DNA分子测序技术的原理发展及应用-(1).ppt

*,*,分子生物学讨论课,发展,及医学应用,DNA,测序基础的原理,讨论组成员 王苗苗 岳莹莹 谭辽 吴兆平,吕琳 周雨馨 洛桑次珍 任怡君,2025/10/22 周三,DNA,测序技术的发展,及原理,DNA,测序技术的发展,DNA,双脱氧链末端终止测序,DNA,化学降解测序,第一代测序技术,454,焦磷酸测序,第二代测序技术,纳米孔单分子测序技术,第三代测序技术,2025/10/22 周三,在,1977,年，,Sanger,等提出了经典的双脱氧核苷酸末端终止测序法,此后，在,S a n g e r,法的基础上，,80,年代中期出现了以荧光标记代替放射性同位素标记、以荧光信号接收器和计算机信号分析系统代替放射性自显影的自动测序仪,Sanger,区别,同一年（,1977,），,Gilbert,等提出了化学降解法。该方法与,Sanger,法类似，都是先得到随机长度的,DNA,链，再通过电泳方法读出序列。,Gilbert,二者的不同之处在于，Gilbert法是先用特定的化学试剂标记碱基再用化学方法打断待测序列，而Sanger法是通过ddNTP随机中断合成待测序列。,第一代测序技术,2025/10/22 周三,第一代测序技术,原理,2.,化学修饰法测序,化学试剂处理末段,DNA,片段，造成碱基的特异性切割，产生一组具有各种不同长度的,DNA,链的反应混合物，经凝胶电泳分离。化学切割反应：包括碱基的修饰修饰的碱基从其糖环上转移出去在失去碱基的糖环处,DNA,断裂。,1.Sanger,法测序,利用一种,DNA,聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸,(dNTP),，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸,(ddNTP),。由于,ddNTP,缺乏延伸所需要的,3-OH,基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在,G,、,A,、,T,或,C,处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种,dNTPs,和,ddNTPs,的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用,X-,光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。,2025/10/22 周三,第一代测序技术,在化学降解测序法中,一个末端被放射性标记的,DNA,片段在,5,组互相独立的化学反应中分别被部分降解,其中每一组反应特异地针对某种碱基。因此生成,5,组放射性标记的分子,每组混合物中均含有长短不一的,DNA,分子,其长度取决于该组反应所针对的碱基在原,DNA,片段上的位置。最后,各组混合物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,再通过放射自显影来检测末端标记的分子。化学降解法刚问世时,准确性较好,也容易为普通研究人员所掌握,因此用得较多。而且,化学降解较之链终止法具有一个明显的优点,即所测序列来自原,DNA,分子而不是酶促合成产生的拷贝,排除了合成时造成的错误。,但化学降解法操作过程较麻烦,逐渐被简便快速的,Sanger,法所代替。,2025/10/22 周三,原理,焦测序技术是一种基于发光法测定焦磷酸盐（,PPi,）的测序技术,3,。其原理是：引物与模板,DNA,退火后，在,DNA,聚合酶（,polymerase,）、三磷酸腺苷硫酸化酶（,ATP sulfurylase,）、萤光素酶（,luciferase,）和三磷酸腺苷双磷酸酶（,apyrase,）,4,种酶的协同作用下完成循环测序反应。当加入的,dNTP,与模板互补时，,DNA,模板与互补的,dNTP,聚合时可以产生等摩尔,PPi,，在三磷酸腺苷硫酸化酶的催化下，,PPi,与,5-,磷酸化硫酸腺苷（,APS,）反应生成等量的,ATP,；在萤光素酶催化作用下，,ATP,与虫萤光素（,luciferin,）反应发光，最大波长约为,560 nm,，可用光电倍增管（,PMT,）或电荷耦合装置（,CCD,）检测。产生的荧光信号强度与聚合的,dNTP,个数成正比，根据加入的,dNTP,类型和荧光信号强度就可实时记录模板,DNA,的核苷酸序列,第二代测序技术,2025/10/22 周三,第三代测序技术,纳米孔测序技术,该技术采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序,纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，因而可 以在此基础上使用多种方法来进行高通量检测,纳米级别的孔径保证了检测具有良好的持续性，所以测序的准确度非常高,2025/10/22 周三,纳米孔测序技术的优点,第三代测序技术,纳米孔测序技术一个最突出的优势就是便宜，尤其是在样品准备阶段几乎不需要耗费什么试剂，而且 也不需要像别的测序方法那样使用核苷酸、聚合酶或连接酶等等。因此，纳米孔测序技术要比传统的直接测（,direct strand sequencing,）、,Sanger,合成测序法或其它方法的费用低得多。,2025/10/22 周三,DNA,测序技术在医学中的应用,人类基因组计划,DNA,测序技术在医学中的应用,基因诊断及基因治疗,法医学,预防医学,2025/10/22 周三,DNA,测序技术在医学中的应用,人类基因组计划,2025/10/22 周三,HGP,的目的,HGP,的目的是解码生命、了解生命的起源、了解生命体生长发育的规律、认识种属之间和个体之间存在差异的起因、认识疾病产生的机制以及长寿与衰老等生命现象、为疾病的诊治提供科学依据。,。,DNA,测序技术在医学中的应用,2025/10/22 周三,HGP,的意义,人类疾病相关的基因是人类基因组中结构和功能完整性至关重要的信息。对于单基因病，采用“定位克隆”和“定位候选克隆”的全新思路，导致了亨廷顿氏舞蹈症、遗传性结肠癌和乳腺癌等一大批单基因遗传病致病基因的发现，为这些疾病的基因诊断和基因治疗奠定了基础。对于心血管疾病、肿瘤、糖尿病、神经精神类疾病（老年性痴呆、精神分裂症）、自身免疫性疾病等多基因疾病是目前疾病基因研究的重点。,。,2025/10/22 周三,基因诊断,基因诊断是利用分子生物学与分子遗传学的方法，检测基因结构及其表达水平，包括分析,DNA,、,RNA,、染色体，蛋白质以及某些代谢产物，探查与,遗传性疾病,相关的基因型、表型和染色体核型以及,感染性疾病,中的病原体的遗传物质从而对疾病进行诊断的方法。它以基因及其表达为目标用于疾病诊断,DNA,测序技术在医学中的应用,2025/10/22 周三,DNA,测序技术在医学中的应用,随着基因诊断技术的不断发展，基因诊断将有更加广阔的应用前景：一方面，它将不断促进疾病发生的分子机制研究；另一方面，它也将极大的促进医学发展的速度与未来医院的效率。,意义,2025/10/22 周三,DNA,测序技术在医学中的应用,基因治疗,基础：,DNA,重组、基因转移、基因克隆和表达。,基因治疗（,Gene Therapy,）是指将外源基因或某种遗传物质转移到靶细胞、组织或器官，使其发挥生物学作用，从而达到治疗疾病的目的。它是一种以改变细胞遗传物质为基础的治疗技术。,“,”,该遗传病不经治疗将有严重后果,2025/10/22 周三,DNA,测序技术在医学中的应用,由于目前基因治疗的发展正处于起步阶段，对遗传病进行基因治疗的研究范围还十分有限，必须符合以下要求的遗传病才可以考虑开展基因治疗研究工作,在,DNA,水平明确其发病原因及机制,1,必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传,2,该基因的表达不需要精确调控,3,该基因能在一种便于临床操作的组织细胞中表达并发挥其生理作用,4,5,2025/10/22 周三,DNA,分子测序在法医中的应用,DNA,测序技术在医学中的应用,自,1985,年,Jeffrey,等应用小卫星,DNA,探针创建,DNA,指纹技术进行个体识别后，引起了法医学的革命性变化。,1989,年美国国会批准,DNA,指纹技术作为法庭物证分析手段，美国联邦调查局（,FBI,）建立了自己的实验室进行,DNA,分析。目前。,DNA,序列分析已广泛应用于法医领域，从一根人发、血迹、骨组织、唾液或精液提取出少量,DNA,可用于人的鉴别。,2025/10/22 周三,Step 1,DNA,的提纯与纯化,Step 2,限制性内切酶消化,Step 3,电泳分离,Step 4,分子杂交,Step 5,指纹图的显示,DNA,指纹分析基本流程,2025/10/22 周三,2,4,1,DNA,序列分析的意义并不局限于对某种疾病作出诊断，还在判断个体对某种重大疾病的易感性、预告发病以及制定对这些疾病的预防措施发挥积极作用。,对于某些传染性流行性病原体由于突变或者外来毒株入侵导致地域性流行，用经典的生物学及血清学方法只能确定其血清型别，不能深入了解相同血清型内各分离株的遗传差异。,DNA,分析有助于研究病原体变异趋势，了解病原体进化过程的规律、扩散途径及优势流行株，有助于爆发性流行的预测，因此在预防医学中大有作为。,DNA,序列分析在推动人口优生优育中也有优势，它避免了用常规细胞遗传学及生化方法诊断遗传病的费时费力弊端，成为遗传病产前诊断的优秀方法。,3,DNA,分子测序对预防医学的影响,