末端之间的效率比较低。,A,A,T,T,G,C,C,T,T,A,A,G,DNA连接酶和 DNA聚合酶的异同：,基因工程中所用的连接酶有两种：从大肠杆菌中分离得到的E,coli连接酶、从T,4,噬菌体中分离得到的T,4,连接酶。这两种酶的催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，不能连接单链DNA。连接酶和聚合酶的作用都是形成磷酸二酯键。,DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的3末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。,DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成子链；而连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，因此连接酶不需要模板。,两者都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。,3.,“,分子运输车”,运载体,1.作用：,2.,条件,：,3.种类：,质粒,、噬菌体和动植物病毒。,4.,质粒的特点,能将外源基因送入细胞的工具就是,运载体,。,将外源基因送入受体细胞。,作为运载体必须具备哪些条件？,1.能够在宿主细胞中,复制并稳定地保存,。,2.具,多个限制酶切点,，以便与外源基因连接。,3.具有某些,标记基因,，便于进行,筛选,。,如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。,大肠杆菌的质粒：,最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如抗四环素的标记基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内进行。,质粒的特点,：,1.细胞染色体（或拟核DNA分子）外能自主复制的小型环状DNA分子；,2.质粒的存在对宿主细胞无影响；,3.质粒的复制只能在宿主细胞内完成。,原核细胞的基因结构,原核细胞基因,编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的合成，即能够编码蛋白质,非编码区（调控序列）：位于编码区上游和编码区下游的DNA序列，虽不能指导有关蛋白质的合成，但有调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等,启动子与终止子,启动子,是在非编码区内紧靠转录起点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序 列，它能引导RNA聚合酶与正确的基因部位结合，使转录从起点开始，沿编码区进行。,终止子,是在非编码区内紧靠转录终点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。,RNA,聚合酶的作用是催化DNA转录为RNA。它能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并与DNA分子的一条链为模板合成RNA。,思考：,RNA聚合酶结合位点和RNA聚合酶的作用分别是？,真核细胞的基因结构,真核细胞基因,编码区,（间隔、不连续）,外显子：能编码蛋白质,的DNA序列,内含子：不能编码蛋白,质的DNA序列,非编码区：与原核生物具有相似功能,的启动子、终止子,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是,连续的,编码区是间隔的、不连续的,相同点,都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成的,基因的种类,（1）编码蛋白质的基因：包括结构基因和调节基因。,（2）没有转译产物的基因：如rRNA基因和tRNA基因。,（3）不能转录的DNA片段：如操纵基因。,基因工程的基本操作程序,获取目的基因,构建表达载体,导入受体细胞,目的基因检测与鉴定,第一步,第二步,第三步,第四步,一、目的基因的获取,1.从基因文库中获取目的基因,(1)基因组文库,将含有某种生物不同基因的许多片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。,受体菌包含了某种生物所有的基因，该受体菌群体称为这种生物的基因组文库。,(2)部分基因文库,受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体称为这种生物的部分基因文库，如cDNA文库。,基因文库的构建:,（1）基因组文库的构建,提取某生物,全部DNA,用适当,限制酶切割,许 多,DNA片段,与载体连接,导入受体菌群,该生物基,因组文库,（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）,（2）cDNA文库的构建,mRNA反转录形成,mRNA,逆转录酶,杂交双链,核酸酶H,单链DNA,DNA聚合酶,双链DNA,与载体连接,导入受体菌群,该生物,cDNA文库,2.化学合成目的基因DNA片段,DNA合成仪,蛋白质的氨基酸顺序,mRAN,核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的,基因,推测,推测,合成,当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用通过DNA合成仪直接合成目的基因。,3.利用PCR技术合成DNA,原理:,DNA双链复制,前提:,要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。,利用PCR技术扩增目的基因,4.mRNA反转录成cDNA,第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。,第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。,第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。,二、构建表达载体,表达载体的组成,目的基因,启动子,终止子,标记基因,基因工程载体的构建需要考虑哪些因素,1.基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不,能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不,同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的,cDNA。基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生,物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因,为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无,这些细胞器。,2.要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择,强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基,因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择,种子中特异表达的启动子。,3.要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因,生物。,4.在宿主细胞中能独立自主地复制，易分离纯化。,5.载体在DNA分子中有一段不影响他们扩增的非必需区域。,启动子,：RNA聚合酶识别和结合的一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，RNA聚合酶与之结合才能驱动基因转录出mRNA，进而获得需要的蛋白质。,终止子 ：,一段特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，作用是使转录在所需要的地方停止。,标记基因 ：,鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。,质粒,目的基因,限制酶,DNA连接酶,重组,DNA,三、将目的基因导入受体细胞,1.显微注射法（动物细胞）,显微注射法：,先提纯目的基因，再在体外注射入卵细胞或受精卵中，最后将含目的基因的受精卵移植到输卵管或子宫中发育成新个体。,2.导入大肠杆菌：,先用Ca,2,+处理成感受态后与溶有载体DNA的缓冲液混合,吸收DNA分子，完成转化。,3.农杆菌转化法（双子叶植物和裸子植物植物）,基因枪法（单子叶植物）和花粉管通道法,基因枪法：将直径,4um,的钨粉或金粉在供体,DNA,中浸泡，然后用基因枪将这些粒子打入细胞、组织或器官中，具有一次处理多个细胞的优点，但转化效率较低，另外这种方法也用于基因治疗和抗体制备，并已取得初步成效。,花粉管通道法：在授粉后向子房注射混合目的基因的,DNA,溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源,DNA,导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。,四、目的基因的检测与鉴定,目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。,常用的检测手段主要从分子水平和个体水平进行。,（一）分子水平,1.检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因,提取受体生,物全部DNA,适当限制,酶切割,DNA片段,用同位素标记的,目的基因片段杂交,显 出,杂交带,（表明目的基因已插入）,分子杂交技术,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,2.检测目的基因是否转录出了mRNA,提取受体生,物的mRNA,用同位素标记的,目的基因片段杂交,显 出,杂交带,（表明目的基因已转录出了mRNA）,检测DNA利用的是DNA与DNA杂交，检测mRNA利用的是DNA与mRNA杂交。,3.检测目的基因是否翻译出蛋白质,抗原抗体杂交技术,提取受体生,物的蛋白质,与相应抗体杂交,显 出,杂交带,（表明目的基因已形成蛋白质产品）,（二）个体水平,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,