植物细胞工程的理论基础.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章 植物细胞,工程的理论基础,1.,细胞分化与细胞全能性,2.,器官发生,3.,离体培养下的遗传与变异,1.,细胞全能性,一.细胞全能性的普通概念,二.细胞分化,三.离体培养中细胞的脱分化、再分化,一.细胞全能性的普通概念一种细胞所含有的产生完整生物个体的固有能力称之为细胞的全能性。细胞全能性的绝对性与相对性:不是全部基因型的全部细胞在任何条件下都含有良好的培养反映;即使对于植物细胞而言，细胞全能性也并不意味着任何细胞均能够直接产生植物个体;动、植物细胞全能性的体现程度存在明显的差别。,植物细胞全能性体现根据细胞类型不同从强到弱:,营养生长中心 形成层 薄壁细胞 厚壁细胞(木质化细胞)特化细胞(筛管、导管细胞)；,根据细胞所处的组织不同从强到弱为：,顶端分生组织 居间分生组织 侧生分生组织 薄壁组织(基本组织)厚角组织 输导组织 厚壁组织。,二,.,离体培养中细胞的脱分化（,Dedifferentiation,）,脱分化,外植体,愈伤组织或 体细胞胚完整植株 脱分化细胞不定器官,直接伸长,茎尖培养（较大时）,完整植株,发育,幼胚培养（较大时）,完整植株,外植体：植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料，能够是器官、组织、细胞和原生质体等。,脱分化后的细胞，通过细胞分裂，产生无组织构造、无明显极性的、松散的细胞团称为愈伤组织。愈伤组织的种类 1、胚性愈伤组织（Embryonenic callus）：表面光滑、组织构造紧凑、细胞小、再生力强。胚性愈伤组织容易形成胚状体，因此被称为胚性愈伤组织。2、非胚性愈伤组织：表面粗糙、组织构造疏松、细胞大。,注意：1、并不是全部的细胞脱分化的成果都必然形成愈伤组织。有些植物体的细胞脱分化后来直接形成胚性细胞，进而形成体细胞胚。2、多数愈伤组织内的细胞并不都是未分化的细胞，即同一愈伤组织内的细胞之间其状态存在一定的差别。,三,.,细胞分化,所谓细胞分化，是指在个体发育进程中,细胞发生化学构成、形态构造和功效等发生变化的现象。分化程度低的细胞其分化能力强,分化程度高的细胞其分化能力弱。,时间上的分化：一种细胞在不同的发育阶段上能够有不同的形态构造和功效；,空间上的分化：对于多细胞生物来讲，同一细胞后裔，由于所处的环境不同而能够有相异的形态构造和功效。,1细胞分化与基因组变化,细胞分化过程中，能够观察到的最常见的变化是染色体的重复复制，而并不进行细胞分裂。核内染色体的复制过程能够分辨出两种重要类型，一是核内有丝分裂，造成核内多倍体，二是大量复制染色丝，造成形成多线染色体。,在植物的分化发育中，另一类基因组的变化是基因重排。例如，在玉米、金鱼草等植物中，转座子的移动能引发诸多发育性状的变化。,2.,细胞分化与极性建立,极性是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态构造以及生理生化上的梯度差别。,在诸多状况下，细胞的不均等分裂是是细胞极性建立的标志。,无论是在活体还是在离体条件下，普通认为，极性的建立和维管成分的产生，是植物细胞分化的基本特性。,3.,细胞分化的过程,细胞分化可分为两个阶段：,决定：是指胚胎细胞在发育过程中发生的不可逆的特化现象。因此，决定就是细胞发育途径的拟定，它是细胞分化的早期过程；,分化细胞特性逐步体现：在大多数状况下，细胞从决定到体现特定细胞特性普通需要通过几代细胞的传递（细胞分裂）。,4.,影响细胞分化的因素,a,激素,b,蔗糖浓度,c,光照与温度,a.激素,生长素能增进维管组织形成,细胞分裂素与木质部的发生有关,激素在细胞分化中的作用，可能是通过在转录或翻译水平上的调节作用而影响有关基因的体现从而调控细胞分化。,b,、蔗糖浓度,C,、光照与温度,光照对于维管组织的分化含有增进作用，适宜的温度对于维管组织的分化是必需的。,2.,器官发生,一离体培养中器官发生的方式,二,.,器官分化的过程,三,.,影响器官分化的因素,植物的离体器官的发生：培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根（,adventitious roots,）、不定芽（,adventitious shoots,）等器官的过程。,不定根：,从茎、叶上生出的根叫做不定根,不定芽,：不是从叶腋或枝顶发出，而是从叶子、根上或从树干上发出的芽,一,.,离体培养中器官发生的方式,通过器官发生形成再生植株大致上有三种方式：,第一种方式是先芽后根；如小麦，芦荟、苹果,第二种方式为先根后芽；如枸杞、苜蓿等,第三种方式是在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。如胡萝卜、石刁柏,石刁柏,二.器官分化的过程离体条件下，通过愈伤组织再分化器官普通要通过三个生长阶段：1.外植体通过诱导形成愈伤组织。2.生长中心的形成。3.器官原基及器官形成。,生长中心（拟分生组织）,器官原基,芽形成,在有些状况下，外植体不通过典型的愈伤组织即可形成器官原基，这一途径有两种状况，一是外植体中已存在器官原基，进一步培养即形成对应组织器官进而再生植株，另一种状况是外植体形成分生细胞团后在分生细胞团上直接形成器官原基。,普通认为，芽和茎原基普通来源于培养组织中比较表层的细胞，即外来源，而根原基则发生在组织较深处，是内来源。,三,.,影响器官分化的因素,1.,外植体,-,位置、状态及组织类型（芦荟、小麦）,外植体的状态和组织类型影响诱导和分化的难易；,外植体的部位直接影响器官分化的类型。,例如：芦荟,含有变态器官（如鳞茎、球茎、块茎等）的植物，在培养中往往也容易形成对应的变态器官，如百合、水仙等鳞茎类植物培养中往往易形成小鳞茎；草石蚕、马铃薯等块茎植物培养中则可观察到块茎的形成。这一特性也使以变态器官为繁殖体的植物实现实验室工厂化生产种子提供了可能。,草石蚕 水仙,百合,2.,生长调节剂,生长调节剂在细胞生长与个体发育中含有重要的调控作用。离体培养下的器官分化在大多数状况下是通过外源提供适宜的植物生长调节剂来实现的。种类、浓度和不同类型生长调节剂的比例是影响根芽等分化的核心。,3.,光照,光照有助于维管组织和叶绿体形成进而分化成芽。,愈伤组织的诱导培养普通是在黑暗或弱光照条件下进行的，细胞中完全没有维管成分，当转入强光照条件下后来，才干逐步变绿并形成维管组织。,分化培养的早期持续光照能增进愈伤组织变绿，随即的昼夜交替则有助于细胞极性的建立，从而增进器官分化。有些植物，只有在一定的光周期条件下才干分化芽，例如天竺葵的愈伤组织进入器官分化培养，普通要在16h/d光照和8h/d黑暗条件下才干分化芽。,天竺葵,4.,温度,愈伤组织诱导培养时，温度能够适宜提高，而分化温度比诱导温度要低。,例如烟草，愈伤组织生长时33仍可良好生长，而分化则必需在18条件下才适宜。,与光周期相似，某些需要通过低温春化的植物，在离体培养中器官形成有时也需要低温解决，特别是对于某些特殊目的的培养，例如菊苣根培养产生的愈伤组织，诱导分化时经低温解决可形成花芽，而在25下培养只能形成营养芽。,菊苣根,3.,离体培养下的遗传与变异,一、培养细胞变异的类型,二、变异因素,三.影响离体培养细胞遗传变异的因子,四.体细胞无性系变异的诱导,五、优良变异的筛选办法,六.体细胞无性系变异的运用,七、变异的克制,一、培养细胞变异的类型,变异，由于离体培养条件下并没有发生雌雄配子的重组和交换，因此，这些变异的发生能够说均属于突变的范畴，由于它们没有发生有性过程，因此，我们把在组织培养条件下所体现的遗传与变异特性称之为体细胞遗传与变异，由此发展起来的一种新的遗传学分枝称为体细胞遗传学。,离体培养中，组织、细胞、原生质体培养再生植株中，会有多个各样的变异。例如，叶色、花色的变异，株高、果实大小的变异，染色体构造和数目的,培养细胞变异的类型：自发产生的变异。培养物在未加诱变因素的状况下产生变异。诱发产生的变异。培养物在诱变因素作用下产生变异。前者变异率普通在10-710-6之间，后者普通在10-510-4。,1,、自发产生的变异,A.,染色体多倍性和非整倍性,B.,畸形变异,最常见的变异是白化苗突变，另首先是产生丛生芽、肉质茎芽等。,安祖花,C.,非遗传变异,a、外遗传变异（epigenetic variation),在植物愈伤组织培养过程中，经常出现一种不涉及基因构造的变化，而只是在基因体现水平上的变异，如最常见的生长素自养型变异。这种变异不能通过有性世代传递给后裔植株，但在离体条件下却能够通过培养继代，长久保存。（马铃薯）,b、生理适应（physiologic adaptation）变异 普通是在某种外界条件存在时才体现出变 异，外界条件不存在时，变异也随之消失。,2、诱发产生的变异抗镰刀菌毒素细胞变异系的分离将诱导产生的愈伤组织接种在含不同浓度梯度毒素的培养基上筛选得到半致死剂量浓度、100%生长克制生长浓度、致死计量浓度以半致死剂量为最低浓度，逐代增加毒素浓度至致死剂量浓度 转移至无毒素培养基继代培养两代转移到致死剂量和高于致死剂量的培养基培养，统计存活率,二、变异因素：1、植物本身的异质性无性繁殖植物的体细胞中，存在广泛的异质性（如体细胞突变等因素造成），在整体中被掩盖，无法体现出来。在离体培养中，原来含有不同类型的细胞被诱导分裂，由这些变异的细胞再生的植株为变异植株，通过一定的选择，选育新品种。,2、培养条件引发的变异变异因素可能与以下因素有关：1）培养基中添加的激素2）形成愈伤组织过程中，细胞分裂异常3）环境条件的变化（温度、光照时间及强度与原来生长环境不同）,三.影响离体培养细胞遗传变异的因子1、供体植株方面 倍性水平、基因型、外植体细胞的分化程度2、培养基及培养方式 培养基的成分、物理状态及培养类型原生质体培养的体细胞变异不不大于细胞培养的变异，而细胞培养的变异又不不大于组织器官培养的变异3、继代培养的次数普通来讲，继代时间越长、继代次数越多，细胞变异的几率就越大。,四.体细胞无性系变异的诱导自发变异往往频率较低，为了增加变异频率，在培养基中添加化学诱变剂或使用物理办法解决，这样，细胞群体中就会产生多个各样的变异。,诱变剂类型：诱变剂涉及物理的和化学的两大类。物理诱变剂：X射线、射线、中子、粒子、粒子和紫外线等。化学诱变剂：烷化剂、碱基类似物、移码诱变剂和某些抗生素类等。,五、优良变异的筛选办法1、离体条件下体细胞无性系变异的筛选的优点：（1）能够在小空间内对大量个体进行选择（2）不受季节限制，筛选效率高（3）诱变和筛选条件能够根据需要进行调节和控 制，提高了实验的重复性。（4）理化诱变剂可较均匀接触细胞，因此能够引 起培养细胞较高频率发生突变，增加了选择 机会（5）变异是在单细胞水平上进行的，因此一种突变 体来自一种细胞，避免了整株水平上常呈 现出的嵌合体，因而能够省去变异分离的麻烦,2、体细胞变异材料的选择选择起始材料需根据实验目的拟定，普通应考虑（1）目的性状的可行性。体细胞突变的频率即使较高，但对于某一种体来讲，变异的性状是个别的，因此选择综合性状良好的植物品种材料，通过诱变变化个别不良性状，是体细胞突变系选择的目的。（2）必须充足考虑实验植物的细胞培养技术水平，只有对起始材料有良好的培养技术，才有可能制订完满的诱变及选择方案。如果起始细胞的培养技术不成熟，不能再生植株，则不能进行后继的各项操作。,（3）适宜的细胞类型也是提高体细胞突变系筛选效率的重要条件。即使多个状态下的培养细胞均能够作为分离突变细胞的来源，但实践中原生质体和悬浮细胞系被优先考虑。,3、筛选办法（1）直接筛选法 在设计的选择条件下，能使培养细胞或再生个体获得直接感官上的差别，因此能将突变个体和非突变个体分离。最直接的做法是用一种含有特定物质的选择培养基，在此培养基上只有突变细胞能够生长，而非突变细胞不能生长，从而直接筛选出突变体，如抗除草剂、抗盐突变体的筛选，均可直接在培养基中加入一定浓度的除草剂或增加渗入压的物质。另外也能够在再生植株水平上进行筛选。,培养及筛选过程（在细胞水平上）：组织、器官、愈伤组织、原生质体等 诱发变异解决、筛选压 耐性愈伤组织 再生植株 鉴定 耐性植株,培养及筛选过程（在再生植株水平上）：组织、器官、愈伤组织、原生质体等 诱发变异解决 愈伤组织 再生植株 筛选压 耐性植株,2、间接筛选法 间接选择法是一种借助于与突变体现型有关的性状作为选择指标的筛选办法。当缺少直接选择表型指标或直接选择条件对细胞生长不利时，可考虑采用间接筛选法。抗病突变体的筛选也常惯用间接筛选的方略。由于在离体培养中直接接种病原物会严重妨碍细胞生长，因此能够在培养基中加入一定剂量的病原物类毒素来增加选择压力。,体细胞无性系变异的表达办法重要有两种：（1）、Chaleff提出的以R0、R1、R2、.分别代表体细胞无性系变异的当代和自交后来的世代（2）Larkin和Scowcroft提出的SC1、RC2、RC3.分别代表当代和自交后来的世代,六、体细胞无性系变异的运用 1发明育种中间材料或直接筛选新品种 据统计，诱导突变已被用来改良诸如小麦、水稻、大麦、棉花、花生和菜豆这些种子繁殖的重要作物。在全世界50多个国家中，已哺育出1000多个由直接突变获得的或由这些突变体杂交而衍生的品种。这些品种的重要特性涉及品质改良、增强抗病性和抗逆性等,2遗传研究突变体作为基因克隆和标记筛选含有独特的优点。由于突变一旦发生，即可在体现型上与供体明显不同，通过差别显示或分子杂交筛选，即可快速获得突变位点的DNA序列，通过测序与功效鉴定，就可能获得与突变性状有关的基因。即使通过分析不能获得功效基因，这些DNA序列也可作为与突变性状有关的分子标记，用于有关遗传研究。突变体用于基因克隆和功效鉴定早已成为模式植物如拟南芥等的常规办法，近年来也已开始广泛用于其它作物中。特别是与转座子标签插入突变技术相结合，更显现出这一途径的高效性。现在，运用突变体方略已分离出某些功效基因和抗病基因，如玉米乙醇脱氢酶基因ADH，赤霉素合成有关基因GA1、GA4，生长素敏感性基因AUX1、AUX2、番茄抗病基因Df9等。,3发育生物学研究植物的个体发育是一种渐进过程，每一种器官和组织的分化都是一种复杂的调控过程。运用体细胞突变方略对植物发育的基因调控研究获得了突破性进展。特别是运用拟南芥和金鱼草等模式植物，已分离出一大批不同发育阶段和组织类型的突变体，涉及顶端分生组织、根、开花转变、花序、花分生组织、胚胎发育等的一系列突变体。通过对这些突变体的研究，不仅建立了器官发育模式，并且分离鉴定了一大批与发育有关的基因，涉及维持正常发育状态的基因、增进发育进程的基因，以及有关修饰基因,4生化代谢途径研究 生物的多个代谢活动涉及到一系列酶有关基因的体现。如果某一代谢过程的核心酶基因突变，则会影响到下游代谢链的正常进行。因此，突变体作为代谢活动调控研究的工具，含有十分便利和高效的优势。,七、变异的克制在脱毒苗生产、快速繁殖等工作中，变异往往会影响产品的产量和质量。因此，应采用一定的办法避免变异。,克制变异可从下列几点考虑：1、运用比较稳定的品种材料。2、运用茎尖、幼胚等再生能力较强 的组织进行培养。3、避开使用高浓度激素。4、不通过愈伤组织，而直接从脱分 化细胞再生。5、尽量促使植株早再生，使培养时 间缩短。,