流式细胞术及其临床应用.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2017/10/30,#,流式细胞术原理及临床应用,流式细胞仪,(Flow Cytometer,),是,现代物理电子技术、激光技术、,计算机技术以及,细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器,；当细胞,（或其他粒子）以单个方式依次通过探测,光束时，能够,采集,细胞被光照时产生的各种信号,，然后,对信号进行处理,，并能,对多个参数进行关联分析,的一种,仪器,流式细胞术,(Flow Cytometry,，,FCM,),利用,流式细胞仪,对处于,快速直线流动状态,中的,单列细胞,或,生物颗粒,进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的,技术,流式细胞术,流式细胞术,激光,技术、计算机技术、,显微,荧光,技术、光电子技术,、,流体喷射技术、,单克隆抗体,技术,、纳米技术,以及,分子生物学,和免疫学等多门学科知识,现代,科学技术发展的综合交叉的产物，是集多种技术发展于一体的,“,大成者,”,广泛应用在免疫学、细胞遗传学、肿瘤生物学和血液学等多学科领域,20,世纪,70,年代发展至今，仪器设备更趋完善，在应用上也逐渐由基础研究进入到,临床检验医学,领域，为细胞分析提供全新手段,1930,Caspersson&Thorell,细胞,计数,1940,Coons,结合,荧光素,的,抗体,去标记细胞,内特定,蛋白,1934,Moldaven,细胞,检测,自动化,光电,仪记录流过一根毛细管的,细胞数,1949,Wallace,Coulter,悬,液中计数,粒子,的,方法并获专利,1950,Caspersson,显微分光光度计,UV-VIS,光谱区检测,细胞,1953,Croslannd,Taylor,根据分层,鞘流,原理成功设计,红细胞,光学自动,计数器,1969,Van Dilla,及同事在,Los Alamos,NM,发明,第一台,荧光检测细胞计,1972 Herzenberg,荧光激活细胞分选仪,荧光标记抗体染色的细胞的较弱荧光信号,1975,Kohler,单克隆抗体,为细胞研究提供大量的特异免疫试剂,流式细胞术发展史,1973 BD,公司与斯坦福大学合作,第一台商用,流式细胞仪,分析型,流式细胞仪,细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用,分选型,流式细胞仪,既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；,进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流式细胞仪一般只用于分选,流式细胞仪的分类,计算机与分析系统,信号收集与,光电转换系统,流动室与液流系统,光源与光学系统,流式细胞仪构造,激发光源,计算机分析,滤光片,流动,室、,鞘液和,样本流,信号检测器,激发光源,光学系统,细胞分选与浓缩系统,（二）,激光光源与光学系统,（一）,激发光源：激光器,气体激光器：氩离子,(488nm,、,355nm),、氦氖,(633nm),、氪离子,(647nm),、氪氩,(568nm),；,染料激光器：如氩离子激光器的泵浦含有,Rhodomin 6G,水溶液染料，,发出,550-650nm,可变波长激发光；,半导体激光器,：,价格低、结构简单、寿命长；,BD,的,FACS Calibur,已采用,635nm,半导体激光器,激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照,（二）,激光光源与光学系统,（二）光,束成行系统,（二）,激光光源与光学系统,透镜,（二）光,束成行系统,滤光片,的组成,长通,(Longpass,，,LP),滤片：,只允许特定波长以上的光束通过,短通,(Shortpass,，,SP),滤片：,只允许特定波长以下的光束通过,带通,(Bandpass,，,BP),滤片：,只允许一定波长范围内的光束通过,（二）,激光光源与光学系统,（三）光收集系统,（二）,激光光源与光学系统,480,520,460,500,540,SP 500,LP 500,BP500/50,（三）光收集系统,480,520,460 500,540,480 520,460,500,540,光信号的类型,散射光信号,：,与标记荧光素无关，,是细胞的固有参数,前向散射光,(forward scatter,FSC),侧向散射光,(side scatter,SSC),荧光信号,自发荧光：微弱,特异荧光：标记的荧光素分子发出,的荧光，比自发荧光强很多倍,（三）,信号收集和光电转换系统,（一）前向散射光,FSC,FSC,信号方向与激光束平行，偏离度一般在,1-6,度范围内，亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的,体积大小,（三）,信号收集和光电转换系统,（,二,）侧向散射光,SSC,SSC,方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称,90,度散射光，其信号强度反映,细胞内部颗粒度和精细结构的变化,。,（三）,信号收集和光电转换系统,R1,:,淋巴细胞,R2:,单核细胞,R3:,中性粒细胞,R4:,裂解碎片,（三）,信号收集和光电转换系统,外周血裂红后,FSC/SSC,分布,（三）荧光信号,荧光,：物质,中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光,（三）,信号收集和光电转换系统,基态,（三）荧光信号,细胞,经过,特异荧光素标记后,，受激发光照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的,检测就,能了解所研究细胞参数的存在与,定量,细胞,抗原,抗体,荧光素,激光束,（三）,信号收集和光电转换系统,（三）荧光信号,常用荧光素,（三）,信号收集和光电转换系统,荧光素分子,激发波长,(,nm,),发射,光波,(nm,),中文名,FITC,4,88,525,异硫氰酸荧光素,PE,488,575,藻红蛋白,PerCP,4,88,67,7,多甲藻黄素,-,叶绿素,-,蛋白质 复合物,APC,6,33/635,6,6,0,别藻蓝蛋白,PE-Cy5,488,670,藻红蛋白,-,花青素,5,PE-Cy7,488,7,55,藻红蛋白,-,花青素,7,PerCP-Cy5.5,488,710,能量传递染料,（三）荧光信号,常用荧光素,（三）,信号收集和光电转换系统,能量传递,染料,(PE-Cy5,PE-Cy7 PerCp-Cy5.5),用,化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，,在,488nm,波长激发光激发后产生的发射波长激发另一,荧光染料产生荧光信号,，最终检测第二荧光染料发射的特定荧光信号,（三）荧光信号,（三）,信号收集和光电转换系统,499nm,：蓝色,荧光（,Blue,）,500-549nm,：绿色,荧光（,Green,）,550-584nm,：黄色,荧光（,Yellow,）,585-615nm,：橙色,荧光（,Orange,）,616-700nm,：红色,荧光（,Red,）,700nm,：远红外,荧光（,Far-Red,）,（三）荧光信号,（三）,信号收集和光电转换系统,目前常用,FCM,配置（,BD Calibar,）,488nm,激光管常用染料有,第一通道（,FL1,）：,FITC (Fluorescein Isothiocyanate),第二通道（,FL2,）：,PE,(Phycorey-thrin),第三通道（,FL3,）：,PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein),PE-Cy7,、,PE-Cy5,、,PerCP-Cy5.5,633nm,激光管常用染料有,第四通,道（,FL4,）：,APC,多色标记荧光素搭配,原则,每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配,FACSCalibur,常用四色搭配：,FITC,、,PE,、,PerCP,、,APC,FL-A,FL-H,FL-W,面积（,A,）：荧光总量,高度（,H,）：最大荧光强度,宽度（,W,）：细胞直径,光信号到电脉冲信号,FACSCalibur,流式细胞仪信号检测系统,（四）计算机和分析系统,FCM,数据显示方式,单参数直方图,(Histogram),双参数数据显示：,散点图,(Dot Plot),伪彩图,(,Pseudo-color Plot),等高线图,(Contour Plot),密度图,(Density Plot),假三维图,(Pseudo 3D Plot),三维图,(3D Plot),常用分析软件,CellQuest,Diva,FlowJO,WinMDI,FCS Express,直方图（,Histogram,）,细胞的某一单参数数据的统计分布图，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，单位是道数，纵坐标一般是细胞数,Event#,FL1 FITC,1,10,2,700,3,720,4,15,010,1,10,2,10,3,Counts,FITC,荧光强度,（四）计算机和分析系统,直方图（,Histogram,）,（四）计算机和分析系统,横坐标既可以是线性的，也可以是对数的,DNA,倍体分析,抗原表达分析,Overlay,图,散点图,(Dot Plot),（四）计算机和分析系统,散点图中每个点代表一个细胞，,X,轴与,Y,轴分别代表一种参数，优点是比直方图直观,FL1,FL2,散点图,(Dot Plot),（四）计算机和分析系统,散点图 伪彩图,等高图和等密度图,（四）计算机和分析系统,等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。,密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方细胞少。,（四）计算机和分析系统,假三维图和三维图,SSC-Height,FSC-Height,Counts,SSC,CD45,CD14,门,(Gate,，简写,G),是流式细胞术中的一个重要术语，,FCM,数据分析过程实际上就是选门和设门的过程,椭圆形,圆形,设门与数据分析,（四）计算机和分析系统,矩形,任意形状,R(Region,，区域,),：,门可以是单一区域,(G=R1),，也可以是几个区域组合在一起：,G=R1 and R2;G=R1 or R2;G=R1 not R2,（四）计算机和分析系统,十字门,线性门,（四）计算机和分析系统,流式细胞术的最大特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获得多种信号对细胞进行定量分析或纯化,分选,细胞,不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、,定量,流式细胞仪特点,目前国内主要流式细胞仪厂家,Beckton Dickinson(BD,),BACKMAN,COULTER,Epics XL,单激光四色，分析型,CyAn,三激光九色，分析型,FC 500,单激光或双激光五色，市场覆盖率较高，分析型,Gallios,三激光十色，分析型,MoFlo XDP,高端分选型,Beckman Coulter,公司流式细胞仪,BD,公司分析型流式细胞仪,FACS Calibur,双激光四色，,市场覆盖率最高,FACS Canto II,双激光六色，三激光八色,FACS Verse,双激光六色，三激光八色,AccuriC6,双激光四色,BD,公司分析型流式细胞仪,LSRFortessa,X-20,五激光十,八,色，分析型最高配,LSR II,双激光六色，三激光八色，四激光十色,FACSVantage SE,FACSAria III,Influx,BD,公司分选型流式细胞仪,BD,FACS,Canto,II,双,激光或,三,激光,，,8,色,分析,八角形,/,三角形光信号接受系统，利用,全反射的光路,结构设计，避免透射过程对光信号的损耗,，,提高,荧光灵敏度,兼顾,科研需求,和,临床,检测,BD,FACSTM 7-color setup beads,使,体外,诊断,中,所有实验的日常仪器设置在一管,中进行,专门,配备有,FACSCanto,临床软件,，淋巴细胞,亚群，,HLA-B27,等临床自动检测和分析软件，,直接报告检测,结果,独立,液流车系统,，保持液流的稳定,最小样本量：,30,微升,手动上样,/,自动连续上样,获得,SFDA,认证,BD,LSRFortessa X-20,提供,5,激光,，,18,色分析,18,种波长的激光器，横跨从,紫外到红外全,光谱范围,，提供,灵活的光谱,选择,满足高端,科研需求,淋巴细胞亚群,HLA-B27,CD55,、,CD59,检测,CD34,造血干细胞计数,白血病和淋巴瘤免疫分型,TH1/TH2,细胞检测,血小板活化,炎症感染指标,CD64,网织红细胞,/,血小板检测,微小残留病灶（,MRD,）,肿瘤细胞倍体（,DNA,）,细胞凋亡,流式细胞术的临床应用,标本的种类,：,血液,、骨髓穿刺液、各种体液（胸水、,腹水,、脑脊液）、组织（如,淋巴,结,、肝、脾）及肺泡灌洗液,等,抗凝剂：,外,周血,：,EDTA,、,肝素,和,枸橼酸,均,可,骨髓,：,肝素,（推荐）、,EDTA,血小板,：,枸橼酸,储存时间：,EDTA,：,24,48h,肝素,：,48,72h,枸橼,酸,：,72h,严重,溶血、凝血或坏死,的样本,应弃用,单细胞悬液,标本要求,淋巴细胞,亚群分析,试剂,：,BD,Multitest IMK,Kit,标本,：外周血（常用,）,配色,：,CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC,CD3-FITC/CD19-PE/CD45-PerCP/CD16CD56-APC,检测,指标,：,T,细胞（,CD3,+,CD4,+,、,CD3,+,CD8,-,）,B,细胞（,CD19,）,NK,细胞（,CD3,-,CD16,56,）,临床,意义,反应体内,免疫状态,CD4,+,T,降低：病毒感染、恶性肿瘤、免疫缺陷病、免疫抑制剂使用,CD8,+,T,增高：病毒及,结核杆菌,感染，自身免疫性疾病活动期、肿瘤、慢性活动性肝炎,CD4/CD8,降低：,处于免疫抑制状态,免疫缺陷病：如,艾滋病时的比值常显著小于,0.5,某些恶性肿瘤：如肝癌、食道癌、肺癌、膀胱癌等,某些病毒,感染：,HBV,、,EB,、,CMV,等,NK,细胞（,CD3,CD16,+,和,/,或,CD56,+,）能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性,作用,淋巴细胞,亚群分析,淋巴细胞,亚群分析,HIV,感染者,HLA-B27,检测,试剂,：,BD HLA-B27 Kit,标本,：外周血,检测指标,：,T,(CD3,+,),淋巴细胞上,HLA-B27,定性,检测,临床意义,：,强直性脊柱炎,（,高度,相关，,90%,）,Reiters,综合征（,70-90%,）,银屑病关节炎（,50-60%,）,急性前,葡萄膜炎（,40-50,%,）,HLA-B27,检测,PNH,诊断,试剂,：,CD59-FITC,、,CD55-PE,标本,：外周,血,检测,指标,：,CD55,、,CD59,百分比,CD55,、,CD59,荧光强度,阵发性睡眠性血红蛋白尿症（,PNH,）的发病机制为,X,染色体上的,PIG-A,基因发生突变，引起糖化肌醇脂（,GPI,）锚合成障碍，使,GPI,锚连蛋白缺乏，已证实的,GPI,锚连蛋白有,10,余种，用于,PNH,诊断的主要为,CD55,和,CD59,两种，如果在红细胞上出现,CD55,或,/,和,CD59,的减少,，可诊断为,PNH,Normal,PNH,PNH,诊断,造血干细胞计数,试剂,：,BD Procount Progenitor Cell,Enumeration,Kit,标本,：骨髓、动员后的外周,血,配色,：,CD34-PE,、,CD45-PerCP,、,nucleic,acid dye,检测指标,：,CD34,及浓度,蓝色,荧光微球（数量已知）；,红色,CD34,细胞,干细胞特征：,CD45,表达弱阴性,(R2),CD34,表达弱强,(R4),DNA/RNA,含量多，染色性较强,(R1),大小（,FSC,）和颗粒度（,SSC,）淋巴细胞相似,临床意义,：,血液,系统疾病的造血干细胞移植,数量,的检测,采集,时机的确定,造血干细胞计数,白血病和淋巴,瘤免疫,分型,试剂,：各种单克隆荧光抗体,标本,：骨髓、外周血、胸腹水、脑脊液、,淋巴组织,分型方案,：,CD45,设门，四色标记，,临床意义,：,客观、快速地分析,确定,异常细胞系来源及分化阶段,判断,预后,白血病和淋巴,瘤免疫,分型,正常骨髓细胞,CD45/SSC,R1:,淋巴细胞,R2:,幼稚细胞,R3:,单核细胞,R4:,中性粒细胞,R5:,有核红细胞,AML-M1,R2,占,94,，,表达,CD33,CD34,CD117,CD71,CD13,CD64,MPO,ALL(B),R2,占,65,，,表达,CD79a,CD19,CD34,CD22,CD10,CD38,HLA-DR,临床意义,：,CD4/CD8,结节病,特发性肺间质纤维化,肺部肿瘤疾病,肺泡灌洗液（,BALF,）淋巴细胞检测,CD4/CD8,5.04,Th1/Th2,细胞检测,Th1,，抗胞内病原体,迟发型超敏反应、炎症,IL-2,、,IFN-,、,TNF-,介导,细胞免疫,CD4,+,T,Th1/Th2,Th2,，蠕虫感染,环境变应原的应答,IL-4,、,IL-5,、,IL-10,等,介导,体液免疫,TH1/TH2,细胞检测,细胞,内细胞因子表达,IFN-,（,Th1,）和,IL-4,（,Th2,）,检测,前需要刺激活化（,PMA+,ionomycin,）,46h,Golgistop,，含有莫能霉素（,Monensin,）,设,门策略：,CD3,+,CD8,-,TH1/TH2,细胞检测,感染性疾病,CD64,检测,CD64,：,F,C,受体,单核细胞,（）,中性粒细胞,（,dim,）,淋巴细胞,（）,检测指标,：中性粒细胞,CD64,表达强度,CD64,指数,CD64,中性粒,/CD64,淋巴,临床意义,：细菌感染、脓毒血症、败血症,感染性疾病,CD64,检测,CD45,CD64,CD64,CD64,CD64,液相芯片技术,CBA,CBA,：,Cytometric Bead Array,可溶性蛋白：,血清,中细胞因子,荧光微球连结特异抗体,不同荧光强度,多个检测指标,标本,：血清、血浆、培养液、各种体液,液相芯片技术,CBA,液相芯片技术,CBA,思考题,1,、,FSC,和,SSC,分别分别反应了细胞的什么特点？,2,、外周血淋巴细胞亚群分析的临床意义？,Thank you,！,