硅烷化GC-MS检测烟叶中的有机酸.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,硅烷化,GC-MS,法检测烟草中的挥发性和半挥发性有机酸,学生：傻,摘 要,采用硅烷化,GC-MS,法对烟草中的挥发性与半挥发性有机酸进行分析，共鉴定出,26,种挥发酸和半挥发酸，并分别对其进行定量检测结果表明：该方法的标准曲线的相关系数都在,0.999,以上，回收率为,80.51%-118.60%,重复性的相对标准偏差,(RSD),为,0.81%-4.66%,。应用该方法检测云南不同生态区的八个烤烟品种，结果显示其中的挥发性有机酸差异不显著，半挥发性有机酸差异显著。,一,.,材料与仪器,烟草样品,2008,年预实验烤烟样和种植于云南各生态区的,8,个烟草样品（见表,8,）。,试剂及标样,二氯甲烷、,N,、,O-,双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（,BSTFA,）；甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、,2-,甲基丁酸、,3-,甲基丁酸、戊酸、,3-,甲基戊酸、,4-,甲基戊酸、己酸、庚酸、苯甲酸、辛酸、壬酸、十二酸、十三酸、十四酸、十五酸、十六酸、十七酸、亚油酸、油酸、亚麻酸、十八酸、苯乙酸甲酯（内标）、山梨酸（内标）、肉桂酸,(,内标,),，以上试剂及标样均为,AR,（分析纯试剂）。,仪器,气相色谱,-,质谱联用仪（美国,PE Clarus600,）、超声波萃取仪（,KQ-1500VDE,型，昆山市超声仪器有限公司）、电子天平（,Sartorius,，,0.01mg,）。,二,.,结果与分析,2.1,衍生化试剂对标样用量选择,衍生化试剂对标样有机酸总量的影响,0,100,200,300,400,500,600,700,800,900,5l,10l,15l,20l,25l,30l,35l,40l,衍生化试剂用量,有,机,酸,总,量,系列,1,2.1,衍生化试剂对标样用量选择,由图可知，在衍生化试剂用量,8,个水平因素中，,BSTFA,用量对有机酸总量的影响差异不明显，其总量相对标准偏差仅为,1.21%,。故认为,5L,以上的,BSTFA,用量即可使所加入的有机酸完全衍生化。另因,5L BSTFA,量太小不易操作，因此选用加入,10L BSTFA,为最佳用量。,2.2,衍生化试剂对烟样用量选择,2.3,衍生化介质的选择,由图可知，当二氯甲烷为衍生化介质时，有机酸总量最高，乙醚次之，丙酮则最低，这可能是由于丙酮分子羟基上的氢原子较活泼，容易与衍生化试剂发生反应消耗大量,BSTFA,的缘故。,2.4,衍生化时间的选择,2.4,衍生化时间的选择,由图可知,衍生化时间从,10,40min,，有机酸总量由快到慢逐渐上升，在,40min,时出现第一个拐点；而从,40,80min,，其总量变化趋势不明显，相对标准偏差仅为,1.79%,，故认为其总量在衍生化,40min,以后即可被完全硅烷化。但为了充分保证有机酸能完全衍生化，取,60min,为最佳衍生化时间。从衍生化时间对各个有机酸的衍生化效率（各衍生化时间下有机酸的半定量值除以,60 min,时各有机酸的比值）来看，低级脂肪酸在较短的时间内即可完全衍生化，而高级脂肪酸则需要较长的时间，这是由于低级脂肪酸的羧基比高级脂肪酸的更活泼，更容易与衍生化试剂反应的缘故。,2.5,衍生化温度的选择,2.5,衍生化温度的选择,由图可知，在衍生温度为,5-90,之间，有机酸总量无明显差异，其相对标准偏差仅为,1.68%,，由此可以说明，在此温度范围内，衍生温度对有机酸总量的影响较小，均能完全地完成衍生化反应。因此本着简便、易操作的原则，选取常温为最佳衍生化温度。,2.6,超声时间的选择,2.6,超声时间的选择,由图可知，超声波萃取时间对有机酸总量（,g/g,烟样）有显著的影响，在超声萃取的七个水平因素中，随着萃取时间的延长，有机酸总量明显增加，并在,50 min,时达到最大值，而,60 min,时有机酸总量与,50 min,时相比无明显变化。故可认为,50min,的超声萃取时间即能将有机酸最大程度地从烟草颗粒中萃取出来，并将,50min,作为最佳的超声萃取时间。,三,.,结果与讨论,3.1,标准曲线的建立,准确移取混合标样贮备液,0.05,、,0.5,、,1.0,、,2.0,、,3.0,、,4.0,、,5.0,、,6.0ml,分别置于,8,个,10ml,容量瓶中，并加入混合内标贮备液各,0.5ml,（山梨酸：,0.5024mg/ml,；,10.2050mg/ml,），二氯甲烷定容至刻度，摇匀，即可得到,8,个不同浓度的有机酸标准溶液（表,5,）。取有机酸标准溶液,8,份，各,0.5ml,，按照优化的前处理方法和样品分析方法进行前处理和,GC-MS,分析。根据公式（,1,），由软件,TurboMass Ver5.3.0,按照最小二乘法得出各有机酸的标准工作曲线，通过回归分析得到各有机酸的回归方程及回归方程的相关系数（表,4,）。结果显示，相关系数全部在,0.999,以上，因此在所配的标准溶液浓度范围内，各有机酸的标准工作曲线的线性关系较为理想,有机酸名称,线性回归方程,相关系数,r,甲酸,Y=2.98797X-9.71413,0.999824,乙酸,Y=2.27091X+7.54751,0.999827,丙酸,Y=1.89699X-2.29505,0.999348,异丁酸,Y=1.37085X-1.98486,0.999204,丁酸,Y=1.53381X-2.08013,0.999306,2-,甲基丁酸,Y=1.08789X-1.35911,0.999514,异戊酸,Y=1.27569X-1.35281,0.999515,戊酸,Y=1.21913X-1.47973,0.999556,3-,甲基戊酸,Y=0.949723X-0.847781,0.999611,庚酸,Y=0.891418X-0.529784,0.99931,苯甲酸,Y=3.78874X-4.96709,0.99981,辛酸,Y=0.887612X-0.900817,0.999694,壬酸,Y=0.668719X-0.368821,0.999667,癸酸,Y=0.643596X-0.235014,0.999633,十二酸,Y=0.427658X-0.465772,0.999565,十三酸,Y=0.342684X-0.317668,0.999447,十四酸,Y=0.488738X-0.855997,0.999647,十五酸,Y=3.79006X-0.909971,0.999491,十六酸,Y=0.340198X+6.46319,0.999984,十七酸,Y=0.271687X-0.719057,0.999021,亚油酸,Y=0.0742686X-0.441064,0.999451,油酸,Y=0.0301678X-0.399988,0.999581,亚麻酸,Y=0.0335118X-0.326350,0.999787,十八酸,Y=0.210720X-8.21751,0.99941,3.2,方法的重复性,准确称取预试验验烟样（过,40,目筛）,6,份，各,2.5g,，加入到能完全密封的,6,个离心管（约,40 ml,）中，然后往离心管中分别加入,10 ml,的二氯甲烷和,100l,混合内标（山梨酸：,0.9043 mg/ml,；肉桂酸：,18.369 mg/ml,），采用上述所建立的前处理方法和样品分析方法分析样品。结果见表,6,。结果显示，所测定的,26,种有机酸，,6,次测定结果,（,g/2.5g,烟样）的相对标准偏差在,0.81%,4.66%,之间，表明实验方法的重复性较好，适于烤烟中挥发性、半挥发性有机酸的定量分析,有机酸名称,1#,2#,3#,4#,5#,6#,平均值,RSD/%,甲酸,24.94,27.11,25.51,25.14,26.82,26.09,25.94,3.44,乙酸,145.64,150.29,149.66,144.01,152.91,153.85,149.39,2.61,丙酸,7.82,7.37,7.35,7.77,7.44,7.19,7.49,3.34,异丁酸,2.26,2.29,2.41,2.38,2.32,2.4,2.34,2.65,丁酸,1.86,1.86,1.87,1.87,1.83,1.85,1.86,0.81,2-,甲基丁酸,2.6,2.85,2.86,2.84,2.77,2.81,2.79,3.51,异戊酸,1.96,2,1.91,1.99,1.9,1.98,1.96,2.16,戊酸,5.55,5.21,5.56,5.16,5.27,5.15,5.32,3.56,3-,甲基戊酸,1,1.07,1.09,1.07,1.02,1.05,1.05,3.24,4-,甲基戊酸,0.84,0.85,0.87,0.85,0.87,0.83,0.85,1.88,辛酸,2.98,2.97,3.23,3.04,2.99,3.16,3.06,3.54,壬酸,1.48,1.45,1.58,1.53,1.43,1.54,1.50,3.85,癸酸,1.59,1.56,1.62,1.57,1.62,1.63,1.60,1.83,十二酸,3.48,3.52,3.5,3.53,3.52,3.36,3.49,1.83,十三酸,1.05,1,1.02,1.05,0.99,0.98,1.02,2.97,十四酸,59.01,56.12,61.96,59.18,56.7,59.5,58.75,3.59,十五酸,27.21,24.86,26.85,25.62,24.71,26,25.88,3.94,十六酸,1757.5,1804.0,1931.3,1880.8,1816.3,1769.8,1826.67,3.67,十七酸,64.17,69.64,63.87,70.15,65.73,68.24,66.97,4.11,油酸,2297.8,2369.5,2413.6,2236.5,2419.7,2270.5,2334.63,3.31,亚麻酸,2011.5,2094.5,1963.9,2161.7,2013.3,2055.6,2050.13,3.43,十八酸,712.27,724.63,730.93,700.57,733.63,728.55,721.76,1.77,3.3,方法的回收率,采用标准加入法。以加入标准样品的烟样平行做,4,个样品，取,4,次的平均值为测定总值，重复性,6,次的平均值为样品值计算回收率。结果见表,7,。所测定有机酸的回收率除了辛酸,124.30%,和癸酸,126.61%,较高外，其余在,80.51%,118.60%,之间，因有些有机酸含量较低，容易出现偏差，故认为该结果较准确，适于烤烟中挥发性、半挥发性有机酸的定量分析。,有机酸名称,样品值,/g,加入量,/g,测定总值,/g,回收率,/%,甲酸,25.94,77.00,95.36,90.16,乙酸,149.39,466.00,560.99,88.33,丙酸,7.49,17.26,22.56,87.30,异丁酸,2.34,25.14,22.98,82.07,丁酸,1.86,6.56,7.72,89.30,2-,甲基丁酸,2.79,103.48,86.85,81.24,异戊酸,1.96,107.31,88.35,80.51,戊酸,5.32,6.47,12.13,105.22,3-,甲基戊酸,1.05,6.82,6.65,82.16,4-,甲基戊酸,0.85,1.10,2.04,107.91,己酸,3.86,6.79,11.20,108.56,庚酸,0.79,1.90,3.04,118.60,苯甲酸,5.57,15.66,19.60,89.56,辛酸,3.06,7.00,11.74,124.30,壬酸,1.50,4.31,6.42,114.32,十三酸,1.02,4.54,4.83,83.92,十四酸,58.75,137.76,197.29,100.57,十五酸,25.88,60.96,76.75,83.45,十六酸,1826.67,3368.04,4756.88,87.00,十七酸,66.97,185.16,252.86,100.39,亚油酸,1060.03,1769.16,2976.23,108.31,亚麻酸,2334.63,2143.32,4756.58,113.22,油酸,2050.13,4080.24,6238.13,102.64,十八酸,721.76,835.56,1524.41,96.06,3.4,测定样品,采用本法，对种植于云南省不同生态区的,8,个烟草进行了定量分析（见表,8,）。结果显示，种植于不同生态区不同品种的烟草样品有机酸含量有明显差异。,26,种挥发性、半挥发有机酸总量从高到低依次是,NC297,（玉溪）、云烟,85,（普洱）、云烟,87,（文山）、,K326,（大理）、红大（昆明）、中烟,100,（曲靖）、云烟,97,（红河）、云烟,99,（昭通）；挥发性有机酸（碳,10,以下）除了云烟,99,（昭通）含量,161.1g,较低外，其它,7,个品种含量差异不显著；半挥发性有机酸的含量差异明显，它们的排序与,26,种有机酸总含量排序一致。,有机酸名称,红大,(,昆明,),云烟,99(,昭通,),K326(,大理,),云烟,85(,普洱,),云烟,87(,文山,),中烟,100(,曲靖,),云烟,97(,红河,),NC297(,玉溪,),甲酸,26.532,5.804,17.29,33.74,25.32,13.94,16.55,3.25,乙酸,199.464,140.224,194.52,201.616,222.188,176.57,185.9,239.06,丙酸,3.916,0.732,3.27,3.252,2.824,3.33,3.62,3.8,异丁酸,1.532,0.96,1.92,1.2,1.224,2.07,2.28,2.54,丁酸,0.948,0.8,1.36,0.732,0.632,1.38,1.94,1.82,2-,甲基丁酸,2.204,1.116,3.17,2.104,2.26,4.04,2.82,3.5,异戊酸,1.676,0.816,1.53,1.168,0.952,1.54,1.6,2.03,戊酸,2.168,2.704,2.24,1.784,1.62,2.02,3.7,4.73,己酸,2.128,1.58,2.29,1.536,1.344,2.12,2.63,2.87,庚酸,0.448,0.312,0.64,0.66,苯甲酸,2.992,2.092,2.9,3.332,4.356,2.2,2.79,3.48,癸酸,1.736,0.984,0.76,2.064,2.056,0.78,1.52,2.18,十二酸,2.876,0.94,1.296,0.712,1.42,2.12,十三酸,0.488,十四酸,34.448,28.472,40.12,41.836,43.424,33.27,31.85,35.52,十五酸,16.448,13.7,17.13,18.66,18.148,14.96,15.52,25.29,十六酸,1634.38,1268.424,1516.44,1821.616,1666.696,1380.8,1265.9,1778.52,十七酸,43.52,38.3,47.88,56.544,55.788,34.06,43.78,69.94,亚油酸,918.588,692.216,1003.03,1252.38,1139.224,721.95,747.96,996.06,油酸,1472.00,1304.732,1845.32,2261.232,2396.184,1516.98,1498.96,3169.04,亚麻酸,1857.65,1760.408,2079.94,2496.124,2092.832,1850.2,1644.47,2088.41,十八酸,480.656,412.78,517.56,612.492,593.968,467.14,465.32,684.33,总量,6710.64,5681.072,7300.41,8816.94,8273.676,6230.41,5946.34,9124.58,3.5,讨论,鲁喜梅的研究表明，硅烷化的最佳衍生化温度为六十摄氏度，但本试验优化的最佳衍生化温度为常温，这可能是由于不同的气象色谱质谱联用仪使用不同的程序升温使得各试验产生不同的最佳衍生化温度。,郭磊等采用加速溶剂萃取、硅烷化和,GC-MS/SIM,法同时测定了烟叶中的甲酸、乙酸、乳酸、苯甲酸、十六酸和十八酸等,26,种挥发性、半挥发性有机酸，其重复性的相对标准偏差在,1.34%-5.67%,。本试验也检测出了,26,种挥发性、半挥发性有机酸，但本试验重复性的相对标准偏差在,0.81%-4.66%,，较前者本方法更为准确，这可能是由于在硅烷化的过程中使用离心管代替三角瓶对烟叶中的有机酸进行超声波提取，使得其密封性大大提高了，减少了误差。,四,.,结论,本实验对硅烷化,GC-MS,法前处理的衍生化试剂用量、衍生化介质、衍生化时间、衍生化温度和超声波萃取时间,6,个参数进行了优化，结果表明，,5l,的,BSTFA,用量（对标样）、,30l,的,BSTFA,用量（对烟样）、二氯甲烷为衍生化介质、,60min,的衍生化时间、常温为衍生化温度和,50min,的超声萃取时间为最优条件。,采用硅烷化,GC-MS,法，以山梨酸和肉桂酸为双内标，同时定性和定量了甲酸、乙酸、丙酸、戊酸、庚酸、辛酸、十二酸、十三酸、十四酸、油酸、十八酸等,26,种挥发性、半挥发性有机酸；精密度结果显示，方法重复性的相对标准偏差在,0.81%-4.66%,之间，回收率在,80.51%-126.61%,之间，标准工作曲线相关系数全部在,0.999,以上。结果表明，该法适于同时对烤烟中挥发性、半挥发性有机酸定性和定量分析。,对,8,个烟草品种定量分析结果显示，,26,种挥发性、半挥发有机酸总量从高到低依次是,NC297,（玉溪）、云烟,85,（普洱）、云烟,87,（文山）、,K326,（大理）、红大（昆明）、中烟,100,（曲靖）、云烟,97,（红河）、云烟,99,（昭通）；挥发性有机酸除了云烟,99,（昭通）含量,161.1g,较低外，其它,7,个品种含量差异不显著；半挥发性有机酸的含量差异明显。,谢谢大家欣赏,