第5章微生物的生长繁殖与生存因子.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五章,微生物的生长繁殖与生存因子,第一节 微生物的生长繁殖,一、微生物的生长繁殖的基本概念,1.生长：微生物新陈代谢，同化作用大于异化作用，微生物的细胞不断迅速,增长,的现象。,2.繁殖：,什么是微生物的繁殖？,繁殖,单细胞,一个细胞,两个细胞,多细胞,不只是细胞个数的增长，如果只是细胞个数增长，而不是个体数目增长，不叫繁殖，叫生长。,不但细胞个数增加，个体也增加，则为繁殖,3.发育：微生物的生长与繁殖是个交替过程，,从生长到繁殖的量变到质变的过程是,发育。,4.世代时间：细菌两次分裂之间的时间。,当微生物的培养时间一定时，它的世代时间基本上也是稳定的。但是如果外界条件发生变化，世代时间也会变化。,世代时间越短，繁殖速度越快。一般，原核微生物的繁殖速度大于真核微生物。好氧微生物快于厌氧微生物。,二、研究微生物生长的方法,生长,单个体微生物生长,群体微生物生长,分批培养,连续培养,（一）分批培养,将少量单细胞微生物接种于一定量的液体培养基内，在适宜的条件下培养,并定时取样测定活微生物数目的变化，叫做,间歇培养（分批培养）。,少,多,少,1、停滞期,当细菌被接种到新鲜培养基中，开始一段时间内，通常不立即进行细胞分裂、增殖，生长速率近于零，细胞数目几乎保持不变，甚至稍有减少，这段时间被称为停滞期。,特征,停滞期是细胞分裂启动之前的恢复或调整期。而不是生长的休眠或停留期。停滞期细胞的主要特征是代谢活跃，体积增大，从介质中快速吸收各种营养物质，大量合成细胞分裂所需的酶类、ATP和其他细胞成分，为细胞分裂作准备。,细,菌,数,目,的,对,数,值,时间,t,提问：为什么会出现停滞期呢？,表面特征：,不立即进行细胞分裂、增殖，,数量不变甚至减少,适应环境（合成相应的酶），营养储备（用于复制合成）,停滞期,停滞期“万事开头难”,影响停滞期长短的因素,1、接种时的种龄:,1),对数期“种子”，停滞期较短,；,处于生长对数期的培养物被接种到与原先同样的生长条件和同样培养基中后，几乎能够以同样速率进行对数生长，停滞期不明显；,2),静止期期或衰亡期“种子”,停滞期较长,；,这是因为稳定期细胞生理上已经衰老，其合成机制处于损伤状态，基本耗尽了各种辅酶或其他细胞成分，因而需要一定时间进行生理修复和物质的再合成。,3）,接种受损细胞,如果接种菌是因热、辐射或有毒化学物质处理而受到损伤的细菌，停滞期也会发生，因为细胞需要时间修复这种损伤。,4）,接种富集培养基的细菌,当细菌被从营养丰富的培养基转移到营养贫乏培养基后，为了合成新培养基中所缺乏的某种营养物质以满足自身生长，结果也导致停滞期的出现。,2、接种量。,1)接种量大，停滞期较短；,2)接种量小，停滞期较长。,3、培养基成分:,1)培养基成分丰富的，停滞期较短；,2)培养基成分与种子培养基一致,停滞期较短。,应用,在实际工作中如接种菌种以启动新的水处理设施，投加新鲜污泥时，接种的细菌不习惯于新环境，会出现或长或短的停滞期，停滞期的出现会增加操作时间，降低工作效率，此时我们可以通过增加接种量、采用最适种龄(处于对数期的菌种)、选用繁殖速率快的菌种以及尽量保持接种前后所处的培养介质和条件一致等方法来缩短或消除停滞期。,特点,生长速率最快，细胞呈对数增长,生长速率恒定,代谢旺盛，细胞成分平衡发展,群体的生理特性较一致,2、对数期,对数期的细胞分裂速度最快、繁殖一代的时间最短、代谢活动旺盛、对环境变化敏感，并且细胞内的核糖体等组分也像细胞数目一样以同样的对数生长速率增加，细胞合成核糖体以及蛋白质越多，其生长速率也越快。不同细菌对数期的生长速率却变化很大，这与菌种本身的遗传特性有关，同时受环境条件(如温度、培养基成分等)的影响。,细菌代时的计算,细菌的代时即,世代时间,，或称倍增时间是指细菌繁殖一代即个体数目增加一倍的时间。细菌在不同的生长期，不同培养温度、pH、营养物浓度和性质的情况下，倍增时间不一样，对数期的细菌细胞代谢活性最强，组成新细胞物质最快，细菌数目呈几何级数增加，代时稳定，因此细菌代时的测定必须以对数期的生长细胞作为对象。其测定计算如下：,指数生长公式：,X,t,=X,0,2,n,式中X,0,为起始细胞数目，X,t,为指数生长某个时刻t时的细胞数目，n为世代数。X,0、,X,t,和t可由实验获得，n可通过上式计算得出。,LgX,t,=lgX,0,+nlg2,在对数期分别测定t,0,时刻与t时间细菌的数量X,0,与X，基于细菌的二分裂生长,t,0,t,122,2,2,3,（2,2,）2）2,4,2,5,2,n,X,0,X,0,2,4,X,0,2,n,(n=1、2、3)X,t,0,0,lg,3,.,3,2,lg,/,lg,X,X,t,X,X,t,n,=,=,n,t,t,G,0,-,=,世代时间,影响对数期的因素,菌种,：不同菌种的代时差异极大,营养成分,：营养越丰富，代时越短,营养物浓度,：影响微生物的生长速率和总生长量,培养温度,：影响微生物的生长速率,3、静止期,静止期细胞的特征是从生理上的年轻转化为衰老，表现为细菌的代谢活力钝化，细胞含有较少的核糖体，RNA和蛋白质合成缓慢，mRNA的水平低下，因此细胞的生长变得不平衡，细胞的形状有的也发生改变。因不能维持细胞壁的合成与修复，细胞的染色特点也发生变化，如G+转变为G-。,但此时细胞的很多功能，如能量代谢和某些生物合成过程还在继续进行，生物化工中作为产品的某些细菌代谢产物如抗生素和某些酶就是在稳定期，特别是在对数期与稳定期转换阶段所产生的。某些细菌的芽孢产生也发生在稳定期。,特点：,活细胞总数维持不变，即新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，菌体总数达到最高点，,细胞生长速率为零。,细胞生理上处于衰老，代谢活力钝化，细胞成分合成缓慢。,营养物质被消耗不能满足生长需要,代谢废物或有害物质积累到抑制生长水平,pH,、氧化还原势等物化条件越来越不适应,新生率等于死亡率,4、衰亡期,如果处于静止期的细菌继续培养，细胞的死亡率将逐渐增加，最终群体中活的细胞数目将以对数速率急剧下降，此阶段就被称为衰亡期，,内源呼吸期,。,衰亡期细胞的总数虽然镜检直接计数可能会保持不变，但间接菌落计数检测到的活细胞数目却在减少，同时伴随着细胞的裂解或自溶可释放出一些代谢产物，如氨基酸、转化酶、外肤酶或抗生素等。个体细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有的细胞内含很多的空泡，G,+,染色反应转变成G,-,染色反应。,特点：,细胞以指数速率死亡。,细胞变形退化。,影响衰亡期的因素,与菌种的遗传特性有关,:,有些细菌的培养经历所有的各个生长时期，几天以后死亡,有些细菌培养几个月乃至几年以后仍然有一些活的细胞；,与营养物质和有毒物质有关：补充营养和能源，以及中和环境毒性，可以减缓死亡期细胞的死亡速率，延长细菌培养物的存活时间。,一方面连续进料，另一方面又连续出料。,它又分为两种：,1)恒浊连续培养,是一种使培养液中细菌的浓度恒定，以浊度为控制指标的培养方式。培养基提供足够量的营养元素，细菌保持最大速率生长。通过控制进料流速使装置内细菌浊度保持一定，保持理论上的对数生长期，可获得大量菌体或与菌体代谢相平衡的代谢产物。这种方式往往用于细菌的生理生化研究。,恒浊,培养基浊度恒定（实质是细菌数量恒定）,以浊度为控制指标。,当浊度大时，加大进液流速，降低浊度；,当浊度小时，降低流速，提高浊度。,（二）连续培养,2）恒化连续培养,这种方式新鲜培养基以恒定的流速流入，培养器内的培养基继而也以相同的流速恒定流出，进水组分及反应器中营养物浓度基本不变，因而这种细菌培养称为恒化连续培养。除了分批式间歇曝气器,(SBR),法外，其余的污水生物处理法均采用的是恒化连续培养。,恒化,进料营养物总量恒定,恒定的流速进水，恒定流速出水,尤其适合污水生物处理,恒化培养器,恒浊培养器,新鲜培养基,新鲜培养基,光电池,光源,流速控制阀,流速控制阀,流出物,目前,污水连续生物处理法均类似于,恒化连续培养,；（流速不完全恒定）,三、生长曲线在污水处理中的应用,不同的活性污泥处理法中，活性污泥中细菌的生长状态不同，或处于静止期，或处于对数生长期，或处于衰亡期，等等。,在废水生物处理设计时，按废水的水质情况(主要是有机物浓度)，可利用不同生长阶段的微生物处理废水。,生物处理中的细菌状态表,细菌的生,长阶段,应用举例,原因,停滞,期,无,连续化操作中没有这一阶段,对数生长期,高负荷活性污泥法,生长繁殖快，代谢活力强，能大量,去除废水中有机物。（缺点是细菌,表面的粘液层和英膜尚未形成，运,动很活跃，不易自行凝聚成菌胶团，,沉淀性能差，致使出水水质有机物,浓度相对较高）,静止期,接触氧化法,常规活性污泥法,虽然比对数生长期的差，但仍有相,当的代谢活力，细菌体内积累了大,量贮存物，如异染粒、聚,羟基,丁酸、粘液层和荚膜等，强化了细,菌的生物吸附能力，自我,絮凝、聚,合能力强，在二沉池中泥水分离效,果好，出水水质好。,衰亡期,延时曝气法(氧化沟),营养物浓度过低，难以满足其他阶,段细菌的生长需要,进水,对数期,衰老期,平推流式活性污泥法,静止期,占优势,之所以利用的是细菌特定的生长阶段，是由于水处理大多为连续化操作，细菌处于一个相对稳定的环境中，细菌必然维持在一个与环境相适应的生长阶段。只有当环境发生变化时，细菌的生长状态才会发生变化。,为什么常规活性污泥法不利用对数期而用静止期微生物？,对数期微生物,：,生长繁殖快，代谢活力强，能大量去除废水中的有机物，相应的，要求进水有机物浓度高。,由于进水有机物浓度高，出水有机物浓度也相应提高，且这时期微生物不易自行凝聚成菌胶团，沉淀性能差，导致出水水质差。,静止期微生物：,代谢活力比对数期差，但仍有相当的代谢活力，且生物吸附能力强，泥水分离效果好，出水水质好。,什么时期菌体代谢产物最多,什么时期细菌细胞代谢活性最强,什么时候细菌细胞总数最多,什么时期细菌细胞生长速度最快,什么时期世代时间短而稳定,对数生长期,静止期,对数生长期,对数生长期,小 结,静止期,第二节 微生物的生存因子,微生物正常生存，需要营养，除此以外，还需要合适的温度、pH、氧气等环境条件。,一、温度,（一）微生物对温度的适应范围,温度是微生物最重要的生存条件之一。,影响的机理是：对酶活性的影响,。,当处于最佳范围时，每上升10，酶促反应速度提高12倍。代谢速率和生长速率也提高，繁殖能力最强，微生物进行大量繁殖。,不同微生物对温度的要求不同。可将微生物分为嗜冷菌、嗜中温菌、嗜热菌、嗜超热菌。,细菌,最低温度,最适温度,最高温度,嗜冷菌,50,510,2030,嗜中温菌,510,2540,4550,嗜热菌,30,5060,7080,嗜超热菌,55以上,70105,110113,低温、中温和高温细菌的生长温度范围,几种微生物的生长最高温度,微生物,原生动物,真核藻类,真菌,蓝细菌,细菌,古菌,温度,4550,56,60,7073,90,113,嗜热菌,最适50-60,在堆肥、温泉中存在。,美国报道：在地中海发现一属,嗜超热菌,，叫火球菌属，最适生长温度高达105。,嗜中温微生物,自然界中绝大多数微生物中，多部分是嗜中温菌，其他较少。,污水处理系统中，为了保证微生物能够处于较好的工作状态，需要为其提供较适合的温度。一般控制在2030左右。,北方冬天，需要进行保温或加热处理。,嗜冷菌,最适生长温度5-15，,甚至很多细菌可以在0以下正常生存。,如荧光极毛杆菌可在-4度生长.,耶尔辛氏菌在,0-4,环境中生长，广泛存在于各种动物体内，以及蔬菜、水果等食品上，是,冰箱中冷藏的蔬菜、水果发霉变质腐烂的原因,。,熟食品存放在冰箱中不能超过,3,天；如小孩吃吞感染食品后，则肠胃不舒服，胀鼓，无胃口。,(二),温度对微生物生长影响,1,.升高温度，细胞中生化反应速率加快,：每升高10,，生化反应速度增加一倍。,微生物的培养应该在最佳温度范围进行。,2.,温度过高，细胞蛋白质、核酸可遭破坏,。,超过细菌最高耐受温度会对细菌造成伤害甚至导致死亡。,3.,降温可延缓微生物的生命活动,。,低温有抑制细菌作用，可以让微生物休眠，但不会导致死亡，温度升高时，活性即可恢复。,二、pH,影响微生物生长的一个重要因素,1,.,引起细胞膜电荷的变化，,从而影响了微生物对营养物质的吸收。,2,.,影响代谢过程中酶,的活性。,3,.,改变生长环境中营养物质,的可给性,以及有害物质毒性。,每一种微生物都有其最适pH和一定pH范围，在最适pH内酶活性最高。,霉菌，酵母菌生长适宜范围中性偏酸；,放线菌，细菌生长适宜中性或中性偏碱。,含酸多的食品能抑制微生物生长繁殖,杀菌时间可适当缩短。,在食品工业中，常用酸来作食品防腐剂。,不同微生物的对pH,忍受能力有很大差异,有些专性嗜酸微生物能在,pH15,环境中生长，在中性环境下，其细胞膜会分解而死亡，此类菌叫专性嗜酸菌；,1.污水处理生物处理构筑物内pH控制在6.58.5之间。,2.微生物培养基中应该加入缓冲物质。,3.污泥厌氧处理时，也要控制好pH，一般在6.67.6，最好控制在6.87.2之间。,小结,三、氧化还原电位（,ORP,),提问：,什么是氧化还原电位？,某物质与氢电极构成原电池时的电压高低,是物质氧化性强弱的标志。,提问：,pH7.0,30条件下饱和Fe,3+,溶液中测得的电压值为0.771,该值代表,Fe,3+,/Fe,2+,的氧化还原电位为+0.771,通常如何测定水样的氧化还原电位？,pH测定仪,mv,档，其中一个惰性的铂丝电极与一个参比电极（如甘汞电极）,影响水样氧化还原电位的因素,氧化性物质,（主要是氧气浓度）,与还原性物质,（有机物、H,2,S等）,的含量,不同微生物要求的氧化还原电位不同：,1.一般好氧微生物：+300+400 mV,，大于+100 mV，才能生活。,2.兼性菌：+100 mV为界，大于时进行好氧呼吸，小于时进行无氧呼吸。,3.厌氧菌：200250,mV。,好氧活性污泥法,控制在,200600mV,是正常的,过低过高如何调节？,改变曝气力度,厌氧污泥消化系统,氧化还原电位应控制在在,100200mV,过高，将不利于厌氧细菌的生长，应改进工艺降低水中溶解氧量。,应用,氧化还原电位的影响因素,受氧分压的影响：氧分压高，氧化还原电位高；氧分 压低，氧化还原电位低。,在培养微生物过程中，由于微生物生长繁殖消耗了大量氧气，分解有机物产生氢气，使氧化还原电位降低，在微生物对数生长期中下降到最低点。,受环境中pH的影响：pH低时，氧化还原电位低，,pH高时，氧化还原电位高。,四、溶解氧,微生物与O,2,的关系,好氧微生物,厌氧微生物,兼性微生物,专性好氧微生物,微量好氧微生物,专性厌氧微生物,耐氧厌氧微生物,（一）好氧微生物,必须有氧才能生存，氧气对于好氧微生物的作用：,1.最终电子受体；2.参与物质合成,好氧微生物做好氧呼吸时，会产生毒害物质如：过氧化氢、过氧化物和羟自由基等。但由于,好氧微生物体内也有相应的酶可以分解上述物质，因此，好氧微生物可以在氧气条件下正常生存。,好氧微生物所需要的氧气是溶解在水中的氧气，即DO。,溶解氧与大气压力及温度有关，温度越高，溶解氧越低。,好氧生物处理系统中，为了保证微生物的正常工作，必须为它们提供足够的溶解氧。,工程上，通常采用鼓风曝气的形式向水中强制充氧，,对于生活污水厂，BOD,5,200300mg/L。如果曝气池的活性污泥浓度在20003000mg/L时，溶解氧必须保证在2mg/L以上。通常控制在34mg/L。,当供氧不足时，也会造成污泥的丝状菌膨胀。,（二）厌氧微生物,可分为两种，一种有氧就要死亡；另一种，有氧无氧无所谓，生活过程中，不会中毒也不利用氧。,通常说的厌氧菌多指第一种，称为专项厌氧菌。它在有氧条件下，代谢过程中会产生过氧化氢，但体内不具有过氧化氢酶，专性厌氧微生物将被过氧化氢杀死。,厌氧微生物在培养时，培养基必须保证无氧。,方法：惰性气体驱氧：氮气或氦气。,用胶塞密封培养装置，并在容器中加入氧化还原性颜料（甲基蓝或刃天青），当在还原态时无色，氧化态时显色。一旦显色，说明有氧存在。,可在培养装置中预先加入些兼性微生物混合培养，一旦有氧，可被兼性细菌消耗掉。,（三）兼性菌,有氧无氧都能生存。,兼性菌的作用：,1.积极作用：,a.污水处理,溶解氧充足时，好氧菌与兼性菌都起作用，当供氧故障时，兼性菌仍可起作用，但不如有足够溶解氧时处理效果好。,b.水解酸化,c.脱氮。,2.消极作用,a.土壤脱氮，N素损失，土壤肥力下降。,b.产生亚硝酸胺,污水必须脱氮。,类型,与O,2,关系,代谢类型,专性好氧,必须有氧,好氧呼吸,微好氧,有氧，含量低,好氧呼吸,兼性,可有、可无,有氧呼吸或发酵,专性厌氧,氧有毒害或致死,无氧呼吸,耐氧,可在有氧下存活，不用氧气,发酵,氧气与微生物的关系,五.水活度,水分对微生物很重要，但是，水对微生物的影响，不但取决于环境中水的含量，更取决于水的有效性。,环境中水的有效性用水的活度,w,表示。,w,指在一定温度和压力下，溶质蒸气压与纯水蒸气压之比。,环境中的,w,介于01之间，溶液浓度越大，,w,越小。,微生物一般在w为0.650.99的条件下生长,w过低时,大多数微生物将停止生长。,不同微生物的,w,也不同。,10%,NaCl NaCl,半透性,水分子自由通过，其余分子扩散速度受限,六渗透压,是不同溶液被半透膜隔离开时，由于,膜半透性及两侧水分子浓度差异形成的水压,。,有半透膜,左水分子净通量0,右侧液位，直至平衡,没有半透膜,液位不变,，,盐扩散,V,水扩散,V,起始状态,最终平衡状态,浓差势能渗透压势能,0.1%,10%,渗透压,衡量方法,：通常以一定浓度溶液与纯水间形成的渗透压作为该溶液的渗透压,提问：水将从,渗透压一方流向,渗透压的一方？,低、高,渗透压,可影响细菌生存：,1.相同渗透压溶液中,细菌细胞内水含量稳定，,细菌生活得最好。,等渗透压溶液0.9的食盐(NaCl)溶液（生理盐水）。,常作为进行细菌稀释分离的稀释液。,2.高渗透压溶液中,提问：哪些是高渗透压溶液？细菌会发生什么现象？,浓溶液；质壁分离,防腐（细菌滋生）,如用,530%的盐水,腌咸菜、咸鱼，用,6080%的糖溶液,做蜜饯等。,海洋对各种病原菌（淡水菌）的杀灭,高含盐废水（如油田采出水）难于生物处理的原因,提问：如何解决？,冲稀；细菌基因改造；,3.低渗透压溶液,提问：,细菌于其中会如何？如纯水,外界大量水流入细菌细胞内，,细胞膨胀，甚至破裂。,综合以上几点，,在微生物实验室中稀释菌液，应该用生理盐水（0.9%）,(除非稀释后马上就用的可以用无菌的自来水或蒸馏水稀释。),工业废水生物处理时一般不考虑渗透压问题，是否需要考虑有待态实践中解决,。,第三节 不利因子对于微生物的影响,辐射、声波、极端温度、极端pH、重金属离子等,一、辐射,1.UV（紫外线）,日光中波长在200390nm的部分。具有杀菌功能。,一般以,250-280nm,杀菌力最强。,UV杀菌原理,：,引起核酸形成胸腺嘧啶二聚体，从而干扰了核酸的复制;,微生物细胞在UV下，生成H,2,O,2,，能发生很强的氧化作用。,经UV照射的微生物，在可见光下，可以激活DNA修复酶，能修复UV辐射引起的损伤,光复活作用。,在UV处理时，只有当UV引起的损伤比修复力大时，才能使微生物死亡。,UV缺点，穿透力弱，一层薄纸也可滤掉大部分，只适应于空气的表面消毒。,人们制造的紫外杀菌灯的波长为253.7nm。由于穿透力差，只能进行：,a.空气消毒,b.表面消毒：,c.诱变育种：,2.电离辐射,射线,射线等高能电磁波,具有较强穿透力。,这些射线照射物质后,使该物质产生电离作用,所以叫做电离辐射.,用辐射保存,粮食、蔬菜、畜禽产品及饮料,又能保持食物的营养和风味.,电离辐射:,低剂量(500伦琴)照射可以促进微生物生长，用10万伦琴以上高剂量处理有杀菌作用.,二、超声波与微波,1.超声波,2-20千赫/Sec的声波叫超声波,超声波(2000赫兹以上)使,微生物,细胞破裂,其效果与频率、处理时间,微生物种类,细胞大小,形状及数量等均有关系。,超声波频率越高，杀菌效果越好。杆菌比球菌易被杀死。大的细菌比小的细菌易被杀死。,几乎所有的微生物都受超声波的破坏,大多数情况下，芽孢不受影响,。,作用机理,a.超声波作用下，内含物剧烈振荡，失去活性；,b.溶液受超声波作用产生空腔，巨大压力导致细菌死亡,c.溶液产生大量微小气泡，对微生物进行猛烈冲击，细菌破裂。,2.微波,三、极端温度,常用高温消毒或灭绝。二者概念不同。,消毒：杀死所有营养细胞和一些芽孢。,灭菌：利用高温、物理、化学方法将所有微生物营养细胞和所有芽孢或孢子全部杀死。,（一）,高温,温度,影响,消毒,巴斯德消毒法,煮沸消毒法,灭菌,灼烧,烘箱热空气法,（160170）,干热灭菌法,湿热灭菌法,高压蒸汽灭菌（0.105MPa，121）,牛奶、饮品,常压蒸汽灭菌,（100）,1.高温灭菌法,超过微生物最高生长温度可将微生物杀死，可用来灭菌.,高温灭菌原因,：细胞蛋白质凝固。,A火焰灭菌（灼烧灭菌）：将工具在酒精火焰上灭菌；,B干热灭菌：在干燥箱中利用热空气来灭菌；,干热灭菌使用温度：160-180,，常用170,，含水物品不能利用此法。,2.湿热灭菌,湿热灭菌使用温度:100-130,常用121，含水物品常利用此法。,在同样温度下湿热灭菌效果要比干热灭菌效率高，其原因是,:,1.菌体蛋白质吸收热水分凝固比干热凝固容易;,2.湿热比干热传导快，穿透力强，能迅速提高物体内部温度。,3.蒸汽与物品接触，凝结成水,放出潜能,能迅速提高温度,加速微生物死亡。,3.间歇灭菌法,用100 15-3028-37,12-24hrs(使残留的芽孢萌发或营养细胞再被杀死)100（15-30）可以反复23次。,适用于不耐热药品、营养物、特殊培养基等。,4.巴氏消毒法（,低温消毒法,）,牛奶、,酒等在高温下,营养和风味容易受破坏,，利用较低温既可杀死病菌又能保持这些营养物质、风味不变。,巴氏消毒使用温度,：,A:62-65,20-30 B:72,10（少用）,牛奶65,30、71,15（迅速冷却到0 即可饮用）,巴氏消毒法理论依据,：,可杀死大部分病原菌，如结核杆菌、伤寒杆菌等大多数腐生菌的营养体，而对芽孢无效。,巴氏法处理过的物品应迅速冷却至10,左右即可饮用，此法是基于结核杆菌可被致死温度为62,18。,(二),低温,对微生物的影响,1.低于冰点的温度能杀死微生物,原因：,A、细胞体内水分转变成冰晶，引起细胞明显脱水；,B、冰晶对细胞结构尤其是细胞质膜的物理损伤。,但是采用快速冷冻或细胞悬液中加入保护剂，可以减少冰冻对细胞的损害。,由于低温菌的活动，常导致食物变质。温度愈低腐败愈慢。,2.,低温,可延缓微生物的生理活动,（,低温保藏微生物,）,低温下微生物生存原理,A、在低温下酶仍起作用,B、低温微生物质膜中不饱和脂肪含量高,处于低温下大部分微生物代谢活动降低，生长略有停滞，但仍能存活，一旦遇到合适生长温度就可以生长繁殖，并常在4-7,冰箱中保存。,3.,超低温,保藏的微生物原理,（液N保藏,）,A.快速冰冻形成的冰晶体小，故对细胞损害小,B.超低温保藏的微生物往往使用了防冻保护剂（如甘油），可以降低脱水的有害作用。,如大多数微生物在10%甘油等防冻剂中，保存在-96,左右的液N内，超低温可保藏多年甚至于百年。,四、极端pH值对微生物的影响,1.pH过低，改变微生物表面带电状态，,引起细胞膜电荷的变化，,由带负电改为带正电，影响对营养物质的吸收。,2.过高过低pH值导致有机物离子化，,改变生长环境中营养物质,的可给性,进而间接影响微生物。,3.,影响代谢过程中酶,的活性，,酶促反应受到抑制，甚至酶系统遭到破坏。,4.过高过低pH降低微生物对高温的抵抗力。,四、干燥,细菌基本上是生活在水中的生物。,干燥使菌体内蛋白质变性，引起代谢活动停止，影响微生物的活性以至生命力。,环境中过于干燥细菌如何生存？,（在不受热和其它外界因素干扰下）干燥细胞将处于长期休眠状态,细菌的芽孢、藻类和真菌的孢子及原生动物的胞囊都比营养细胞抗干燥。,用干燥法防止食物腐败,（细菌滋生）,如方便面、干果、肉干、葡萄干等。,用干燥法来保存细菌,，如将细菌放置在干燥的沙土中可以长期保存，真空冷冻干燥保存菌种。,一旦提供潮气则会很快复活,。,(一),重金属及盐类,大多数重金属及其所形成的化合物，都是有效的杀菌剂或防腐剂。,重金属离子带阳电荷，易与带阴电荷的菌体蛋白质结合，使蛋白质变性，有较强的杀菌作用。,Hg、Ag、砷与细菌酶蛋白的-SH结合，使蛋白质变性，妨碍细菌代谢活动。,五、,化学药剂,（二）,有机化合物,酚、醇（对芽孢无效，细胞脱水剂，蛋白质变性剂）;,醛（对芽孢有效），常用杀菌剂。,杀菌原理：,A.损伤细胞膜和壁,B.抑制某些酶系统，使蛋白质变性。,醇,为脱水剂也为脂溶剂。可以导致蛋白脱水、溶解细胞膜的脂类物质。从而达到杀菌的目的。（医生打针）。常用的醇为乙醇。,注意：1.乙醇杀菌的能力并不于浓度成正比，在70时最强。,2.甲醇杀毒差且毒性强，不做杀毒剂。,3.丙醇、丁醇杀毒能力比乙醇大，但不溶于水，也不做杀毒剂。,（三）,氧化剂,KMnO,4,、过氧化氢、过氧乙酸等，能使菌体酶蛋白中的巯基，氧化成-S-S基（,二硫基,），使酶失活而达到杀菌、防腐、消毒。,2R,SH,+2X R,SS,R+2XH,（四）,卤素,以Cl、I最常用，Cl用于自来水，I用于皮肤消毒,。,杀菌机理：,漂白粉Ca(OCl),2,及氯气：产生,次氯酸盐,和,原子氧,；,碘：与酶分子中的酪氨酸结合。,（五）,表面活性物质,具有降低表面张力效应的物质叫表面活性剂.,如煤酚皂（来苏尔）、新洁而灭、除垢剂。,杀菌机理：影响细胞生长、分裂,(六),染料,碱性染料有显著的抑菌作用,！,原因,是由于碱性染料的阳离子与菌体羧基或磷酸基起作用，形成弱电离的化合物，妨碍菌体正常代谢，扰乱菌体氧化还原作用，并阻碍芽孢的形成。,六、抗生素对微生物的影响,抗生素,广谱抗生素：金霉素、氯霉素、土霉素等,狭谱抗生素,青霉素：G,+,多粘菌素：G,不同的抗生素针对微生物的不同部位发生作用。,杀菌机理：,抑制,叶酸,合成 如：磺胺类药物等。,叶酸参与核酸的嘧啶和嘌呤的合成,抑制,肽聚糖,合成 如：青霉素，万古霉素等。,抑制,蛋白质,合成 如：链霉素，红霉素、四环素、氯霉素等,第四节 微生物生长量的测定方法,（一）直接测定,直接测定是常用的微生物生长测定方法，它借助显微镜直接观察计数，其优点是测定过程快速，缺点是不能区分微生物的死活。,直接测定法可以分为以下几类：,1.涂片染色法,将已知体积,(0.01ml),的待测样品，均匀地涂布在载玻片的已知面积内,(1cm,2,),，经固定染色后，在显微镜下选择若干个视野计算细胞的数量，每个视野的直径和面积、对应的微生物体积用目镜测微尺测出，结合视野中的微生物数量从而推算0.01ml样品的微生物数量。,2计数器直接计数法,将菌液滴在血球计数板,0.1mm,3,的计数格中（可测细菌、酵母菌、藻类、原生动物等），在显微镜下数出中格的细菌数目，（一般样品稀释至15-20个/中格），根据比例关系折算出单位体积菌液中细菌的数量。,方法简便，测定速度快。,3比例计数法,将待测样品溶液与等体积的血液混合，然后涂片，在显微镜下测定细菌与红血球数的比例，因血液中的红血球数已知(男性,400500,万个ml，女性,350450,万个ml)，由此可以测得细菌数量。,4比浊计数法,这是,测定悬浮细胞的快速方法,。,其原理是细菌细胞是不完全透光的，光束通过悬浮液时会引起光的散射或吸收，降低透光度，在一定范围内透光度与溶液的混浊度即细胞浓度成正比，藉此可以测定细菌浓度。,采用这种方法时；为了得到实际的细胞绝对含量，通常须将已知细胞浓度的样品按上述测定程序制成标准曲线，然后根据透光度或光密度值从标准曲线中直接查得细菌含量。,5、电子计数器法,电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。,该法测定结果较准确，但它只识别颗粒数量，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何小颗粒、丝状物等。,（,二）间接计数法,间接计数法又称活菌计数法。它是通过测定样品中活的细菌数量来间接地表示细菌的含量。这种方法优点在于只计数样品中的活细菌数目，缺点在于测定所需的时间较长，手续繁琐。,1.平板菌落计数法（CFU）,将待测细菌样品先作10倍梯度稀释，然后取相应稀释度的样品涂布于固体平板培养基上，或与未经融化的固体培养基混合、摇匀，培养一定时间后观察并计数生长的菌数，最终根据细菌数和取样量计算出细菌浓度。,2.,液体计数法（MPN法）,液体计数法是根据统计学原理设计的一种方法。具体做法是：先将待测菌液作10倍梯度稀释，然后取相应稀释度的样品分别接种到3管或5管一组液体培养基中，培养一定时间后，观察各管及各组中细菌是否生长、记录结果，再查与之匹配的统计表，即最可能数表(MPN)，算出细菌的最终含量。因此，这种方法又叫最可能数法或MPN法。,测定,硫酸盐还原菌,的数量,硫酸盐还原菌是严格厌氧菌，生长中形成了硫化氢，硫化氢与铁生成大量黑色的硫化亚铁沉淀，在显微镜下这些沉淀很难与细菌区分；由于它是厌氧菌，不能在空气状态下生长，因此平板培养计数也无法使用，对这类菌可以利用它们生长时产生的硫化亚铁黑色特征进行液体培养，按MPN法进行计数。,（1）10倍梯度稀释,1mL,混合,1mL,混合,10mL 9mL 10mL,1,：,10,-1,10,-1,：,10,-2,10,-,2,10,-3,10,-4,10,-5,(3)统计、查表、计算,统计确定数量指标,取生长的管数最多的且稀释度最高稀释度的生长管中生长的管数，为数量指标的第一位数字，后面两个稀释度的生长管数为后两位数，就上例情况而言，3个重复生长的10,-3,和10,-4,两个稀释度，但两者中高稀释度的是10,-4,，其生长管数“3”为数量指标的第一位数字；第二和第三位数则为2和0。因此所得的数量指标为“320”。,查表,所查的统计表是通过其他精确的计数方法，确定的各种数量指标时细菌数量的可能的最大值，在确定了数量指标后，可从MPN三管法统计表查相应的细菌最大可能数量。,MPN三管法测数统计表,上面例子中数量指标“320”对应的细菌最大可能数为,9.5x10,4,3.,薄膜过滤计数法,对于某些细菌含量较低的样品(如空气或饮用水)，可采用薄膜计数法。将待测样品通过带有许多小孔但又不让细菌透过的微孔滤膜，藉助膜的作用将细菌浓缩，再将膜放于固体培养基表面培养，然后类似于平板计数那样计算结果。这种计数法要求样品中不得含有过多的悬浮性固体或小颗粒。,3.薄膜计数法,（1）抽滤,滤膜,，细菌不能通过,支撑体，支撑滤膜,抽气,（2）滤膜培养,（3）统计计数,样品中的细菌数量=菌落数抽滤样品的体积数,例如 上图测出5个菌落，抽滤了100ml自来水,则 自来水中的细菌数=5100ml=50个/L自来水,上述各种活菌计数法中，根本原理都是利用一个细菌可以繁殖生成一个菌落的特点。因此被测的细菌都应处于均匀分散的悬浮状态。对于本身为絮体或颗粒状的细菌样品，如好氧水处理中的活性污泥，在测定计数之前要采取预处理方法(如匀浆器捣碎等)进行强化分散。,(三)重量法,细菌细胞尽管很微小，但是仍然具有一定的体积和重量，在细菌生长过程中，测定单位体积液体中细菌群体重量变化直接表示细菌生长数量的方法称为重量法。,1.测定细胞干重法,测定干重时，需先将细菌分离，再烘干称量。分离可采用离心法或过滤法。取已经培养一段时间的待测细菌样品，用离心机收集生长后的细菌细胞，或用滤纸、滤膜过滤截取生长后的细菌细胞，然后在105-110下进行干燥，称取干燥后的重量，以此代表细菌生长量的多少。,水处理工程设施中的细菌生长量通常采用这种细胞干重测定法。这种方法实际上测得的是水中悬浮物重量，如果水中非细菌类的悬浮物很多的话，势必会严重干扰细菌计数的结果。,非细菌的悬浮物通常大部分是一些固体无机物及少量的油类等有机物，有机物与无机物在物理性质上有一个最大的区别，即在很高的温度下，有机物会被空气中的氧气彻底氧化为CO,2,和H,2,O，只留下非常少的残渣，而无机物化学性质稳定，高温下不会分解，这样我们可以利用高温灼烧的方法来区分细菌与固体无机物。,（1）悬浮物中绝大多数为细菌时,细胞数目=细菌群体的重量个体细菌的平均重量,（2）除细菌外还有大量无机悬浮物时,W1 W2,细菌群体的重量=,W1W2,细胞数目=细菌群体的重量个体细菌的平均重量,（3）除细菌外还有大量有机悬浮物时,过多的有机物悬浮物会对测定结果干扰很大，此时不能用重量法，应改用其他方法。,总体来说重量法方法较之其他方法误差较大，一般只能作为粗率估计的计数方法,。,2.,细胞含氮量法,所有生物包括细菌细胞内的蛋白质氮含量比较稳定，平均为16。根据样品中属于有机来源的氮含量测定结果，就可以求出细菌生长量的多少。,如果水中非细菌的蛋白质比例过大，如屠宰厂废水及食品加工厂废水，这时细菌与游离蛋白质难以区分，这种方法不易参用。,3.DNA含量法,这种方法与细胞含氮量法思路是一样的，可以通过测定DNA的含量来表示细菌的生长量，可采用适当的荧光指示剂或染色剂与菌体DNA作用，用荧光比色或分光光度法测得DNA的含量。,这种方法对样品纯度以及仪器和人员的要求较高，通常只作为少量细菌纯培养时细菌数量的测定，条件合适时，这种方法的精确性是非常高的。,(四)其它生理生化指标法,细菌的生长生命活动过程中，不可避免地要吸收和消耗一些物质，同时产生和分泌另一些物质。测定这些物质的变化与细菌数量的变化有着直接的关系，通过测定这类物质的变化可以间接表示细菌生长的情况。,通常采用的生理生化指标有：,营养物质(COD)的消耗，溶解氧的消耗，有机酸的产生，H,2,和CH,4,的产生。,第五节 菌种的退化、复壮与保藏,一、基本概念,1.菌种退化,微生物易变异。变异分为正变和负变。所谓退化，指的是负变。,菌种退化：指群体中退化的细菌占到一定数量后表现出的菌种性能下降的现象。,2.菌种复壮,为了保持菌种的优良特性能够得到保存，需要进行退化菌种的复壮。方法有纯种分离、寄生复壮等。,衰退的原因：,衰老、变异,衰退的表现：,生长缓慢,优良性状的丧失,抗逆性下降,衰退的预防：,控制继代频率,创造良好的培养条件,采取有效的保存方式,复壮,狭义（被动）,广义（主动）,复壮方法：,选优,汰劣,3.保藏,对于优良的菌种需要进行保藏，以便更好的进行科研、生产及教学工作。,保藏目的：使优良菌种不受污染、不退化、不死亡。,保藏原理：人为的创造一定的环境，使被保藏的菌种处于很低的新陈代谢状态，使微生物的生长、繁殖受到抑制，使微生物处于休眠状态。,保藏方法：定期移植、干燥、隔绝空气、冷冻等。,