流式细胞仪原理及试剂销售培训.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,流式细胞仪的基本原理,流式细胞术的基本概念,流式细胞术（,Flow Cytometry,简称,FCM,）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选,研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等,研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量,流式细胞术的特点,极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪（,Flow cytometer,）可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。,可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确。,定性或定量分析细胞：通过荧光染色对单细胞的某些成分如,DNA,含量、抗原或受体表达量、,Ca,2+,浓度、酶活性以及细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析,强大的分选功能，在分析的,同时可以对特定群体加以分选,FSC,信号,SSC,信号,外周全血细胞散射光双参数点图 （红细胞溶解后）,Side Scatter,Forward Scatter,流式细胞仪的检测的荧光信号,荧光信号,使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析,荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量,FITC,PE-Cy5,PE,荧光信号,双色直接染色,CD3-FITC,CD19-PE,数据分析,数据显示:,直方图(,Histogram,),二维点图(,Dot Plot,),等高线图(,Contour Plot,),密度图(,Density,),三维图（,3D Plot,）等,数据分析,单参数直方图分析,PI-Fluorescence,#Events,正常G0/G1期细胞,凋亡细胞峰,数据分析,双参数点图分析,荧光素及染料介绍,五光十色的荧光素,单分子荧光素,耦合的复合荧光素分子,新型的荧光素样荧光物质,Qdots,常用激光和荧光素搭配,Blue,FITC,PE,PerCP,PerCP-Cy5.5,PE-Texas Red(ECD),PE-Cy5,PE-Cy7,PI,EGFP,Red,APC,APC-Cy7,UV,DAPI,Hoechst,常用的标记单克隆抗体的荧光素,488nm,激光激发：,FITC,（异硫氰酸荧光素）：荧光强度可受,pH,的影响，当,pH,降低时其荧光强度也随之减弱,PE,（藻红蛋白）,PerCP,（多甲藻叶绿素蛋白）：光量子产量并不太高，最好应用在检测表达较高的抗原上,PerCP-Cy5.5,（叶绿素蛋白偶联物）,PE-Cy7,（藻红蛋白偶联物）,PE-Cy5,（藻红蛋白偶联物，又称,Cy-Chrome,）,PE-Texas Red,（藻红蛋白-德州红偶联物，又称ECD）,633nm,激光激发：,APC,（别藻青蛋白）,APC-Cy7,（别藻青蛋白偶联物）,荧光及荧光发生机理简介,荧光及荧光素：,某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光波长长的光线 即荧光。受激发后能产生荧光的物质称,荧光物质或荧光素.,荧光发生机理：,室温下荧光素分子大部分处于“基态”，当荧光素在一定波长（激发波长）的光的照射下吸收光能后（经染色后的细胞在激光束的照射下），荧光染料吸收能量能级跃迁，进入新的状态，称为“激发态”，处于激发态的分子不稳定，它可以通过在,10,-9,10,-7,秒的极短时间内以发射一定波长的光量子的方式释放所吸收的能量从而返回到基态。这一过程称为荧光发射，也就是发光。,荧光素的激发和发射光谱,任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱（,nm,）,激发光谱（,Excitation，Ex,）：,是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。,吸收波峰（最大吸收波长）：,Ex-Max,发射光谱（,Emission,）,：,是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光,发射波峰（最大发射波长）：,Em-Max,荧光素的使用：,选择正确的激光器,确定所需荧光探测器（,PMT,）,区别,488nm 520nm,异硫氰酸荧光素,（FITC）,光学系统：滤光片,置于荧光探测器前，利用二向色性长通滤片(,DL),及带通滤片(,BP,)可将不同荧光染料发出的相应波长光谱区别开,反射光,通过光,光源,二向色性长通滤片,(,DICHROIC FILTER,),，一,定波长以上的光通过，该波长以下的光被反射。,45,度角放置。,550nm,的光通过,550nm,的光被反射,带通滤片,(,BAND PASS,),，允许一定波长的光通过。,550nm DL,620nm BP（620/20）,可以允许610630nm的光通过,Fluorescence Spectrum Viewer,FITC,Fluorescence Spectrum Viewer,PE,Fluorescence Spectrum Viewer,PE-Cy5,Fluorescence Spectrum Viewer,PE-Cy7,Fluorescence Spectrum Viewer,PerCP,Fluorescence Spectrum Viewer,APC,Fluorescence Spectrum Viewer,PI,Fluorescence Spectrum Viewer,EGFP,Fluorescence Spectrum Viewer,DAPI,Fluorescence Spectrum Viewer,FITC,和,EGFP,能否一起使用,荧光染料比较(平均荧光强度),Q-Prep/ImmunoPrep,试剂系统,PerCP APC,FITC ECD PC5 PE,CD8-FITC,CD8-PE,CD8-ECD,CD8-PC5,CD8-PerCP,CD8-APC,PerCP APC FITC ECD PC7 PC5 600nm,）迅速降低。因此检测自发荧光水平高的细胞时，使用发射光波长较长的荧光染料（如,PE-Cy5/PE-Cy7,），可得到较好的,S/N,比,7.荧光素浓度、配伍不当、试剂的质量均导致假阴性/,假阳性结果,一个抗体组合内的抗体可能来源不同的公司，有不同的浓度、不同的亚型，可能均需要自身的同型对照，而实际上，这是非常困难的。尽量选择同一家公司的试剂可以减少干扰,。,Thanks!,