现代生物技术在中药材生产中的应用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,（一）基因工程,基因工程是通过,基因水平上,的操作，改,变,生物遗传性,的技术，也就是按照人们的,需要，用类似工程设计的方法将,不同生物,的基因,进行,基因操作（如基因分离、剪切、拼接），,并通过,载体（如质粒、k噬菌体等）,转入适宜的,受体细胞中,而获得,复制和表达,的一种分子生物学技术。,从细胞中分离出DNA,从大肠杆菌中提取质粒,限制 酶,提取目的基因,限制酶,目的基因与运载体结合,DNA连 接酶,目的基因导入受体细胞,目的基因的表达与检测,基因工程操作的基本步骤,种植业中的应用,用携带外源基因的农杆菌,Ti,质粒转化植物原生质体，使外源,DNA,与植物染色体,DNA,整合，通过原生质体的培养分化成愈伤组织，最后发育成具有新性状的完整植株,转基因植物,基因工程人干扰素-2b（安达芬），是我国第一个全国产业化基因工程。安达芬具有抗病毒，抑制肿瘤细胞增生，调节人体免疫功能的作用，广泛用于病毒性疾病治疗和多种肿瘤的治疗，是当前国际公认的病毒性疾病治疗的首选药物和肿瘤生物治疗的主要药物。,（二）发酵工程,发酵工程即利用,某些微生物及其特定功能,，通过现,代工程技术手段（主要是,发酵罐或生物反应器的自动,化、高效化、大型化,）生产各种特定的有用物质；或,者把微生物直接用于某些工业化生产的一种生物技术体系。,现代发酵工程主要指利用,利用微生物、动植物细胞和基因工程菌,在,在人工生物反应器（发酵罐）中培养而获得产物的工业过程。,现代发酵工程是生物代谢、微生物生长动力学、大型发酵罐或生物反应器研制、化工原理,等,密切结合和应用的结果。,发酵工程,发酵的主体设备,发酵工程生产产品的流程图,（三）细胞工程,细胞工程又称,细胞融合技术,，是指,人为促使两种不,同的生物细胞,在,同一培养基中,，通过,无性的方法,进行,人工的直接融合，形成能够,同时表达两个亲本细胞有,益性状的杂交细胞的技术,。由于该技术是在细胞水平,上进行操作，也称为细胞融合技术，为细胞水平的生,物工程。,高等植物细胞培养,高等植物细胞具有全能性。从高等植物的幼胚、根、茎、叶、花和果实等不同器官的组织中分离的单个细胞，经过特殊培养形成愈伤组织，并可进一步诱导生成完整的植株,。,高等植物细胞培养,细胞融合是将不同种类的两种细胞经过特殊处理后放在一起，在某些促融因子作用下发生融合，形成杂种细胞。,原生质体融合,（四）酶工程,酶工程是通过将生物体内具有,特定催化作用的酶类,分离出来，在体外进行催化反应。,酶反应的特点,是:在常温、常压下，专一性地快速进行催化反应；但酶不稳定，容易失活，为了提高酶的稳定性和适于连续作业，发展了酶的固定化技术，将酶固定在特定的载体,上，当反应物通过固定化酶时，即可快速催化生成相应的产物。,当前酶制剂的生产，主要依靠微生物发酵技术，自微生物发酵液或细胞中提取用的酶类,第二节现代生物技术在中药材生产中的应用,现代生物技术对现代社会产生了深刻影响。作为社会主要产业的工业、农业、医药、环保等领域都因为现代生物技术出现而有了突飞猛进的发展，作为农业、医药的一个结合点，作为中医药发展的物质基础，中药材生产也在现代生物技术的应用热潮中发生了革命性的变化，其应用主要表现在以下几方面,一、转基因工程,起步相对较晚，在药用植物中的应用主要体现为利用毛状根培养能在较短的时间内得到大量的活性成分。,目前国内外已在银杏、红豆杉、长春花、烟草、何首乌、紫草、人参、曼陀罗、颠茄、毛地黄、绞股蓝、半边莲、罂粟、露水草、桔梗、丹参、黄芪、决明、大黄、黄连、甘草、茜草和青蒿等26科100多种药用植物建立了毛状根培养系统。应用毛状根培养生产的许多重要药物次生代谢产物有生物碱类(如吲哚类生物碱、喹啉生物碱、莨菪烷生物碱、托品烷生物碱、喹嗪生物碱等)、苷类(如人参皂苷、甜菜苷等)、黄酮类、酪类(如紫草宁等)、噻吩、蒽醌以及蛋白质(如天花粉蛋白)等。（冀玉良等，2008）,毛状根培养,毛状根培养是20 世纪80 年代发展起来的,基因工程,和,细胞工程,相结合的一项技术，通过将发根,农杆菌,(,Agrobacterium rhizogenes,)中Ri,质粒,含有的,T-DNA,整合到,植物细胞,的,DNA,上，诱导植物细胞产生毛状根。毛状根属于激素,自养型,，具有有效成分含量高、生理生化和遗传性稳定、易于进行操作控制等特点，可在离体培养条件下表现出,次生代谢,产物的合成能力，还能够合成许多悬浮,细胞培养,所不能合成的物质，某些产物的产量甚至高于正常植物及悬浮细胞培养。,毛状根培养系统,无论在生物量的增加，药用有效成分的积累还是生产稳定性方面，都显示了其独特的优越性，使得利用毛状根培养生产植物次生代谢产物具有极大的生产潜力。,发根农杆菌,发根农杆菌,(Agrobacterium rhizogenes)是一种,革兰氏阴性菌,，能侵染大多数的双子叶,植物,、少数单子叶,植物,及个别的裸子植物，诱发被感染植物的受伤部位长出毛状根。发根农杆菌之所以具有这种致根性，是因为它具有能诱导毛状根产生的,Ri质粒,。Ri质粒是发根农杆菌,染色体,外的一个约250kb的大质粒，带有冠瘿合成酶基因。在Ri质粒上，存在与转化有关的两个主要功能区，即T-DNA(转移区)和Vir(致病区)。Vir区基因并不发生转移，但它对T-DNA的转移非常重要。当发根农杆菌感染植物时Ri质粒上的T-DNA可以转化并插入到植物细胞基因组中，其整合和表达的结果导致了大量毛状根的产生。处理,菌株,后可提高Vir区的表达并明显提高药用,植物,外植体的转化率。,发根农杆菌分类,发根农杆菌:Ri质粒有几种不同的类型，分别是农杆碱型、甘露碱型和黄瓜碱型。其中含有农杆碱型Ri质粒的菌株通常具有更广泛的宿主范围和更强的致根特性。经发根农杆菌侵染植物形成的毛状根适离体培养能够再生植株，而且许多植物的毛状根在离体,培养,条件下表现出次生代谢产物的合成能力，产物产量较正常植物及,悬浮培养,细胞的要高。因此Ri质粒可应用于有价值的次生代谢产物的生产。,常用菌种,常用于实验的发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）有：ATCC15834、ATCC39207、G58P GV3296、A4、NCPPB2659、Rl500、Rl601、LBA9402、TRl05等菌株，这些菌株中含有侵入性致根质粒（root inducing plasmid）Ri质粒。,优点,与,植物细胞培养,相比，毛状根培养具有生长速度快、激素自养、分化程度较高以及遗传性状相对稳定等优点。由于近三分之一传统药材的药用部位是根，所以这一培养系统在传统药材生产中具有更重要的意义。,诱导操作,（以黄芪为例简述毛状根的诱导方法）：,黄芪无菌苗培养：黄芪种子表面消毒后接种于MS培养25 下暗培养，待苗长至4cm左右时取其不带芽的,下胚轴,作为共培养的材料。,（以黄芪为例简述毛状根的诱导方法）：,发根农杆菌的培养与保存：农杆菌可在平板培养基上于4下保存数月，而在-70 的低温冰箱中可长期保存。农杆菌快速生长过程中常常会出现质粒丢失，基因突变。要使转化最为有效就要利用,对数生长期,的农杆菌来转化。发根农杆菌15834的质粒上带有抗cefotaximes选择,标记基因,，将农杆菌培养于YEB培养基上，25 C下培养，每周转接一次，感染前两天转接一次。,（以黄芪为例简述毛状根的诱导方法）：,针刺接种感染与共培养：把黄芪下胚轴切段后，用解剖针蘸取培养好的发根农杆菌，在黄芪下胚轴上扎眼，之后黄芪切段接种于含500mg/L cefotaxime的MS培养基上培养。25黑暗下诱导毛状根。长出的毛状根经多次转接去除农杆菌之后转入MS中培养可速生长，转化的毛状根生长大大快于未转化的根培养物。,二、组织培养,这里所指的组织培养是利用植物体的部分组织（多用茎、叶、根等的幼嫩部分）小块在专门的培养基中，在植物生长调节剂及植物激素的作用下诱导分化成大量植株幼苗的过程。其特点是繁殖速度快，周期短，不受季节、气候、自然灾害等因素的影响；种苗性状一致，便于管理；通常在得到大量种苗后可结合无土化栽培，实现工厂化生产从而从根本上改变药材生产的传统模式，既能解决我国耕地不足，药农争地的问题，又能减少病虫害的发生，提高药材产量和质量，从而提高经济效益。,二、组织培养,如名贵中药材石斛繁殖能力低，生长缓慢，而以它为原料药材的中药需要量很大，导致了石斛资源的紧缺，在某些地区甚至造成野生石斛的消失。科研人员通过多年的研究，成功地利用组织培养的方法解决了石斛种源不足的问题，并在此基础上开展了石斛工厂化生产的实践，满足了医药行业生产上的需要。,三、细胞培养,目前药用植物次生代谢产物的生产主要采用液体悬浮培养技术。液体悬浮培养是将选出的细胞株系在摇床或转床的发酵罐中的液体培养基中大量增殖并从中提取出所需成分的一种技术，目前主要用于生产细胞内的有效成分。,例如紫杉醇生产。紫杉醇是从短叶红豆杉树皮中提取的天然二枯类成分，有较强的抗癌活性，临床证明紫杉醇对晚期和复发性卵巢癌、转移乳腺癌、头部和颈部癌等有明显的疗效，但是紫杉醇在红豆杉植物细胞中含量极低，而红豆杉植物资源较少，生长慢，并遭到大面积的砍伐，面临濒危的境地。为了解决这一问题，研究人员建立了活性成分较高的紫杉细胞株系，通过液体悬浮培养大量增殖，生产出的紫杉醇产量为树皮中提取产量的2-4倍，从而满足了医药行业的需要,我国红豆杉有4种1变种，分布于我国大部分地区。东北红豆杉主要分布在吉林省长白山和黑龙江一带，辽宁东部山区也有少量分布。云南红豆杉主要分布在 滇西16个县总面积约9万平方公里，分布广，生长分散，无纯林，多为林中散生木。南方红豆杉主要分布在 滇东、滇西南。西藏红豆杉主要分布在云南西北部，西藏南部和东南部。,第三节现代生物技术在中药材生产中的作用,进人21世纪以来，随着各学科和技术的相互交叉与融合，占据了现代科技制高点的现代生物技术，也对我国传统中药材的生产起了重要的影响，其作用主要表现在以下几方面。,一、药用植物种苗的脱毒和快速繁殖,（一）药用植物的脱毒和快速繁殖,病毒病是影响药用植物生产的重要因素之一，由于病毒病的危害，通常可造成药材减产达30以上，也会严重影响药材的外观性状和内在质量。而在植物的幼嫩组织中往往不会有病毒的出现，据此，我们可以通过对茎尖组织的培养获得脱毒苗，并以此克隆获得大量脱毒优良种苗满足生产的需要。,（二）濒危、稀缺植物或急需药用植物良种的快速繁殖,（三）杂种一代药用植物植株的快速繁殖,利用组织培养方法对杂交植株进行无性快繁，既可保持杂种一代的原有性状和杂种优势，又解决了杂种后代繁殖力低的问题。,二、药用植物良种的培育,（一）利用花药组织培养获得单倍体植株,（二）利用组织培养诱导获得多倍体植株,（三）利用组织培养和细胞突变育种,（四）利用原生质体融合进行细胞杂交育种,（五）利用转基因技术培育良种,