本科生《P》3-第三章载体3-12.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 基因工程载体,教学目的与要求：,1）,掌握基因工程常用载体特点,2）,掌握基因克隆的基本方法,1,第一节 载体的定义,2,载体（Vector）,是指在寄主细胞内能自我复制，并能够作为运输载体将重组DNA分子转移到寄主细胞的DNA分子。（A DNA molecule that is capable of replication in a host organism,and can act as a carrier molecule for the construction of recombinant DNA.）,基因克隆载体：,能承载外源DNA带入受体细胞，并在其中自我复制以维持和扩增外源DNA的一类DNA分子，又称为DNA克隆载体。,基因表达载体,Require in a vector:,Cloning sites,Origin of replication,Selectable marker,Safety,载体应该具备记到主要条件，以pBR322为例进行说明：,1克隆位点:在DNA分子合适的位置有1到多个克隆位点，可供外源DNA片段插入克隆载体DNA分子中。,2复制起点：具有复制起点，外源DNA插入载体后，仍可由复制起点起始复制过程。,3筛选标记基因：具有用于选择克隆子的标记基因。,4安全性：克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，且不能转入除受体细胞以外的其他生物细胞，尤其是人的细胞。,拷贝数：,一个寄主细胞中某种,质粒,的数量与染色体数量之比。一般寄主细胞只有一套染色体。,按照拷贝数的多少，可以将质粒划分为,严紧型质粒和松弛型质粒,。当拷贝数在1-10之间时，通常称为严紧型质粒。很多大质粒是严紧型质粒。当拷贝数多于10个时，通常称为松弛型质粒，小质粒一般是松弛型质粒。,严紧型质粒和松弛型质粒之间没有严格界限。,某种质粒对于某种寄主来说，拷贝数一般是一定的，拷贝数的存在是因为质粒上存在,cop基因,，它可以指令寄主细胞合成阻遏物，当质粒复制到一定拷贝数后，阻遏物也达到一定量，就阻遏质粒进一步复制。,Number of Copies：,一个寄主细胞中某种质粒的数量与染色体数目的比值。,Based on the number of copies of the plasmid found in the host cell:,low copy number plasmids,stringent(严紧型)control of DNA replication,High copy number plasmids,relaxed plasmid(松弛型),按照是否含有trans基因将质粒分为,结合型质粒和非结合型质粒,。,Trans基因是一种可以指令寄主细胞产生鞭毛，合成细胞表面物质，促使寄主细胞与其他细胞相接合，导致遗传物质从一个细胞转移到另一个细胞。我们把含有trans基因的质粒称为结合型质粒，把不含有trans基因的质粒称为非结合型质粒。,在基因工程中我们一般选用什么样的质粒？,松散型、非结合型,质粒的命名：,p，plasmid表示质粒，随后的两三个大写字母表示谁发现和发明了该质粒，数字表示质粒分离的次数或者构建的一系列质粒的编号。,例：pBR322,二、质粒克隆载体,质粒经改造后即可成为基因工程载体。如前述pBR322，载体需有克隆位点和标记基因。标记基因种类很多：,1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子）,a.抗生素抗性基因:Apr，Tcr，Kanr，G418r，Hygr，Neor,b.重金属抗性基因:Cur，Znr，Cd r,c.代谢抗性基因:抗除草剂基因,2）营养标记基因（可直接用于选择转化子）。主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因，这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。,3）生化标记基因。其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ,GUS,CAT。,葡萄糖苷酸酶基因（GUS）,该基因编码一种可分解各种-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。该标记基因除具有上述lacZ基因的优点外，它的适用范围十分广泛，因为许多生物中没有这种基因。,荧光素酶基因,荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发光细菌（,Photobacterium fischeri,）产生的荧光素酶，它与FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。,发光蛋白质基因,发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠杆菌菌落呈蓝色。,半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZ）,半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：链和链。前者负责四聚体装配，后者具半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为-互补作用。这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为链编码的基因称之为lacZ(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZ）均可作为标记基因。,半乳糖苷酶基因的优点:,a.,酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观,b.,lacZ编码5-端可容许很大的变化而不影响酶活性,c.lacZ和链基因的分别表达可使载体小而容量大,三、构建质粒克隆载体的基本策略（Slightly more exotic plasmid vectors）,1 能在转化的受体中进行有效复制、有较多拷贝数（松弛型的质粒ori）。,2 克隆位点：尽可能多一些，至少有一个。可用 MCS连杆，,MCS,是指含多种内切酶识别序列的多克隆位点（multiple cloning site），又称,多聚接头,（polylinker）。,3 筛选标记基因：选择标记区内有合适的克隆位点，当外源DNA插入时，标记gene将失活而成为筛选的标识。,4 构建的质粒克隆载体应尽可能小。大于15kb的plasmid转化效率明显。,5,根据,需要，使构建的质粒克隆载体组装各种“元件”（小DNA片段）。如插入启动子，终止子。,Puc18/19克隆载体：,1,.2.68kb,2.ori来源于松弛型质粒ColE1的复制起始位点，可在大肠杆菌E.Coli HB101,E.Coli C600等细胞中高效复制（DH5）。,3.含报告基因LacZ，lacZ取代了pBR332中的Tcr基因。,P LacZ LacZ,转录,翻译,pUC18,Bam,HI片段,重组DNA分子 转化,E.coli,外源DNA,Bam,HI片段,涂布在含,X-Gal,和Ap的平板上,白色菌落为重组,子，,兰色菌落,为,原载体,利用LacZ基因筛选重组子,pUC18/19中lacZ序列筛选：,lacZ来源于乳糖操纵子，含有启动子、调节因子和-半乳糖苷酶的-肽基因（lacZ）。该基因产物在含,IPTG,（异丙基-D-硫代半乳糖苷）和,X-gal,（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖）培养基培养时，菌落是蓝的。阳性克隆（转化子）是白色的。,pUC系列质粒载体由Messing et al.构建，具有三个显著特点：,1.分子量小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大,2.易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZ,3.多克隆位点区,1)多克隆位点成对地存在于pUC18和pUC19中，位点排列顺序相同，但方向相反,有利于外源DNA的克隆和定向插入,2)产生不同末端规律排列:两端限制酶位点产生5-突起端（,Eco,RI和,Hin,d),与之相邻的两个限制酶位点产生3-突起端（,Sst,I、,Kpn,I、,Sph,I、,Pst,I),中央四个限制酶位点产生5-突起端或平端。这种排列方式十分有利于插入DNA片段的单向缺失和缺失片段的回收。,pUC family,Polylinker or multiple cloning site MCS,pUCm-T载体(pUCm-T Vector):,1,线性化,的载体，,2 载体每条链的3端带有一个突出的T。,第三节 大肠杆菌的噬菌体载体,（Bacteriophage vectors for use in,E.Coli,),一、噬菌体的定义（What are bacteriophages）,噬菌体是吃细菌的病毒颗粒（,viruses,“eater of bacteria”）,。,Capsid,tail,Gene 3 protein,Coat protein,DNA,Phages fall into three main groups:(1)tailless,(2)head with tail(3)Filamentous（细丝状）,Genetic material:,(1)single-stranded RNA,(2)double-stranded DNA,病毒由DNA（or RNA）、外壳蛋白组成，经包装后成为病毒颗粒。进入宿主细胞后，利用宿主细胞的合成系统进行DNA（or RNA）复制和壳蛋白的合成。,DNA和RNA不能共存于同一种病毒中。,噬菌体有严格的宿主专一性，限制了其作为载体使用的范围。,温和噬菌体,（,Temperate phages,）：,插入宿主染色体DNA随着宿主细胞的复制而复制溶,原,阶段（Lysogenic Cycle）,烈性噬菌体,（,Virulent phages）,：,不插入宿主染色体DNA自主复制溶,菌,阶段（Lytic Cycle）,二、噬菌体载体（Vectors based on bacteriophage）,1.DNA的特点,1),DNA,：噬菌体中的DNA，,线状,，48.5kb，编码46个基因，集中于头部。,2),cos位点,：左右两端各12个核苷酸组成的5-粘性末端。两者核苷酸序列互补，DNA在包装前是线状的，在包装后是环状的。,3）46gene：成簇排列。不是所有gene都是生长必需的。,Capsid components 衣壳合成从A到J基因左侧区,Integration&excision 分裂合成（阴影区为基因操作中非必需部位）,Early(late)regulation 早、晚调节,DNA synthesis DNA合成,Lysis 释放,4）有 56种限制性核酸酶的酶切位点,5）噬菌体的生长途径有两种。,Lysis of cell and release of,mature phage particles,Induction,Lysogenic,respone,Cell division,Lytic,respone,p,Such as ultraviolet light,Assembled,or packaged,5）噬菌体的生长途径有两种。,噬菌体载体感染E.coliDNA注入细胞（溶菌阶段）cos位点连接复制在R和S蛋白作用下细胞破裂,噬菌体载体感染E.coliDNA注入细胞（溶原阶段）在宿主细胞int基因作用下插入宿主染色体复制,紫外线,2.噬菌体作为克隆载体的依据,噬菌体温和噬菌体，感染性高，易操作。,噬菌体可承载大的外源DNA。可承载的外源DNA为DNA的75%-105%（即38-51kb）且DNA上有20kb的区域对噬菌体并非必需，可取代或缺失。,3.噬菌体载体类型,噬菌体载体有两种类型，即插入型载体（Insertion vectors）和替换型载体（replacement vectors or substitution vector）,。,1.插入型载体,（Insertion vectors）：多用于cDNA构建文库。,1）免疫功能失活型,如gt10，其左、右臂之间有一个CI基因，该基因应用了imm434免疫区段。该区段完全时，出现浑浊的噬菌斑噬菌体进入,溶菌,阶段；该区域被破坏时，CI基因失活，结果产生清晰的噬菌斑。可以通过形态学上的差异将两者分开。,2)-半乳糖苷酶失活型,如Charon 16A，gt11。,2.替换型载体,（replacement vectors or substitution vector）,常用于基因组文库构建,在左右臂之间有填充物，可以被外源DNA所取代，中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复序列，因此当外源DNA插入时，一对克隆位点之间的DNA序列将被替换掉。Stuffers和polystuffer区可以被替换掉。,EMBL4：当用两端酶切位点时，中间也可以用其他酶切割一下，以防原噬菌体片段退火。,Charon40：中间含有多节段区（polystuffer），MCS是反向重复序列。两者可容纳外源DNA能力,9-22kb,之间。,使用替换型载体克隆外源DNA包括三个步骤：,用恰当限制性酶消化载体，除去基因组中可替代的部分,将上述所得DNA臂同外源DNA相连接,重组体的DNA分子进行包装和增殖，以得到有感染性的重组噬菌体,图3-8 置换型载体组成示意图,图3-9,EMBL3 载体结构示意图,Phagemids(phasmids):,the phage functions are expressed,for example,ZAP family by strategene.,二、凯伦噬菌体载体,凯伦噬菌体载体（Charon vector）是F.R Blattner在1977年在噬菌体基础上发展出来的一种特殊噬菌体载体。,Charon：是古希腊神话中一名老摆渡工，专门负责在斯蒂克斯河（River styx）上，运送亡灵到阴间。,容纳能力 感染效率,质 粒：n kb-n bp 低，0.1%转化率,噬菌体：大片段，n kb-23 kb 高 几乎每个颗粒都有100%感染率,图3-11 GEM-II载体结构示意图,三、M13噬菌体,M13噬菌体是一种丝状（filamentous）噬菌体，内含有,环状,、,单链,DNA分子（“+”链DNA）,长为6407个核苷酸，含DNA复制和噬菌体增殖所需的遗传信息，可分为10个区。还有一个长507个核苷酸的基因间隔区（IS区），从第5489个核苷酸到第6005个核苷酸。M13的复制起点定位在基因间隔区内，但IS区内有些核苷酸序列即使发生突变、缺失或插入外源DNA，也不会影响M13DNA的复制，这为M13DNA构建克隆载体提供了条件。,可编码三类蛋白质：,复制蛋白质 （基因，）,形态发生蛋白质 （基因，）,结构蛋白质 （基因，）,M13mp18,M13噬菌体周期：,M13噬菌体通过鞭毛吸附，感染雄性大肠杆菌，M13噬菌体的“+”链进入细胞内，以此为模板，复制互补的“-”链DNA。由此产生的双链M13DNA称为,复制型DNA（RF-DNA）,。RF-DNA按一般环状双链DNA进行复制。,当细胞内RF-DNA达到近200个拷贝时，则RF-DNA中的“+”链DNA被单链特异的DNA结合蛋白结合，阻止“+”链DNA的复制合成。结果，细胞内只能以“-”链为模板不断复制合成新的“+”链DNA。,新合成的“+”链DNA立即被积累在细胞内的壳蛋白包装成新的噬菌体颗粒，并不断挤出宿主细胞。,（单链，“+”链存在于噬菌体中，双链DNA存在于宿主细胞中。,）,M13噬菌体周期的特点：,增殖过程不会导致宿主细胞的溶菌生长，被感染的细胞一个世代可以释放1000个子代噬菌体。M13包装DNA分子的能力可达M13DNA本身的6倍。,制备的M13DNA，,单、双链,均可转染大肠杆菌受体细胞，因此M13DNA作为载体时，不必进行体外包装就可以,直接,转染受体细胞。,第四节 原核生物应用的其他载体,一、cosmid质粒载体,噬菌体特点：两端部少于280bp，且含有cos位点，可以插入36.4-51kb长度的DNA；,质粒克隆载体特点：不用包装即可转导。克隆能力一般不超过10kb，载体大小一般也在10kb以下，是环状双链DNA.,cosmid质粒载体,特点,：将噬菌体载体的cos位点和质粒克隆载体相结合，大约4-6kb长，能够容纳47kb的外源DNA。,Cosmids:,The vector,be made up of plasmid sequences joined to the cos sites of phage,about 4-6kb in length,can accommodate cloned DNA fragments up to some 47kb in length.,二、噬菌粒载体,M13噬菌粒载体（,M13噬菌粒,和质粒）,优点是可以用来制备克隆基因的单链DNA。,不足之处：,A.插入外源片段后，遗传稳定性下降，外源DNA越大越严重。,B外源片段只按一种方向插入；,C接受外源DNA能力有限，小于1500bp。,噬菌粒载体特点：,A.分子量一般都比M13载体小，约3000bp，易于操作；,B.可得到10kb的外源DNA单链序列；？,C.有质粒和噬菌体的复制起点，因此在大肠杆菌寄主中可以按正常双链质粒DNA分子形式复制；在有辅助噬菌体时可以按M13形式复制；,D.可以从噬菌体直接测序。,例：pMB1 replicon（复制子）:体外包装，感染，质粒型复制 可容纳外源DNA片段：30-45kb；,基因组文库中使用。Genome mapping（酵母人工染色体 亚克隆）。,第五节 真核细胞应用的载体,1 Ti,质粒（Ti：Tumor-induce肿瘤诱发）,根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)与Ti质粒的G-菌，可侵入90科双子叶植物受伤组织，形成冠瘿瘤(crown gall tumor)。,冠瘿瘤细胞具有以下特征：,1）不需要补充植物激素便可进行离体培养；,2）合成,肿瘤,特有的化合物冠瘿碱(opine)，能专一的为根癌农杆菌所利用。这两个特征由Ti质粒决定，但该质粒中仅有一部分进入植物细胞。,Ti 质粒存在于根癌农杆菌中，大小为90-150 x106道尔顿,结构是环状双链DNA,160-250kb，具六个功能区：,致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素；,冠瘿碱（opine）合成区：参与冠瘿碱合成；,冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解；,Ti 质粒转移区(tra)：参与不同农杆菌中的接合转移；,毒（性）区：参与T-DNA的转移和插入植物染色体；,DNA复制区：参与Ti 质粒DNA复制。,Agrobacterium ori,Opine synthesis,T-DNA,LB,RB,Cytokinin synthesis,Auxin,synthesis,Virulence gene,Construction of Ti plasmid,合成氨基酸衍生物-冠瘿碱,Anxin synthesis gene：,合成细胞分裂素,合成吲哚乙酸,Cytokinin synthesis gene：,Opines synthesis gene：,Ti 质粒类型,（由Ti 质粒所产生的冠瘿碱种类而定）有：,章鱼碱类(oct,opine,)；,胭脂碱类(nopaline)；,农碱类(agr,opine,),T-DNA,：,Ti质粒中与植物染色体结合的部位称为,T-DNA,。T-DNA包括植物激素冠瘿碱合成区基因及两侧相同的,25 bp重复序列,，T-DNA整合不具特异性，右侧25 bp重复序列对T-DNA的转移至关重要。,2.Ti质粒载体的中间载体（intermediate vector）,Ti质粒作为载体的问题：,1）太大，不易转化,2）无适合克隆位点,3）T-DNA致瘤区合成植物生长素和细胞分裂素，使转化细胞成瘤状，不能成为完整植株,Ti质粒载体的中间载体由几部分组成：,A.适合E.Coli和A.Tumfaciens自主复制和选择用标记基因,B.适合于植物细胞选用的标记基因,C.一段来自天然Ti质粒的部分T-DNA序列（提供同源重组）,D1-2个来自T-DNA边界的25bp重复序列,E用于表达外源基因的DNA序列（如启动子、终止子序列）,Modified,Ti plasmid,Delete：,genes of the production of bacterial food and of plant hormones,Insert：,selectable marker gene,pCAMBIA1301质粒,T-Border(right),Nos 3,Gus,35S5,Nco,I,35S5,Hyg(R),T-Border(left),35S3,Hin,DIII,Sal,I,Bam,HI,Eco,RI,Bst,EII,pCAMBIA1301,11837bp,Lac Z,植物根部,羟基乙酰丁香酮,乙酰丁香酮,植物细胞,单链-DNA,Formation of crown gall,植物根部受伤部位分泌乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酸,诱导Ti质粒,vir,基因及根瘤菌染色体上的一个操纵子表达,vir,基因产物将Ti质粒上T-DNA单链切下,根瘤菌染色体上的操纵子表达产物与单链T-DNA形成复合物,复合物转化植物根部细胞,3Ti质粒的转移过程,T-DNA,Integrating to plant genome,T-DNA,Integrating to plant genome,二、酵母应用的质粒载体,以大肠杆菌质粒为基本骨架，具有酵母的DNA复制起始区，选择标记，有丝分裂稳定区和外源DNA插入位点。,Yeast episomal plasmids（YEps 附加型质粒）,：在pBR322中插入酵母筛选标记ura3和2,质粒DNA片段（复制起始部位和rep基因），拷贝数高，稳定。以附加体形式在真核细胞中复制。（yeast 2,plasmid,may replicate autonomously or integrate into a chromosomal location.）,Yeast integrative plasmids（YIps 综合型整合质粒）,：含有酵母的筛选标记ura3基因，但缺乏酵母的复制起始位点，所以，它只有整合到酵母染色体中才能复制。（Yips are designed to integrate into the chromosome in a similar way to the Yep plasmid.）,Yeast replicative plasmids（YRps 重复型 复制型质粒）,：含有酵母的筛选标记ura3和DNA自主复制序列ARS，在真核生物中能独立自主复制，拷贝高但不稳定。(YRps:remain as independent plasmids and do not integrate.),Yeast centromere plasmids（YCps 着丝粒 稳定质粒）：,在复制质粒中插入酵母着丝粒的一个DNA片段（CEN）此序列能保证染色体的连接物（attachment）连到有丝分裂的纺锤丝（spindle fibers）上，帮助染色体能等量分配到子代细胞中。所以，含有CEN序列的质粒也将以同样的机制稳定地维持在细胞中，并保证了稳定质粒在子代细胞中的等量分布。(YCps:contain the sequence from around the centromere region of chromosomes.),酵母质粒载体既可以在E.Coli中复制与扩增，又可以在酵母系统中复制与扩增，故又称,穿梭载体,，是以pBR322为基础组建的。,巴斯德毕赤酵母分泌表达载体：Aox-醇氧化酶，甲醇代谢途径的关键酶，可达细胞可溶Pr的30%。外源gene在甲醇以外的培养基中处于非表达状态，加入甲醇后诱导表达。巴斯德毕赤酵母中含有一种称为微体的细胞器，生成的蛋白质，贮存在微体中免受蛋白酶降解。,图3-25 BPV-1质粒载体,三、动物表达载体,以BPV-1为例。BPV-1中69T是转化动物细胞所必需的,约占该病毒DNA总长的69%,单向转录。由69T和,E.coli,质粒载体构成,穿梭质粒载体,。,第五节 人工染色体（Artificial chromosomes）,PAC:p1-derived antificial chromosomes,电转化,BAC:bacterial artificial chromosomes,电转化，插入片段300kb,YAC:yeast artiicial chromosomes,思考题：,1.载体的概念,2.基因克隆,3.穿梭载体,4.载体应具备的4个主要条件？（复制起点，克隆位点，标记gene，安全）,5.质粒的结构特点有哪些？,6.质粒的拷贝数是什么？,7.质粒可以分为哪几类？,思考题：,8.标记基因有哪些？,9.MCS连杆？,10.噬菌体特点？温和噬菌体？烈性噬菌体？,11.为什么可以选择-噬菌体作为克隆载体？它的优缺点（特点）有哪些？,12.噬菌体分类？插入型，替换型。举例说明,13.使用替换型载体克隆外源DNA的三个步骤,14.charon vector特点？,15.M13噬菌体周期？M13噬菌体结构特点？,The End,Thank You!,