江南大学代谢控制发酵育种的基本技术---副本.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,3.1,序言,发酵的环境条件控制,近年来由于应用生物化学和遗传学原理，深入研究了生物合成代谢途径以及代谢调节控制的基础理论，人们可,进行外因控制,，,通过培养条件来解除反馈调节,，而使生物合成的途径朝着人们所希望的方向进行，即,实现代谢控制发酵,。,代谢控制育种,同时还可进行,内因改变,，,通过定向选育某种特定的突变型,，以达到大量积累有益产物的目的，即所谓,代谢控制育种,。,2025/11/3 周一,3.1,微生物育种技术的发展历史：,自然选育,微生物纯种培养法发明之后，开始了微生物纯种的自然选育。如当时的酒精发酵，扭转了酒精生产不稳定的现象。,诱变育种,40,年代初，,Beadle,和,Tatum“,一个基因一种酶”学说的提出，促进了工业微生物育种技术发展。如抗生素工业的兴起。,代谢控制育种,以,50,年代末谷氨酸发酵成功为标志，获得各种解除或绕过了微生物正常代谢途径的突变株。,代谢控制育种 的兴起意味着诱变育种发展到理性阶段,。,2025/11/3 周一,诱变育种是发酵工业育种的重要手段和技术，目前,几乎所有工业生产菌种都经过诱变处理,。,1,、遗传性状稳定,2,、纯净无污染,3,、繁殖力强、生长速度快、短时间内能产生所需产物,4,、能诱变产生遗传性变异,5,、产量高、收得率高,理想的工业生产菌种必须具备：,微生物育种的途径,：诱变、杂交、基因工程,2025/11/3 周一,3.2,诱变育种的原理和诱变剂,2025/11/3 周一,3.2.1,诱变育种的原理,点突变,碱基置换,移码突变（几个核苷酸发生插入或缺失）,（一对碱基发生突变）,染色体畸变缺失、重复、插入、易位、倒位,基因,突变,诱变育种提高了菌株发生突变的频率和变异幅度！,2025/11/3 周一,1.,出发菌株的选择,2.,菌悬液的制备,3,前培养,4,诱变,5,变异菌株的分离和筛选,3.2.2,诱变选育的一般步骤,2025/11/3 周一,诱变剂一般可以分为,物理诱变剂,和,化学诱变剂,3.2.3,常见的诱变剂（以紫外线和亚硝基胍为例）,2025/11/3 周一,常见的诱变剂种类及其作用原理,2025/11/3 周一,紫外线诱变,：,特点,：危险性小，对,野生菌株 诱变效果好,，应用最为广泛,机制：,形成胸腺嘧啶二聚体改变,DNA,生物活性。,操作要点,：,260 nm,波长照射菌悬液或孢子悬浮液，紫外灯功率,15 W,距离固定在,15 cm-30 cm,左右。,2025/11/3 周一,光复活作用（,photoreactivation,）,把经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为,光复活作用,。,光复活机理：经紫外线照射所形成的,带有胸腺嘧啶二聚体的,DNA,分子，在黑暗中与光激活酶结合，形成的复合物暴露在可见光下时，此酶会因获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体,。,由于在一般的微生物中都存在着光复活作用，所以在,进行紫外线诱变育种时，只能在暗处或红光下进行照射及处理照射后的菌液,。,2025/11/3 周一,亚硝基胍（,NTG,）诱变：,特点,：可诱发营养缺陷型突变，有,超诱变剂,的称号。,较难溶解于缓冲液（甲酰胺溶解），毒性较大。,不同的,pH,环境，诱变效果通常差异较大,磷酸缓冲液,中性,NTG,对,DNA,起作用,Tris-HCl,缓冲液,酸性,HNO,2,对,DNA,起作用,操作要点,：,通常浓度,0.1-1 mg/mL,，,30,o,C,处理,15-60 min,生理盐水洗涤或大量稀释即可终止反应,2025/11/3 周一,对出发菌株的要求：,(1),从自然界样品中分离筛选出来的,野生菌株,。,(2),经过,自发突变经筛选得到的菌株,；,(3),采用具有,有利性状的菌株,，如生长速度快、营养要 求低以及产孢子早而多的菌株；,3.3.1,出发菌株的选择,3.3,诱变育种中的几个问题,2025/11/3 周一,(4),有些菌株在发生某一变异后会提高对其他诱变因素的敏感性，故有时,可考虑选择已发生其他变异的菌株作为出发菌株,。,实例,：在,金霉素生产菌株,中，曾发现以分泌黄色,色素,的菌株作出发菌株时，只会使产量下降，而以失去色素的变异菌株作出发菌株时，则产量会不断提高；,2025/11/3 周一,菌号,诱变,代数,菌落大小,/cm,菌落表面结构,菌落颜色,可溶性色素,变株效价提高,/%,4541,1,1.3,平滑疏松,龟背灰绿,赭石,100,71046,10,0.8,平滑紧密,白,火泥棕,2011,B-53,11,0.6,平滑紧密,白,海螺橙,2642,C-04,自然分,离后,0.5,平滑紧密,白,淡棕,3547,D-756,13,0.4,平滑紧密,白,鱼鳃红,6911,灰黄霉素高产菌,D-756,诱变系谱,菌株,表型变异,与,产量递增,的关系,2025/11/3 周一,(5),在,选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时,，应考虑能累积少量所需产物或其前体的菌株,;,在选择产抗生素的出发菌株时，,最好选择,已通过几次诱变并发现每次的效价都有一定程度提高的菌株作为出发菌株。,2025/11/3 周一,(5),选择单倍体细胞,选择易于表现出基因发生改变的,单倍体细胞,，如细菌的芽孢。,(6),选择单核或细胞核尽量少的细胞,真菌中多采用,分生孢子,或,孢子囊孢子,进行诱变,避免,分离型表型延迟,2025/11/3 周一,表型延迟（,phenotypic lag,）,表型的改变落后于基因型改变的现象。,可分为,分离性延迟,和,生理性延迟,两种,：,分离性延迟,：突变的基因经,DNA,复制和细胞分裂后变成纯状态，表型才能表现出来。,分离性延迟的原因,：对数生长期中，单核细胞常出现双核现象，多核细胞的核也成倍增加，诱变对数期的细胞时，,突变通常发生在一个核上,，故其变异或非变异的细胞必须经过一代或几代繁殖才能分离。,2025/11/3 周一,生理性延迟,：由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能表现出来。,生理性延迟的原因,:,当变异细胞由杂合状态变为纯合状态时,由于杂合期所合成的非变异的蛋白或酶仍然发挥作用,必须经过细胞多代分离后,才能,将这些非变异的酶稀释掉,最终达到变异后应该表现的形态,如营养缺陷型突变株的筛选过程。,2025/11/3 周一,在选择出发菌株时，应挑选每代诱变处理后均有一些表型上改变的菌株，如发酵单位有一定程度的提高、形态上发生过一次变异或产生过回复突变的菌株等，以利于突变率的增加。,突变株的产量是数量遗传，只能逐步累加,，一次性大幅度提高发酵水平不太容易。,2025/11/3 周一,3.3.2,出,发菌株的纯化,纯种分离方法，常用,划线分离法和稀释平板法。,在诱变育种中，出发菌株,的纯化虽然是辅助手段，但它,是不可缺少的技术步骤。,2025/11/3 周一,在诱变育种中，所处理的细胞必须是,单细胞,、,均匀的悬液状态,。这样一方面分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，另一方面又可避免长出不纯菌落。,玻璃珠打散菌悬液后用滤纸或脱脂棉过滤。,诱变之前的细胞还应该尽可能达到,同步培养状态,和,对数生长期状态,。,3.3.2,单孢子（单细胞）悬液的制备,2025/11/3 周一,1.,同步,培养：,群体中的,所有微生物个体细胞处于同一生长和分裂周期中,，从而使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态，这种生长状态称为同步培养,(synchronous culture),。,通过,选择法,或,诱导法,控制细胞生长，使其处于同一生长阶段，所有细胞都能同时分裂。,2025/11/3 周一,同步培养法主要有两类：,诱导法,：,变换温度,光照、,培养基等,筛选法（机械法）：,选择性过滤,密度梯度离心,膜洗脱,2025/11/3 周一,2.,菌龄：,生长旺盛的对数生长期,供,试细胞培养物要新鲜，,细胞生理活性方面既要同步，又要处在最旺盛的对数期，这样突变率高，重现性好,。,细菌,常常通过前培养达到,对数生长期,。,孢子,在诱变前经过几小时的培养，诱使其达到,孢子萌发前期,。,2025/11/3 周一,3.,菌悬液的浓度,要求酵母的营养细胞或真菌孢子浓度约为,10,6,-10,10,/mL,；细菌营养细胞或放线菌孢子浓度约为,10,8,/mL,。菌悬液的孢子或细菌数可用,平板活菌计数法,、,血球计数板计数法,和,光密度法和电子计数法,测定,。,2025/11/3 周一,4.,制备菌悬液的制备,通常采用生理盐水。,如果用化学诱变剂处理时，应采用相应的缓冲液配制,，以防处理过程中,pH,变化而影响诱变效果。,2025/11/3 周一,1.,诱变剂种类选择：,对遗传稳定的出发菌株,，最好采用以前未使用过的、突变谱较宽的、诱变率高的强诱变剂,(NTG,EMS),。,对遗传不稳定的出发菌株,，采用温和诱变剂,(UV),。,对诱变史较长的高产菌株,，如多次使用某一诱变剂，可能出现“钝化”现象，此时则需改用另外的诱变剂。,没有一种诱变剂是完美的，需要根据经验和实际操作条件进行选择。,3.3.3,诱变剂及诱变剂量的选择,2025/11/3 周一,2.,最佳剂量的选择,常以,杀菌率来表示相对剂量,（剂量-存活率曲线,),最适剂量,：,在提高突变率的基础上，既能扩大变异幅度,又能使变异向正突变范围移动的剂量。,2025/11/3 周一,突变率随剂量的增加而提高，但到达一定程度后，再提高剂量,反而会使突变率下降。,正变较多出现在偏低剂量中，而负变较多出现在偏高剂量中。,在产量变异工作中，,常采用相对杀菌率为7075%,甚至3070%的剂量,。但,对,多核细胞菌株，一般用高剂量处理,，便于形成较纯的菌落和增加多细胞菌株的稳定性。,（一般规律）,2025/11/3 周一,2025/11/3 周一,2025/11/3 周一,2025/11/3 周一,单一诱变因子的处理,：采用单一诱变剂处理（一般突变率低）,复合诱变因子的处理,：是指采用两种以上诱变因素处理,复合诱变因子的处理可以分下列几种情况,：,1,、紫外线与光复活交替处理,链霉素生产菌经过,6,次上述处理，突变率,14.6%,上升到,35%,。,2,、不同诱变剂交替处理,3,、同一诱变剂连续重复使用,4,、两个以上因子同时处理,3.3.4,诱变处理方式的选择,诱变剂的复合处理常表现为协同效应,2025/11/3 周一,3.3.5,影响突变率的因素,菌种遗传特性,菌体细胞壁结构,培养条件和环境条件,诱变前预培养和诱变后培养（突变体的修复、表型迟延）,诱变结束后，将一定量的菌液置于完全培养基中培养,，以,克服表型延迟,。,温度、,pH,、氧气等外界条件的影响,2025/11/3 周一,Glucose,Pyruvate,Alanine,Acetaldehyde,Ethanol,Citrate,OAA,-KG,AcCoA,Pyruvate,OAA,PDH,(B,1,NA),PDC,(B,1,),PT,(B,6,),PC,(V,H,),B,1,：硫胺素,NA,：烟酸,V,H,：生物素,B,6,：吡哆醛,实例：光滑球拟酵母中丙酮酸代谢途径,X,X,X,X,选育自身不能合成维生素的酵母,(,维生素缺陷型,),2025/11/3 周一,美国科学院院士,Lonnie O.Ingram,在,PNAS,（,2004,，,IF=10.452,),上年发表的“,Engineering,Escherichia coli,for efficient conversion of glucose to pyruvate”,11,次引用了两篇论文，并对国际上有关丙酮酸发酵水平进行了列表比较，表明该产量获得了,国际最高发酵水平,。,2025/11/3 周一,随机突变，定向筛选,。,筛选的条件决定了选育的方向，设计一个好的筛选方案是诱变育种的重要前提。,对,抗性突变株,或,营养缺陷突变株,，可用选择性培养基进行筛选，以利于突变株的生长。,对,产量突变株,，高产和负变菌株都能在同一培养条件下生长，所以更需要一定的,筛选方案,。,3.4,突变型菌株的分离,2025/11/3 周一,营养缺陷型,：野生菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养（氨基酸、维生素、核酸等）的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长，称为营养缺陷型。,营养缺陷型菌株的检出是通过一系列培养基来实现的。,基本培养基,（,minimal medium,MM,）,补充培养基,（,supplemental medium,SM,）,完全培养基,（,complete medium,CM,）,3.4.1,营养缺陷型的相关概念,2025/11/3 周一,一般包括：,诱变处理,、,中间培养,、,淘汰野生型菌株,、,检出营养缺陷型,、,鉴定营养缺陷型的种类,等,5,个步骤。,采取一些措施，,尽量淘汰野生型细胞，使缺陷型菌株得以富集，以利于检出。,3.4.2,营养缺陷型菌株的浓缩,常用的方法有,抗生素法,和,菌丝过滤法,。,2025/11/3 周一,1.,抗生素法,常用于细菌和酵母菌营养缺陷型菌,株的富集，,前者用青霉素法,，,后者用,制霉菌素法,。,青霉素作用细菌的原理,：未曾突变的,野生型在基本培养基上能生长,，突变为营养缺陷型的菌株被抑制。,营养缺陷型菌株在,基本培养基上,不生长，也不分裂,，因此不受青霉素的作用而保存。,2025/11/3 周一,制霉菌素作用真菌的机理,：,制霉菌素可与真菌细胞膜上的甾醇作用,，从而引起膜的损伤，也是只能杀死生长繁殖着的酵母菌或霉菌。在基本培养基中加入抗生素，,野生型生长被杀死,，,营养缺陷型不能在基本培养基中生长而被保留下来,。,2025/11/3 周一,2,菌丝过滤法,原理：真菌和放线菌等丝状菌的野生型孢子在基本培养基中能萌发长成菌丝，,而营养缺陷型的孢子则不能萌发,。,步骤：诱变处理后的孢子,基本培养液（培养,10 h,左右）,用灭菌的脱脂棉,除去菌丝,继续培养,每隔,3-4 h,过滤一次，重复,3-4,次,稀释,涂皿分离。,2025/11/3 周一,为了准确的表现性状，在浓缩之前就必须使细胞体内或细胞表面的营养耗尽,。所以浓缩前，应将中间培养的细胞先用基本培养基洗涤，接着用基本培养基培养,1-2 h,，然后加入一定的青霉素处理。,注意事项,：,2025/11/3 周一,3.4.3,营养缺陷型菌株的检出,检出营养缺陷型菌株常用的四种方法：,逐个检出法,夹层培养法,限量补充培养法,影印接种法,2025/11/3 周一,1.,逐个检出法（点植对照法,),诱变后的孢子或菌体,富集培养,涂布分离在完全培养基平板上培养,待菌落孢子成熟后，用灭菌的牙签把孢子或菌体,分别接到基本培养基和完全培养基平板上的相应位置,同时培养,然后观察对比菌落生长情况。,-,2025/11/3 周一,如果基本培养基上不生长而完全培养基相应位置上生长的菌落为营养缺陷型,。挑取孢子或菌体分别移接到基本培养基和完全培养基斜面上，进一步复证。,该法可靠性强，,但工作量很大,。,CM,MM,CM,X,-,2025/11/3 周一,CM,2.,夹层法,先在培养皿底部倒入一层基本培养基,倒入含有菌体细胞的基本培养基,加第三层基本培养基,培养,平板上首先出现的菌落，为野生型菌落（在平皿底部做好颜色标记）,加上第四层完全培养基,经培养,如果在基本培养基上不长而在完全培养基上生长的小型菌落，可能是营养缺陷型,。,X,-,X,-,2025/11/3 周一,3.,限量补充培养法,如果,试验的目的仅是检出营养缺陷型菌株,，则其方法是将富集培养后的细胞接种到,含有,0.01,蛋白胨的基本培养基上,，培养后，野生型细胞迅速地长成大菌落，在平皿底部作好颜色标记，而生长缓慢的小菌落可能是缺陷型，此称为,限量培养,。,2025/11/3 周一,如果试验目的是要,定向筛选某种特定的缺陷型,，则可在,基本培养基中加入某种单一的氨基酸、维生素或碱基等物质,，称为,补充培养,。补充这些物质的数量可根据已有缺陷型进行测定后加以确定。,2025/11/3 周一,4.,影印接种法,X,-,2025/11/3 周一,3.4.4,营养缺陷型的鉴定,只有通过鉴别测定，才能确定菌株属于哪一类营养缺陷型,（如氨基酸、维生素类、碱基类）。,缺陷型菌株的鉴定，,实际上就是测定营养缺陷菌株所需的生长因子种类,。,2025/11/3 周一,1.,鉴定方法,营养缺陷型的鉴定方法可分成两大类：,方法一,：在一个,平,皿中,加入一种营养物质,以测定,多株缺陷型菌株,(10-50,株,),对该生长因子的需求情况。,方法二,：在同一平皿上测定一种缺陷型菌株对许,多种生长因子,的需求情况，称为,生长谱法,。,2025/11/3 周一,2.,营养缺陷型鉴定步骤：,测定缺陷型菌株,所需生长因子的类别,具体测缺陷该类别物质中的,哪种生长因子,用单一生长因子进行,复证试验,。,氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨，代表,氨基酸类,。,维生素混合物，代表,维生素类,。,核酸碱基混合液或酵母核酸,(0.1,碱水解物,),，代表,核酸类,。,通常分别用以下物质来代表氨基酸、维生素、核酸碱基：,2025/11/3 周一,a-,不含维生素的酪素水解液或氨基酸混合液,b-,维生素混合液,c-0.1%,碱水解酵母核酸液,b,a,c,第一步，,三大类营养要求的鉴定：,2025/11/3 周一,21,种氨基酸按右表分为6组,特点,：,每2组只有一种共同物质,第二步,单一营养物质要求的鉴定：,(,以,氨基酸营养缺陷型,为例进行说明,),组别,化合物代号,A,1,7,8,9,10,11,B,2,7,12,13,14,15,C,3,8,12,16,17,18,D,4,9,13,16,19,20,E,5,10,14,17,19,21,F,6,11,15,18,20,21,A,C,E,B,D,F,2025/11/3 周一,2025/11/3 周一,3.5.5,抗性突变株的分离,主要包括：,抗药性突变株,、抗噬菌体突变株、,抗结构类似物突变株,1.,抗药,性突变株的分离：,可以测定抑制菌体增值的最低药物浓度,诱变后抗药性突变,2025/11/3 周一,2025/11/3 周一,无法找到抑制菌体增值的最低药物浓度,琼脂层（,CM,）,琼脂层,（,CM,）,+,药物,+,菌体细胞,Siybalski,梯度平板法,抗药性突变株,2025/11/3 周一,2.,抗结构类似物突变株的分离,原理与方法同抗药性突变菌株的筛选,2025/11/3 周一,3.5.6,温度敏感突变株的,分离,CM,菌株,低温,下培养,（,B-30,o,C;Y&M 25,o,C,）,CM,CM,CM,菌株,低温,下培养,（,B-30,o,C;Y&M 25,o,C,）,CM,菌株,高温,下培养,（,B-40,o,C;Y&M 35,o,C,）,2025/11/3 周一,出发菌株,诱变,绝大多数个体死亡,少数存活,少数突变,多数未变,多数负变,少数正变,少数变幅大,多数变幅小,少数宜投产,多数不宜投产,存活率,突变率,正变率,高产率,投产率,3.5.7,产量性状突变株的筛选,高,效,的,筛,选,方,案,和,方,法,至,关,重,要,2025/11/3 周一,第一步,：出发菌株,分离到平皿上（有时还结合指示剂，呈色剂或底物等）,挑选菌落,200,个,初筛,1,瓶,/,株,50,株（准备下一步复筛）,诱变,2.,常规筛选程序,初筛,初筛以量为主,2025/11/3 周一,第二步,：出发菌株,50,株,复筛,4,瓶,/,株,3-5,株（提供第二诱变出发菌株）,常规筛选程序,复筛,复筛以质为主,诱变,挑菌落,100,个,100,个,100,个,100,个,初筛,1,瓶,/,株,第,一,轮筛选结束,第,二,轮筛选开始,2025/11/3 周一,C.glycerinogenes,CCTCC M93018,实例,2025/11/3 周一,为了简化初筛步骤，常用的方法：,根据形态突变淘汰低产菌株,假如某些菌落形态突变与生产性能相关，可以在平板上,选择高产菌株。这需要一定的,经验积累和长期的过程才能,发现,。,实例：,灰黄毒素菌株,产量高,-,菌落暗红变深,多数突变株形态突变与生产性能相关性尚不清楚。,2025/11/3 周一,根据平板上的直观反应，挑选高产菌株,蛋白酶,分解酪蛋白,透明圈法：对于一些易产生透明圈产物的产生菌，,可在底物平板中,加入容易被菌体分泌酶所水解的物质,，使所需微生物能被快速鉴别出来。,-,甘露聚糖酶,水解槐豆胶,2025/11/3 周一,2025/11/3 周一,变色圈法,：对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，,可,在底物平板中加入指示剂或显色剂,，使所需微生物能被快速鉴别出来。,淀粉酶,水解淀粉（碘液）,淀粉酶,水解淀粉（刚果红）,2025/11/3 周一,生长圈法,：通常用于分离,筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌,。,工具菌是一些相对应的营养缺陷,型菌株。将待检菌,A,涂布于含高浓度,的工具菌,A,并缺少所需营养物的平板,上进行培养，若待测菌株,A,能合成,A,所需的营养物，在,A,菌株的菌落周围,便会形成一个混浊的生长圈。,2025/11/3 周一,抑菌圈法,:,常用于,抗生素产生菌,的分离筛选。,工具菌采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便,会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈,，很容易被鉴别出来。,Penicillium notatum,抑制黄色葡萄球菌生长,Alexander Fleming,2025/11/3 周一,沉淀圈法：,凝乳酶水解酪蛋白 抗体抗原沉淀,凝乳酶水解酪蛋白,2025/11/3 周一,常规筛选程序,复筛,该阶段对突变株生产性能作比较精确的测定。,这一环节要求对突变株的,培养基组成,和,发酵条件进行精确测定,，使突变株菌株的优势发挥出来。,常规筛选程序,遗传稳定性,在无选择压力的固态和液态完全培养基下不断传代，,淘汰不稳定的突变株,。,2025/11/3 周一,1,、作为杂交育种、重组育种的遗传标记,2,、遗传学研究中，转化、转导、原生质体融合、质粒和转座子研究中的标记。,3,、生产上：微生物育种，协助解除代谢反馈调控机制，达到大量积累中间产物或某种终产物的目的,3.5,突变株的应用和实例,筛选谷氨酸高产菌株,2025/11/3 周一,葡萄糖,丙酮酸,草酰乙酸,苹果酸,延胡索酸,琥珀酸,乙醛酸,乙酰,CoA,柠檬酸,异柠檬酸,-,酮戊二酸,谷氨酸,丙酮酸羧化酶,丙酮酸羧化酶,异柠檬酸脱氢酶,谷氨酸脱氢酶,-,酮戊二酸脱氢酶,异柠檬酸裂解酶,需要切断或减弱的代谢流,需要强化的代谢流,柠檬酸合成酶,细胞内,谷氨酸育种思路,磷酸烯醇,式丙酮酸,CO,2,细胞外,2025/11/3 周一,天津短杆菌,TG-3,涂布单氟乙酸平板,(,0.5%),涂布,25%,高糖,平板后转接,20%,谷氨酸,平板,以谷氨酸为唯一碳源平板,以,琥珀酸为唯一碳源,平板,挑选生长微弱或不长的菌落,挑选生长良好的菌落,TG-861-TG-8619,TG-866,UV(15 w,30 cm,20 s),EMS(0.5%,pH7,30,o,C,20 min),32,o,C,48 h,挑选生长快的大菌落,牙签法接对应平板,50,吨发酵罐水平,产酸,7.81 g/Ld,转化率,52.34%,2025/11/3 周一,3.6,原生质体融合,2025/11/3 周一,枯草芽孢杆菌,（上）和,酵母,（下）,2025/11/3 周一,2025/11/3 周一,3.7,杂交,细菌,（左）和,酵母,（右）,2025/11/3 周一,3.8,转导,2025/11/3 周一,3.9,转化,2025/11/3 周一,3.10 DNA,重组技术,2025/11/3 周一,