chap16糖类药物.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,第十六章 糖类药物,总论,多糖类药物,在,抗凝,、,降血脂,、,提高机体免疫,和,抗肿瘤,、,抗辐射,面都具有显著,药理作用,与疗效。,多糖是非细胞毒物物质，在细胞内的存在方式有,游离型与结合型,两种。,结合型多糖,有,糖蛋白、脂多糖,第一节 糖类药物制备的一般方法,一：单糖及其衍生物的制备,游离单糖,及,小分子寡糖易溶于冷水,及,温乙醇,。,可以用水或中性条件下以,50%,乙醇为提取溶剂，也可以以,82%,乙醇，在,70-80,摄氏度下回流提取。,二：多糖的分离于纯化,多糖,可来自,动物,、,植物,和,微生物。来源不同提取方法也不同。,植物体内含有,水解,多糖衍生物的,酶,，必须,抑制或破坏酶,的作用后，才能制取,天然存在形式的多糖,。,速冻冷藏,是保存提取多糖材料的有效方法。,提取方法依照不同种类的多糖的溶解性质而定。,（）多糖的提取,提取多糖时，一般先需进行,脱脂,，以便多糖释放。方法是将材料粉碎，用,甲醇,或,11,乙醇乙醚,混合液，,加热,搅拌,1,3,小时，也可用,石油醚脱脂,。动物材料可用,丙酮脱脂,、,脱水,处理。,1,、难溶于冷水、热水，可溶于稀碱液者,多糖的提取方法主要有以下几种：,这一类多糖主要是不溶性,胶类,，如,木聚精,、,半乳聚糖,等。用,冷水浸润材料后用,0.5mol,L,NaOH,提取,，提取液用盐酸中和、浓缩后，加,乙醇沉淀得多糖,。,如在稀碱中仍不易溶出者，可加入,硼砂,，对甘露聚糖、半乳聚糖等能形成,硼酸络合物,的多糖，此法可得相当纯的物质。,2,、易溶于温水、难溶于冷水和乙醇者,材料用冷水浸过，用,热水,提取，必要时可加热至,80,90,搅拌提取。,3,、粘多糖,提取液用,正丁醇与氯仿,混合液除去杂蛋白（或用,三氯乙酸,除杂蛋白），离心除去杂蛋白后的清液，,透析,后用,乙醇沉淀,得多糖。,有些粘多糖可用,水,或,盐溶液,直接提取，但因大部粘多糖与蛋白质结合于细胞中，因此需用,酶解法,或,碱解法,使糖,-,白质间的结合键断裂，促使,多糖释放,一般组织中存在,多种,粘多糖。需要对粘多糖进行,分离纯化。,（,1,）碱解法,多糖与蛋白质结合的,糖肽键,对碱不稳定，故可用碱解法使糖与蛋白质分开。,但若,硫酸基,与,邻羟基,处于,反式结构,或硫酸基在,C-3,或,C-6,，,此时易发生,脱硫作用,。这类多糖不宜用,碱解法提取,。,（,2,）酶解法,理想的,工具酶,是,专一性低,的、具有广泛水解作用的,蛋白酶,。鉴于,蛋白酶,不能断裂,糖肽键,及其,附近的肽键,，为除去长肽段，常可与,碱解法,合用。,常用的酶制剂有,胰蛋白酶,、,木瓜蛋白酶,和,链霉菌蛋白酶,及,枯草杆菌蛋白酶,。,（二）多糖的纯化,试剂和器材,一、试剂,平衡缓冲溶液：,0.01mol/L,Tris,-HCL,PH=7.2,。,洗脱液：,A:0.1mol,NaCl,0.01 mol,Tris-HCl,PH=7.2;B:0.5mol,NaCl,0.01 mol,Tris-HCl,PH=7.2,。,氯仿、正丁醇、乙醇,(95,),等，均为分析纯。,二、材料,灰树花子实体。,三、,器材,DEAE,Sepharose,Fast Flow,，,旋转真空蒸发仪，摇床，离心机，层析柱：,2610,操作方法,一、粗多糖的提取,将多糖子实体切碎烘干后称量，采用热水浸提法，每次原料和水之比均为,1,：,5,，浸提温度为,70,80,，浸提时间,3,5h,，,共提取,4,次，合并,4,次浸提液。真空旋转蒸发浓缩，浓缩一倍体积。对多糖提取液需进行脱色处理，即以,1,的比例加入活性炭，搅拌均匀,15min,后过滤即可。在浓缩液中加入,3,倍体积的乙醇搅拌，沉淀为多糖和蛋白质的混合物，此为粗多糖。它只是一种多糖的混合物，其中可能存在中性多糖、酸性多糖、单糖、低聚糖、蛋白质和无机盐，必须进一步分离纯化。,二、粗多糖的纯化,粗多糖溶液加入,Sevag,试剂,(,氯仿：正丁醇,3,：,1,混合摇匀,),后，置恒温振荡器中震荡过夜，使蛋白质充分沉淀，离心,(3000r,min),分离，去除蛋白质。然后浓缩，透析，加入,4,倍体积的乙醇沉淀多糖，将沉淀冻干。,取样品,0.1g,溶于,10ml 0.01mol/L,Tris,-HCL,PH=7.2,的平衡缓冲液中。上样，用,Buffer A:0.1mol,NaCl,0.01 mol,Tris-HCl,PH=7.2;Buffer B:0.5mol,NaCl,0.01 mol,Tris-HCl,PH=7.2,进行线性洗脱，分部收集。各管用硫酸苯酚法检测多糖。合并多糖高峰部分，浓缩后透析，冻干，即得多糖级分。,第二部分多糖的鉴定,实验原理,采用薄层层析法分析单糖组分。薄层层析显色后，比较多糖水解所得单糖斑点的颜色和,Rf,值与不同单糖标样参考斑点的颜色和,Rf,值，确定样品多糖的单糖组分。,多糖的分析鉴定一般借助于气相色谱,(GC),、,高效液相色谱,(HPLC),、,红外光谱,(IR),和紫外光谱,(UV),等技术，气相,(,液相,),色谱,质谱,(GC,HPLCMS),联用技术成为分析多糖更为有效的手段。,本实验利用红外光谱对多糖进行鉴定。多糖类物质的官能团在红外谱图上表现为相应的特征吸收峰，我们可以根据其特征吸收来鉴定糖类物质。,0H,的吸收峰在,36503590cm,1,，,CH,的,I,申缩振动的吸收峰在,29622853cm,1,，,C,O,的振动峰为,15101670,1,之间的吸收峰，,CH,的弯曲振动吸收峰为,14851445cm,1,，,毗喃环结构的,C0,的吸收峰为,1090cm,1,。,试剂和器材,一、试剂,浓硫酸，氢氧化钡。,展开剂,:,正丁醇：乙酸乙酯：异丙醇：醋酸：乙醇：水：吡啶,7,：,20,：,12,：,7,：,6,：,6,。,显色剂,:1,，,3,二羟基萘硫酸溶液（,0.2,1,，,3,二羟基萘乙醇溶液）：浓硫酸,1,：,0.04,（,V/V,）。,单糖标准品。,二、器材,沸水浴,玻璃板，傅里叶变换红外光谱。,操作方法,一、单糖组分分析,1,薄层板制备：称取硅胶,5g,于,50ml,烧杯中，加入用,12,mL,0.3mol,L,磷酸二氢钠水溶，用玻璃棒慢慢搅拌至硅胶分散均匀，铺在玻璃板上,(7,5cm10cm),，,110,活化,1h,。,即置有干燥剂的干燥箱中备用。,2,点样：称取少许的多糖,(0,1,克,),于,2,0mL,离心管中，加入,1M,的硫酸,1mL,，,沸水浴水解,2h,，,然后加氢氧化钡中和至中性，过滤除去硫酸钡沉淀，得多糖水解澄清液。以此水解液和单糖标准品进行点样进行薄层层析展开。用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边,2.0cm,，,点样直径为,24mm,，,点间距离约为,1.52.0cm,，,点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。点样时必须注意勿损伤薄层表面。,3,展开：展开室如需预先用展开剂饱和，将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边,0.51.0cm,（,切勿将样点浸入展开剂中），密封室盖，等展开至规定距离（一般为,1015cm,），,取出薄层板，晾干。,4,显色：将展开凉干后的薄板再在,100,烘箱内烘烤,30,分钟，将显色剂均匀地喷洒在薄板上，此板在,110,下烘烤,10,分钟即可显色。,薄层显色后，将样品图谱与标准样图谱进行比较，参考斑点颜色、相对位置及,Rf,值，确定样品中有哪几种糖。,试剂和器材,一、试剂,浓硫酸，氢氧化钡。,展开剂,:,正丁醇：乙酸乙酯：异丙醇：醋酸：乙醇：水：吡啶,7,：,20,：,12,：,7,：,6,：,6,。,显色剂,:1,，,3,二羟基萘硫酸溶液（,0.2,1,，,3,二羟基萘乙醇溶液）：浓硫酸,1,：,0.04,（,V/V,）。,单糖标准品。,二、器材,沸水浴,玻璃板，傅里叶变换红外光谱。,操作方法,一、单糖组分分析,1,薄层板制备：称取硅胶,5g,于,50ml,烧杯中，加入用,12,mL,0.3mol,L,磷酸二氢钠水溶，用玻璃棒慢慢搅拌至硅胶分散均匀，铺在玻璃板上,(7,5cm10cm),，,110,活化,1h,。,即置有干燥剂的干燥箱中备用。,2,点样：称取少许的多糖,(0,1,克,),于,2,0mL,离心管中，加入,1M,的硫酸,1mL,，,沸水浴水解,2h,，,然后加氢氧化钡中和至中性，过滤除去硫酸钡沉淀，得多糖水解澄清液。以此水解液和单糖标准品进行点样进行薄层层析展开。用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边,2.0cm,，,点样直径为,24mm,，,点间距离约为,1.52.0cm,，,点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。点样时必须注意勿损伤薄层表面。,3,展开：展开室如需预先用展开剂饱和，将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边,0.51.0cm,（,切勿将样点浸入展开剂中），密封室盖，等展开至规定距离（一般为,1015cm,），,取出薄层板，晾干。,4,显色：将展开凉干后的薄板再在,100,烘箱内烘烤,30,分钟，将显色剂均匀地喷洒在薄板上，此板在,110,下烘烤,10,分钟即可显色。,薄层显色后，将样品图谱与标准样图谱进行比较，参考斑点颜色、相对位置及,Rf,值，确定样品中有哪几种糖。,