海洋生物活性物质-活性蛋白、肽、氨基酸.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,六、海洋生物中的活性蛋白活性肽活性氨基酸,鱼精蛋白,是存在于许多鱼类的成熟精细胞中的一种碱性蛋白，分子量较小，大约为,400010000,，,精氨酸,占其氨基酸组成的三分之二以上,（一）海洋生物活性蛋白,1,、鱼精蛋白,鱼精蛋白的结构,鱼精蛋白的结构因鱼种不同而有差异，但是它们存在许多相似的特征，如,N-,端均为精氨酸或者丙氨酸，各种鱼精蛋白分子肽链中都含有,4,个较长的和,2,个较短的,精氨酸簇,，并且分别被特征性的残基,Ser,或,Thr,，,Pro-Ile,，,Gly-Gly,或,Val-Val,分隔开。以鲑鱼鱼精蛋白为例，其氨基酸的序列如下：,Pro-,Arg-Arg-Arg-Arg,-Ser-Ser-Ser-,Arg,-Pro-Val-,Arg-Arg-Arg-Arg-Arg,-Pro-,Arg,-Val-Ser-,Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg,-Gly-Gly-,Arg-Arg-Arg-Arg,鱼精蛋白的抗菌谱及其最小抑菌浓度,鱼精蛋白的抗菌谱,菌 种,鲱精蛋白,鲑精蛋白,Pseudomonas fluorescens,Serratiamarcesens,Proteus morganii,Escherichia coli,Salmonella enteritidis,Vibrio parahaemolyticus,Enterobacter areogenes,Staphylococcus aureus,Bacillus coagulans,-,-,-,-,-,-,+,+,+,-,-,-,-,-,-,+,+,+,产气肠杆菌,金色葡萄球菌,芽孢型乳酸菌,C,菌,1931,年,McClean,首先报道了鱼精蛋白具有抑菌活性,鱼精蛋白的抗菌谱,菌 种,鲱精蛋白,鲑精蛋白,B,Megaterium,：,巨大芽孢杆菌,B,Licheniformis,：,地衣芽孢,B,Subtilisruber,B,Subtilis niger,枯草芽孢杆菌,B.Subtilis mesentericus,马铃薯芽孢杆菌,Lactobacillus plantarum,胚芽乳杆菌,Lactobacillus casei,干酪乳杆菌,Streptococcus faecalis,粪链球菌,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,在中性和碱性条件下，对耐热芽孢菌、乳酸菌、金黄色葡萄球菌、霉菌和革兰氏阴性菌均有抑菌作用，,PH,值,7,9,时最强，对热稳定,(120,，,30min),。,鱼精蛋白的抗菌机理,研究表明，鱼精蛋白主要是以分子中,多聚精氨酸或多聚精氨酸与其他少数几个氨基酸以某种结构或形式与细菌细胞壁结合，破坏细胞壁中的肽聚糖的合成，,从而达到抑菌的效果。鱼精蛋白的抗菌性会受到很多因素的影响，比如食品的,pH,值、金属离子、有机成分、温度和时间等,（,1,）来源,蓝藻（,Cyanophyceae,）、红藻（,Rhodophyceae,）、,隐藻（,Cryptophyceae,）和少数一些甲藻,（,Pyrrophyceae,）中，它是,藻红蛋白、藻蓝蛋白、藻红蓝蛋白和异藻蓝蛋白,的总称。,按照光谱类型来分类，藻胆蛋白则可以分为六大类：异藻蓝蛋白,B,（,APB,）、异藻蓝蛋白（,AP,）、藻蓝蛋白（,PC,）、藻红蓝蛋白（,PEC,）、藻红蛋白,I,（,PE I,）和蓝藻中含藻尿胆素的藻红蛋白,（,PE,）。,2,、藻胆蛋白,螺旋藻的藻蓝蛋白,紫球藻的,B-,藻红蛋白,卤腥藻和念珠藻的,C-,藻蓝蛋白,微藻藻胆蛋白的研究尤为重要,比如藻蓝蛋白在可见光区,620nm,的吸收与紫外光区,280nm,的吸收之比大于,4.5,，而异藻蓝蛋白在可见光区,650nm,的吸收与紫外光区,280nm,的吸收之比大于,4.0,。,（,2,）藻胆蛋白分子的组成,藻胆蛋白是由,脱辅基蛋白（载体蛋白）,和,四吡咯结构的色基（发色团）,藻胆素,所组成。发现所有的色基均是与多肽链中的,半胱氨酸残基以硫醚键,共价结合，结合的方式分别是通过色基的,A,环或者,D,环单链相连，也有的色基,A,环和,D,环同时与脱辅基蛋白相连。在藻胆蛋白的,色基,分为：藻红胆素（,PEB,）、藻蓝胆素（,PCB,）、藻尿胆素（,PUB,）。,（,3,）主要特点,藻胆蛋白是一种古老的捕光色素蛋白质。,组成藻胆蛋白的氨基酸发生了一些特异性修饰，使之免遭蛋白酶的水解。,蛋白质的一种保护机制,（,4,）生理活性,1,、,R-,藻红蛋白,可以和胰岛素抗体产生特异的免疫反应，这表明,R-,藻红蛋白的构象或结构的某些部位和胰岛素有一定程度的相似，可能对糖尿病有一定的疗效。,2,、藻胆蛋白可以刺激人,B-,淋巴细胞的增殖反应，提高机体的免疫力。,3,、与血红素结构相似，在相似消化环境下，藻蓝蛋白可以和铁形成可溶性化合物，提高铁的吸收率。,4,、从螺旋藻中提取的藻蓝蛋白，动物实验表明它有极强的抗癌作用，尤其是对肝癌细胞。,安全无毒，藻类含量极为丰富，食品色素和化妆品,5,、藻胆蛋白结合激光辐射，可以有效地杀伤肿瘤细胞。,0.25mg/ml,藻蓝蛋白处理小白鼠骨髓瘤细胞，与对照组相比，激光辐射后细胞存活率由,15%,提高到,71%,，且对骨髓造血具有刺激作用。提示可用于临床治疗血液病及血癌。,低浓度的藻红蛋白，分别对人口腔,8113,癌细胞和小鼠,S180,瘤细胞的杀伤率高达,75%,和,76%,。这种光敏杀伤作用与藻胆蛋白的浓度规律附合曲线为：,lgY=-0.1252973-0.2391394,（,X+0.52,）,以此可以推导治疗中藻胆蛋白用量和调节激光能量大小，以发挥最大的杀伤效能。,海洋附着生物能永久或暂时性地黏附于各种固体表面,对海上生产、运输等都带来不小的麻烦。但另一方面,海洋附着生物所分泌的黏附物质在水下所展现出来的优异黏附性能是目前其他的粘合剂所不能取代的。,目前主要有两类：贻贝的足丝蛋白,(mussel foot protein),和藤壶胶,(Barnacle cement),3,、黏附蛋白,藤壶属于节肢动物门、甲壳纲、蔓足目、藤壶科，是附着在海边岩石上的一簇簇灰白色、有石灰质外壳的小动物。,藤壶，虽属甲壳动物，但成体却既不游泳，也不爬行，而是营固着生活。,藤壶粘液的粘性甚强，甚至藤壶的化石经过几千年的沧桑仍牢固地附着在其他物体上。人工合成这种粘液，可用来补牙，粘接建筑材料（又称超级水泥）；还可用来修船和粘接漏洞；在医疗上粘合伤口，手术开刀后只需涂上这种粘液即可。,贻贝属软体动物门,Mollusca,、瓣鳃纲,Lamellibranchia,、翼形亚纲,Pterimorphia,、贻贝目,Mytioida,、贻贝科,贻贝足丝中富含蛋白质成分,从外形上可以分为两部分,足丝纤维,(,byssus,),和足丝盘,(pad),。贻贝的足丝蛋白的,粘合力,及,防水性能,极强且,无毒,性,是现有任何粘合剂均无法比拟的,因此在医药、造船、涂料等行业具有广泛的应用前景。,从加州贻贝和紫贻贝足丝中鉴定到至少,8,种足丝蛋白,mfp,分别为,mfp-1,mfp-6,、胶原蛋白,preColD,和,preColNG,。,胶原蛋白主要构成贻贝足丝纤维的核心骨架部分并延伸至足丝盘,;,mfp-1,则覆盖在整个足丝表面而构成足丝的保护外套,以防止海水的溶解及微生物的降解。,mfp-2 mfp-6,则主要定位于贻贝的足丝盘,是贻贝足丝用以和外界固体表面形成黏附的主要蛋白成分,以上足丝蛋白分子量从,5,kDa,(,mfp,-3),240,kDa,(,preCol,-D),不等,但仍具有一些相似的理化性质,例如,它们的等电点相似,均为碱性蛋白,(,pI,9),并且成熟足丝蛋白大都含有大量的翻译后修饰的,3,4-,二羟基苯丙氨酸,(3,4-dihydroxyphenyl-L-,alanine,DOPA),。,MFP-1,蛋白,贻贝足丝纤维的主要成分,分子量达到了,108kD,。,一级结构具有,75,80,个串联起来的十肽重复单元。,其序列中通常含有2 种修饰性氨基酸,DOPA 和羟基脯氨酸,。,十肽重复单元,是高度亲碱和亲水性的，且,DOPA,含量较高，通过,交联和络合将大量铁离子变为坚韧而致密的涂层，保护其结构免受磨蚀和细菌等微生物的降解,。,mfp-1,的糖基化和羟基化程,度,均非常高,肽链交联紧密,所以结构异常复杂，并且不同来源的,mfp-1,在结构上存在较大差异。,mfp-1,在贻贝足丝中主要负责对足丝的保护,而非与外界的粘合作用。,MFP-2,蛋白,Mfp-2,最早从地中海贻贝,Mytilus galloprovincialis,的足丝中分离到,其分子量为,45 kDa,；,序列中同样含有,DOPA,但含量较低,(5 mol%),一个重要特征在于其序列中含有大量,半胱氨酸,因,mfp-2,主要定位在足丝盘,因此推测该蛋白可能与足丝盘黏附蛋白之间形成交联有关。,MFP-3,蛋白,Mfp-3,的,DOPA,摩尔分数较高，分子量为,57 kD,，无重复单元，且富含精氨酸，这些残基有许多被修饰成,4-,羟基,-L-,精氨酸,(R),。,Mfp-3,存在很强的蛋白多态性现象,例如,在加洲贻贝足丝蛋白中检测到,mfp-3,有,20,多种,氨基酸残基从,42,到,54,个不等,序列相似性较高。,不同贻贝来源的,mfp-3,在其分子量,DOPA,含量,序列方面均有有较高的相似性,特别是在其序列的,C,端,均存在一个,Gly-Trp-Asn-X-Gly-Trp-X(X,为,Lys,或者,Asn),的七肽片段,MFP-4,蛋白,mfp-4,也是一种定位于足丝盘的黏附蛋白,是一类质量为,93 kD,的蛋白质。,mfp-4,的序列中有,36,个富含组氨酸,His(22 mol%),的十肽重复片段,;,此外,Lys,、,Arg,以及,Asp,的含量也较高,;,表现在,N,端和,C,端分别含有,16,个富含,Asp,的十一肽重复片段。但,DOPA,的含量仅,2 mol%,。,推测这类大质量的蛋白质在足丝附着基中很可能是起稳定作用。,MFP-5,蛋白,Mfp-5,分子量,9kDa,左右，含,74,个残基,序列中,DOPA,的摩尔分数达到,30%,。,Mfp-5,中超过,1/3,的残基是翻译后被羟基化或磷酸化修饰，其中酪氨酸羟基化作用转变为,DOPA,，或,丝氨酸磷酸化,作用转变为,O-,磷酸丝氨酸,。研究发现，因,含磷酸丝氨酸的蛋白质对钙的亲和力很强,，被修饰后的磷酸丝氨酸有助于贻贝附着在毗邻的贻贝外壳上，解释了为何,Mfp-5,中含有如此高的,O-,磷酸丝氨酸。,研究发现足丝蛋白的粘合性能与,DOPA,含量呈正相关。,mfp-3,和,mfp-5,因,低分子量和高,DOPA,含量,以及由此表现的强的粘合能力而成为贻贝粘合蛋白研究中最受关注的两个蛋白分子,MFP-6,蛋白,Mfp-6,也是一种定位于足丝盘中的黏附蛋白,分子量,11.6 kDa,序列中含量最丰富的氨基酸是酪氨酸,Tyr(20.2 mol%),其次是,Gly(14.1 mol%),Cys,的含量也较高,(11 mol%),且约有,1/3,的,Cys,保留了自由的巯基,但,DOPA,的含量不到,5 mol%,mfp-6,与足丝盘,黏附蛋白的固化,有很大关系,它能通过含自由巯基的半胱氨酸,Cys,介导足丝盘黏附蛋白分子中的,DOPA,之间形成交联结构。,preColD,和,preColNG,胶原蛋白,preColD,和,preColNG,主要构成贻贝足丝纤维的核心骨架部分,(fibrous core),并延伸至足丝盘,mfp-4,可能负责足丝纤维中的胶原蛋白,与足丝盘的黏附蛋白之间的连接,同时在足丝盘黏附蛋白之间也发挥着连接作用。,糖蛋白,(glycoprotein),是指由链较短、往往带分支的寡糖与多肽链某些特定部位的羟或酰氨基以共价键形式连接的一类结合蛋白质，在生物体内广泛存在,糖生物学,(glycobiology),。,糖蛋白中的糖链对蛋白质的功能起重要修饰作用，如糖链影响蛋白质的,构象、折叠、溶解度、半衰期、抗原性及其他生物活性,。,由于糖蛋白研究的复杂性，对海洋动物中糖蛋白的研究相对较少，近年来才陆续开展起这方面的研究工作，多集中在粗提物的生理、药理活性研究方面，对均一的糖蛋白的结构以及构效关系方面的研究报道则较少。,4,、糖蛋白,抗肿瘤,生物活性肽是介于氨基酸与蛋白质之间的分子聚合物，它小至由两个氨基酸组成，大至由数百个氨基酸通过肽键连接而成，具有十分重要的生物学意义。,生物活性肽的生物学意义主要体现：,吸收机制优于蛋白质和氨基酸（指小肽）,具有氨基酸不可比拟的生理功能,两类海洋生物,多肽：,天然存在,与,酶解,得到的,多肽,（二）海洋生物活性肽,天然存在的海洋生物活性肽的种类：海绵多肽、海鞘多肽、海葵多肽、芋螺多肽、海藻多肽、鱼类多肽、贝类多肽、海星多肽、海兔多肽等,由于海洋的特殊环境，组成海洋多肽化合物的氨基酸除常见的氨基酸外，还有,-,氨基异丁酸,等多种海洋天然产物特有的氨基酸类型，具有多种生理活性,1,天然存在的活性肽,1.1,海鞘多肽,海鞘,(Ascidian),属于脊索动物门,海鞘纲与尾索动物亚门的另外两个纲称为被囊动物,(Tunicate),约有,2000,种,海鞘是被囊动物中种类最丰富、含有重要生物活性物质最多的一类。,海鞘多肽是存在于海鞘中的,环肽,，,1980,年，从海鞘,Lissoclinum patella,中首次发现的环肽,ulithiacyclamide,。脂溶性、抗癌活性,对,L1210,鼠性白血病细胞，,ID50,为,0.35g/ml,。,对,L1210,鼠性白血病细胞，,ID50,为,0.35g/ml,，,对人的,ALL,细胞线,CEM,，,ID50,为,0.01g/ml,。,1981,年,Rinehart,等从加勒比海和加利福尼亚海域的群体海鞘,Tridiemmum sulidum,分离到,3,种海鞘素,didemnine A,，,B,，,C,：,它们对,RNA,病毒和,DNA,病毒的增殖有抑制作用，对白血病细胞和,B16,黑色素瘤细胞有毒性作用。其中,didemnineB,的抗癌作用最强，只需,0.0011g/ml,的浓度就能抑制白血病细胞的生长，目前已进入临床试验，是很有发展前途的抗癌物质。,B,环七肽,去氢膜海鞘素,1.2,海兔多肽,海兔属于海洋腹足类软体动物。对海兔抗肿瘤括性肽的研究最早由,Pettit,小组以小鼠白血病淋巴瘤模型,P388,为筛选体系，对耳状截尾海兔（,dolabella auricularia,）进行系统的抗癌活性成分追踪分离，已分离到,dolastatin1,18,，多为环肤类，具有强烈抑制肿瘤细胞生长的作用。其中,dolastatin 3(2-9),对,P388,肿瘤细胞的,ED50,为,2.7l0,-7,1g,mL,-1,。机理：抑制微管聚合，促进其解聚，干扰肿瘤细胞的有丝分裂，对许多癌细胞有诱导凋亡作用，是一种细胞生长抑制剂,(cytostasis),。,环,脯,-,亮,-,缬,-,谷酰胺）,Thz-(,甘,)Thz,化合物,55,56,是从海兔分离到的直链肽，,对,P388,白血病细胞,IC,50,:0.04ng/ml.,化合物,61,是从海洋软体动物分离到的环肽,kahalalide F,，对结核杆菌有极高的抑制活性。,海洋环肽具有强的抗,病毒,和抗肿瘤活性,这些环肽主要来源于海鞘和海兔,1.3,海葵多肽,文献报道从海洋生物海葵中提取得到的溶细胞性活性肽有：,(1),存在于,16,种海葵中的,鞘磷脂抑制性碱性多肽,平均相对分子质量在,15,，,000,21,，,000,之间。,(2),从,Metrid rumsenile,属海葵中分离得到的,具胆固醇抑制活性肽,其平均相对分子质量在,80,，,000,左右。,1.4,海绵多肽,海绵多肽是存在于离海绵目、,外射海绵目、石海绵目,、软海绵目以及硬海绵目等海绵中的环肽化合物，目前已分离得到近,40,种。,discodermins,A,D,是从日本伊豆诸岛海域采集的海绵中获得，,A,可抑制枯草杆菌和奇异变形杆菌，具有抗炎作用。,A,D,均能抑制海星胚胎发育，且是磷酯酶,A2,的有效抑制剂，,IC50,为,350,700nmol,L,-1,。,1.5,芋螺多肽,芋螺,(Conus),是海洋腹足纲软体动物,其在猎取鱼、海洋蠕虫、软体动物时常分泌一系列毒性物质,称为芋螺毒素,(Conotoxin),即芋螺多肽。,目前已发现的芋螺毒素有近百种，大多为由,10,30,个氨基酸残基组成的小肽，富含两对或三对二硫键，是迄今发现的,最小核酸编码的动物神经毒素肽，也是二硫键密度最高的小肽,。主要有,-,芋螺毒素、,-,芋螺毒素、,-,芋螺毒素及,-,芋螺毒素等。其活性与蛇毒、蝎毒等动物神经毒素相似,可引起动物出现惊厥、颤抖及麻痹等症状,花冠芋螺,织锦芋螺,番红花芋螺,将军芋螺,1.8,生物防御素,生物防御素,(Defensin),是近年来发现的一组新型抗菌活性肽。它们通常都是由,35,50,个氨基酸残基组成,且分子内富含二硫键,。由于其具有牢固的分子骨架、广泛的分布以及生物活性功能,因而对它们的研究已成为当前国际学术界中一个引人关注的研究热点。,海藻多肽已从绿藻、蓝藻等中分离得到。据报道，利用绿藻水提物制得一种内含活性多肽成分。从培养的蓝藻中也分离出一种具有,鱼毒性、抗菌、杀细胞活性的生物活性肽,已具备大规模生产能力。另外，还从海藻,Pyymnesium,patelliferum,属中提取出一种毒素肽,Hormothamin,，从蓝,-,绿海藻属,Lyngbya,majuscula,中分离得到具有细胞毒活性的环肽,Majusculamide,C,2,水产食品中天然存在的活性肽,存在于鱼贝类组织中的天然肽类只有,:,三肽的谷胱甘肽；是一种特殊的,Aa,衍生物，又是含有巯基的三肽；,鹅肌肽、鲸肌肽：属咪唑化合物，统称为咪唑二肽，是肉品风味的前体物质。,这些咪唑化合物一般在游泳能力强的鱼类及鲸类肌肉中含量较多，因为咪唑环的,pK,值在生理,pH,附近，被认为是具有缓冲作用的物质。,天然存在的活性肽大部分或含量微少,或提取难,不足以大量生产供给所需,;,化学人工合成又费时费力,成本昂贵,;,因此,人们更多地把目光投向开发蛋白酶解产物这条途径上来。,3,通过酶解得到的活性肽,水解营养蛋白生产生物活性肽的理论依据,:,在贮藏、营养蛋白的多肽链内部可能普遍存在着功能区,选择适当的蛋白酶水解,这些多肽有可能被释放出来,从而制备各种各样的生物活性肽。,目前，应用于酶解海洋动物蛋白的酶主要还是陆源蛋白酶，包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶、热菌蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胶原蛋白酶、木瓜蛋白酶等,从生物进化上看,营养和贮藏蛋白应该是从功能蛋白进化而来的,因为原始的生物是不可能合成大量此类蛋白的。当生物进化到需要为后代发育提供营养时,它不可能凭空制造出一种营养蛋白,最好的方法就是通过若干功能区,(,结构域,DomainDNA,）,“,组装,”,出营养或贮藏蛋白基因。所以,在不同的营养和贮藏蛋白的多肽中可能广泛存在着不同的功能区,选择适当的蛋白酶就可将其释放出来,还原其功能特性,通过这种方法可以获得相当广泛的生物活性短肽。,从免疫学看,尽管不同的生物都具有功能上非常相似的蛋白质,但是由于其非功能区存在着较大氨基酸差异,所以不能互相使用,因为生物正是通过免疫系统识别自身蛋白和外来蛋白的这些非功能区的差异来清除异己和保持自身稳定性的。如果我们把注意力放在这些具有不同生理功能的生物活性短肽上,则我们可能有效地避免免疫排斥反应的困扰。,例如,乳转铁蛋白用于注射可能会产生免疫排斥反应,但如果用其水解所得到的短肽,就可能安全地用于注射。,又如,实验证明免疫活性肽和白细胞介素相似,可以激活,T,细胞和巨噬细胞,从而增强机体免疫力,虽然它来源于动物蛋白,但研究表明它可能安全地用于医药。,4,海洋生物,活性肽生理活性,易消化吸收,（比氨基酸更易吸收）、保护胃粘膜及抗溃疡作用、,抗菌,、,抗氧化,、抗过敏、,降血压,、降胆固醇、抗衰老、,抑制肿瘤细胞生长,、抑制,AIDS,病毒、促进伤口愈合、增强骨强度和预防骨质疏松、预防关节炎、促进角膜上皮损伤的修复和促进角膜上皮细胞的生长等,4.1,降压活性,原,活性评价方法,活性评价方法：体外实验法和动物实验法。,体外实验法：,1971,年,Cushman,建立了体外紫外光度法,在,37,、,pH8.3,即模仿体内环境的条件下,ACE,降解血管紧张素,I,的模拟物,Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine(HHL),产生马尿酸，当加入降血压肽抑制,ACE,的降解作用后，马尿酸的生成量减小，通过在紫外,228nm,处测量马尿酸的光吸收值得到马尿酸的生成量，从而评价降血压肽的抑制效果。,从海洋低值鱼虾中分离出具有抗高血压活性的活性肽。其氨基酸序列如下,:,C8,肽,(,沙丁鱼,):Leu-Lys-Val-Gly-Val-Lys-Gln-Tyr,C11,肽,(,沙丁鱼,):Tyr-Lys-Ser-Phe-Ile-Lys-Gly-Tyr-Pro-Val-Met,C8,肽,(,金枪鱼,):Pro-Thr-His-Ile-Lys-Trp-Gly-Asp,C3,肽,(,南极磷虾,):Leu-Lys-Tyr,提高抑制血管紧张素转化酶,ACE,的活性而,具有降压功能。水解,Pr,条件温和，食用安全性极高，突出优点是对血压正常的人无降压作用。,从,鳕鱼,排中分离得到的分子量分别为,30K,10K,5K,和,3K,的四种活性寡聚肽，具有,ACE,抑制活性，且,ACE,抑制活性随相对分子量降低而显著增加，分子质量为,3 K,的多肽具有,最强的,ACE,抑制活性,。此肽具有很好的水溶性，且无苦味，因此,更易投入实际应用。,相对分子质量为,5 K,的多肽具有显著的,抗氧化活性,其抗氧化活性与,-,生育酚相当。,贻贝蛋白酶解降血压肽的降压活性及相对分子质量与氨基酸组成,1,实验方法,1.1,选取复合蛋白酶,P1,，在不同酶解条件下对贻贝蛋白进行水解，采取,Uniform Design(,均匀设计,),方案，研究不同酶量、酶解时间、酶解温度、,pH,等因素对,ACE,的抑制效果，并选择最佳的酶解条件。,1.2,酶解液经纯化、加入活性修饰剂,MAl,，提取，冷冻干燥，制备降血压肽，进行活性检测。,文献阅读,1.3,酶解样品,ACE,抑制效果评价,用紫外分光光度法分析不同酶解条件下制备的酶解降血压肽的,ACE,抑制活性。,228nm,下测定其吸光值。,将各酶解液反应值与空白样品对照，分析所得酶解降压肽的,ACE,抑制率,P,：,P=A-A(control)/A100,1.4,高效液相色谱法测相对分子质量,-,标准曲线法,色谱条件：,Waters 600,高效液相色谱仪；色谱柱：,TSK gel 2000,；流动相：,V(,乙腈,),：,V(,水,),：,V(,三氟乙酸,)=45,：,55,：,0,1,，检测波长：,220 nm,，体积流量：,0,5 mL/min,，柱温：,30,。,相对分子质量校正曲线所用标准品：细胞色素,c(MW 12500),，抑肽酶,(MW6500),，杆菌酶,(MW 1450),，乙氨酸,-,乙氨酸,-,酪氨酸,-,精氨酸,(MW 451),，乙氨酸,-,乙氨酸,-,乙氨酸,(MW 189),。,取酶解降血压肽溶解，定容，取上清液滤纸过滤，再用,0,22um,微孔滤膜过滤，以供进样。,1.5,降血压肽氨基酸组成分析,水解氨基酸检测：取样品，加,6 mol/L,盐酸水解，,110,，,24h,，然后用,0,3 mm,膜微孔过滤，定容，进样氨基酸自动分析系统进行检测。,游离氨基酸检测：取样品，加水溶解，超声波振荡混匀，加适量盐酸调酸，,0.3 mm,膜微孔过滤，定容，进样氨基酸自动分析系统进行检测。,1.6,降血压肽的动物试验,将样品以,3.0 g,kg,-1,体重的剂量进行灌喂。灌喂前和灌喂之后第,2,、,4,、,6,、,8,、,10,小时分别检测收缩压,1,次，记录各血压值,。,2,结果及讨论,2.1,酶解条件对降血压肽,ACE,抑制率的影响,回归分析得回归方程：,Y=70.464-1.195X,1,+15.299X,2,+11.971X,3,-4.310X,2,2,+0.194 X,1,X,2,-0.141X,3,X,4,由此最佳的,ACE,抑制活性为,90.23,，但试验结果,ACE,抑制率为,86,55,。,2.2,降血压肽的相对分子质量组成检测结果,降血压肽样品相对分子质量范围在,1.6 ku,以内，从,1,1.6ku,，即,lO,15,、,16,肽的范围，其含量为,49.66,，,0.6,1ku,，即,5,10,肽范围，样品含量为,15.73,，,0.2,0.6ku,范围内为,7,96,，主要为,2,肽,4,肽的小肽。,目前比较公认的是酶解降血压肽的分子量相对于蛋白质来说较小，一般在几个,ku,以内。,2.3,降血压肽的氨基酸组成检测结果,分析氨基酸组成与酶解质量和降血压活性之间的关系,样品含有较高比例的必需氨基酸,8.57,水解氨基酸总量为,59.6,游离氨基酸总量为,8.8,谷氨酸被认为能促进脑细胞进行呼吸，利于脑组织中氨的排除，调节人体的新陈代谢，而这将会对血压造成一定的影响,2.4,降血压肽的降压效果,处理,4 h,和,6 h,血压变化的,F,值,0.05(2,，,9),，说明服用降血压肽,4 h,和,6 h,效果有显著差异；,降血压肽在,26 h,之内的降压效果具有显著性,(P=0,05),，血压平均降低幅度为,18,28mmHg,。在,6 h,处降压效果达到最大值为,28mmHg,，且效果极为显著,(P=0,01),。,抗肿瘤活性,抗菌性,水生动物抗菌肽的研究主要集中于甲壳纲动物,:,1988,年，从中国鲎血细胞用酸提取法得到一种含,17,个氨基酸的抗菌肽,鲎素，能与细菌细胞壁中的脂多糖成分结合形成复合物，在很低浓度下就能抑制,G,-,及,G,+,细菌的生长。鲎素在低,pH,、高温下相当稳定，是一种有应用前景的抗菌活性物质。,1995,年，从,鲎,体中分离得到一个,79,肽,与兔和牛的,嗜中性白血球防御素,相似,;,Noga,等认为美洲,蓝蟹,的血细胞具有抗菌活性,;,Schnapp,等从,青缘蟹,的血细胞中分离得到,3,种具有杀菌作用的肽,它们能够,选择性地作用于细菌外层细胞膜的某些组分,如带阴离子的磷脂,增大其渗透性而杀死或抑制细菌的生长,;,Chisholm,等研究包括,龙虾,和,对虾,在内的,8,种甲壳动物的,血细胞溶泡上清液,对数种细菌的杀菌作用,证明其含有能杀灭细菌的因子,;,Song,等发现,罗氏沼虾,受感染后会诱导产生类似杀菌肽类的物质；,Destoumieux,等从养殖的,南美白对虾,的血细胞和血浆中分离出几种抗菌活性因子,其中,3,种具有,抗真菌和抗细菌尤其是抗革兰阳性菌,的活性。,Azumi,等从一种,海鞘,Halocy amine roretzi,的血细胞中分离得到的抗菌肽,Halocyamine A,不仅在体外可,抑制某些鱼,RNA,病毒的生长,也能抑制某些海水细菌的生长,。,Fernandes,等从,虹鳟鱼皮,中分离得到一种具有抗菌作用的核蛋白肽,在,抵御胞内或胞外病毒,方面起着关键作用。,最近的研究发现,鱼类,中也存在大量的抗菌肽,Oren,等从,豹鳎,中分离得到一种,33,肽的抗菌肽,具有比,蜂毒素,更强的抗菌活性,其作用可与其他天然的抗菌肽如蛙皮素、杀菌肽等相比,;,电镜观察显示其抑菌机理是,溶解细菌的细胞壁,。,Conlon,等从,海七鳃鳗,的皮肤上分离得到,富含半胱氨酸和精氨酸,的多肽,其氨基酸序列与老鼠的抗菌肽,corticostatin R4,和兔的抗菌肽,corticosta2tin R1,结构相似。,从软体动物,贝类,的血液中提取到,2,种富含阳离子与胱氨酸的抗菌小肽,其中,1,种含有,34,个氨基酸残基,命名为,Mytilin,结构如下,:Gly-,Cys,-Ala-Ser,Arg-,Cys,-Lys-Ala-Lys-,Cys,-Ala-Gly-Arg-Arg-,Cys,-Lys-Gly-Try-Ala-Ser-Ala-Ser-Phe-Arg-Gly-Arg-,Cys,-Tyr-,Cys,-Lys-,Cys,-Phe-Arg-,Cys,;,另一种含,35,43,个氨基酸残基,属于昆虫防御家族肽,与上述的,Mytilin,的结构相似,它富含,8,个胱氨酸，具有广谱抗细菌、抗真菌活性。,牡蛎软体中抗菌蛋白的制备及活性研究,材料：长牡蛎、大连湾牡蛎和近江牡蛎的肉,菌株,溶壁微球菌、生孢梭菌,CMCC(B)64941,、白色,念珠菌,CMCC(F)98001,、金黄色葡萄球菌,JP-04-,08,、,ATCC25922,、表皮葡萄球菌,BP-04-18,、大肠,埃希氏菌,PC-04-21,、,ATCC25923,、铜绿假单胞菌,LN-04-12,、,ATCC27853,、变形杆菌,BX-04-10,、肺,炎克雷伯杆菌、肠球菌、不动菌属。,质控菌株,金黄色葡萄球菌,ATCC 25922,、大肠埃希氏菌,ATCC25923,、铜绿假单胞菌,ATCC 27853,。,文献阅读,美国模式培养物保藏所,中国生物制品检定所,方法,1.,抗菌蛋白的制备,1.1,粗蛋白的制备：取鲜活牡蛎,510 kg,以纯水冲洗后取牡蛎软体,洗净沥干约,500 g,，经粉碎、低温研磨过,100,目筛,按重量比,(w/w)11,加入注射用水,在,14,搅拌提取,68 h,匀浆液离心,(4000 r/min,40 min),得蛋白粗提上清液。,1.2,液体浓缩蛋白的制备：将获得的粗提液采用,SMB220,生物型错流超滤系统分级,(,膜截留分子量为,50,kDa,),再以截留分子量为,10,kDa,的膜浓缩,5,倍。浓缩液密闭存放或制备成冻干粉。,1.3,蛋白的分离纯化：取超滤浓缩液,2.0ml,上样于,pH 3.8,柠檬酸,-Na,2,HPO4,缓冲液充分平衡后的,CM-Sepharose FF,层析柱,(2.5 cm10 cm),进行层析,用,200 ml,含,0-1.0 mol/L NaCl,的缓冲液,进行线性梯度洗脱,收集活性峰,脱盐浓缩,后，上样到以,pH 6.5NaH,2,PO4-Na,2,HPO4,缓冲液充分平衡的,SephadexG-100,层析柱,(1.6 cm60 cm),进行层析,用平衡液进行洗脱,收集活性峰,脱盐浓缩后,20,保存备用。以上纯化操作均在,4,进行。,2,抗菌蛋白性质分析,2.1,纯度和分子量测定,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定：蛋白浓缩液,(10l,15l),直接上样进行,SDS-PAGE,分析,分离胶浓度为,15,电泳条件,:,电压,200 V,56 min,用,0.5,考马斯亮蓝,R250,染色,使用不同分子量的标准蛋白对抗菌蛋白进行分子量及其分布测试及分析。,采用,SDS-PAGE,方法测定：纯化蛋白测定，分离胶浓度为,12%,用,0.5%,考马斯亮蓝,R250,染色。,2.2,含氮量测定,取,3,批次,(200305021,、,20030808,、,20040411),牡蛎海洋溶菌酶冻干粉按照中华人民共和国药典,(2000,年版二部,),附录,D,氮测定法测定。,3,体外实验,3.1,最低抑菌浓度（,MIC),测定,采用平皿二倍稀释法和,Denlay,多点接种器进行药敏试验，试验菌用营养肉汤及脑心浸液增菌,;,抗菌蛋白海洋低温溶菌酶,用水解酪蛋白琼脂,(MH),肉汤二倍稀释成各种所需浓度,分别加适量至平皿中，,MH,培养基熔化后定量注入含药液平皿内混匀：生孢梭菌最终浓度为,1510,6,cfu/ml,白色念珠菌,1810,6,cfu/ml,其他菌液为,110,5,cfu/ml,需氧菌,37,培养,18 h,真菌,2025,培养,48 h,厌氧菌置厌氧孵箱,3035,孵育,48 h,后观察结果,无菌生长的平皿中所含药物最小的浓度即为,MIC,。,3.2,最低杀菌浓度,MB,测定,采用试管二倍稀释法,先测出试验菌的,MIC,再依次将未见细菌生长各管培养液分别吸取,0.1 ml,转移到不含药液的琼脂平皿中,培养条件同,MIC,测定,观察测定结果,平皿上菌落数,5,个的最小药物浓度即为,MBC,。,4,透射电镜观察抗菌蛋白对大肠埃希氏菌超微结构的变化,试验以正常大肠埃希氏菌培养,12h,制备透射电镜样品作阴性对照组。,以,LB,液体培养基将抗菌蛋白稀释成,1.25 mg/ml,加入对数生长期的大肠埃希氏菌,使浓度为,110,5,cfu/ml,。摇床中培养,(37 min,200 r/min)12 h,离心弃上清,沉淀用磷酸缓冲液洗涤,3,次,制备透射电镜样品。固定、脱水、切片和染色后,作为实验组。透射电镜下观察大肠埃希氏菌超微结构的变化。,结果,1,抗菌蛋白的分离纯化,抗菌蛋白经,CM-,Sepharose,FF,阳离子交换层析分离后,盐洗脱峰为活性峰,洗脱曲线见图,1,收集活性峰浓缩后上样于,Sephadex,G-100,凝胶层析柱,洗脱曲线见图,2,第二个峰为活性峰,收集活性峰透析浓缩后作为纯化样品使用。,2,抗菌蛋白性质分析,2.1,抗菌蛋白纯度和分子量测定,由图,a,可见,牡蛎海洋溶菌酶为含多种蛋白的混合物,其分子量分布较宽,从,10 KD,一直到,100 kDa,都有分布,其中分子量分布在,15 kDa,和,23 kDa,左右的组分含量较多。,三批牡蛎海洋溶菌酶浓缩液均为多种蛋白的混合物,其电泳条带相同,各条带的分布及浓度基本相同,说明样品制备的重现性良好,工艺稳定,产品质量稳定,见图,b,。,纯化样品为单一条带,由标准蛋白可知分子量约为,39,kDa,。,2.2,含氮量测定,3,批次抗菌蛋白冻干粉蛋白含量见表。,2.3,抗菌蛋白对生孢梭菌、白色念珠菌的抗菌作用,抗菌蛋白对生孢梭菌最低抑菌浓度为,0.0156%,最低杀菌浓度为,0.0313%;,对白色念珠菌最低抑菌浓度和最低杀菌浓度均为,0.0625%,2.4,抗菌蛋白对临床常见致病菌和标准质控菌株的抗菌活性,表明抗菌蛋白对临床常见的致病菌具有良好的抗菌作用且呈剂量依赖性,对,3,株标准质控菌株也有较好的抗菌作用,2.5,抗菌蛋白对大肠杆菌超微结构的作用研究结果,对照组,:,正常大肠杆菌形态为直杆状,细胞壁和细胞膜完整光滑,结构紧密,细胞膜紧贴细胞壁,细胞质均匀。,抗菌蛋白,(1.25 mg/ml),组,大肠杆菌的形态发生改变,随时间的延长变化越来越明显,:,作用,1 h,后,细胞壁松弛出现皱褶,菌体变短变粗,呈椭圆形,细胞质固缩,;2 h,后,大部分菌体呈圆球形,;3 h,后,菌体呈不规则形,细胞壁缺失,细胞质解体出现空腔,菌体裂解。,抗氧化性,Iwamoto,等研究了鲭鱼肽对低密度脂蛋白,(LDL),氧化的抑制作用。结果表明,鲭鱼肽能够显著延长氧化反应的诱导期。,对,16,名平均年龄为,19,岁的女性志愿者进行了体内抗氧化实验。对照期内食用含酪蛋白的食物,实验期内食用含鲭鱼肽的食物,剂量按,16.9g,蛋白,/d,共,10d,。其他膳食组分同。提取静脉血试样测定,LDL,的氧化情况，结果表明,试验组第,10d,时静脉血试样,LDL,氧化的诱导期,(66.2min),比,0d,时静脉血试样,LDL,氧化的诱导期,(57.9min),长,而对照组在,0d,和,10d,的静脉血试样,LDL,氧化的诱导期之间不存在差异。,Kim Se-Kwon,等报道,黄鳍舌鳎鱼皮胶原酶解得到的多肽也具有较好的抗氧化活性。,采用现代生物工程技术,从