jj选修3——基因工程.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,专题,1,基因工程,基因工程,又叫做,基因拼接技术,或,DNA,重组技术,。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，,定向,地改造生物的,遗传性状,。,原理,操作环境,操作对象,操作水平,基本过程,结果,基因重组,生物体外,基因,/DNA,分子水平,剪切拼接导入表达,人类需要的基因产物,定向,地改造生物的,遗传性状,；,实现基因在不同物种之间的转移，迅速培育出生物新品种,基因工程诞生的理论基础,1,基因拼接的理论基础,(1),大多数生物的遗传物质是,DNA,(2)DNA,的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸,(3),双链,DNA,分子的空间结构都是规则的双螺旋结构,2,外源基因在受体内表达的理论基础,(1),基因是控制生物性状的独立遗传单位,(2),遗传信息的传递都遵循中心法则,(3),生物界共用一套遗传密码,一、基本工具,1.,限制性核酸内切酶,“,分子手术刀”,来源：主要从,原核生物,中分离纯化出来,作用：,一、基本工具,1.,限制性核酸内切酶,“,分子手术刀”,来源：主要从,原核生物,中分离纯化出来,作用：,末端类型：,黏性末端,、,平末端,中轴线,黏性末端,黏性末端,在,G,与,A,之间切割,Eco,RI,限制酶,2.DNA,连接酶,“分子缝合针”,作用,种类,Ecoli DNA,连接酶,T,4,DNA,连接酶,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端,(,效率较低,),DNA,聚合酶,DNA,连接酶,区别,1,区别,2,相同点,只能将,单个核苷酸,连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,形成,磷酸二酯键,在,两个,DNA,片段之间,形成磷酸二酯键,以,一条,DNA,链为模板,，,将,单个核苷酸,通过磷酸二酯键,连接成一条互补的,DNA,链,将,DNA,双链上的,两个缺口同时连接,起来，,不需要模板,DNA,连接酶与,DNA,聚合酶,限制酶,DNA,解旋酶,区别,切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键,将,DNA,两条链的氢键打开形成两条单链,限制性内切酶与,DNA,解旋酶,3.,基因进入受体细胞的载体,“,分子运输车”,载体的作用：将外源基因送入受体细胞,载体的种类：,质粒,噬菌体的衍生物,动植物病毒等,裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟核,DNA,）之外，并具有自我复制能力的双链环状,DNA,分子,3.,基因进入受体细胞的载体,“,分子运输车”,作为载体的必要条件：,能在宿主细胞内,复制,并稳定地,保存,。,具有,多个限制酶切点,以便与目的基因连接,具有某些,标记基因,对受体细胞,无害,运载体,DNA,大小,适合，便于提取和操作,1.2,基因工程的基本操作程序,知识回顾：,基因工程基本操作的四个,步,骤,1,、目的基因的获取,2,、基因表达载体的构建,3,、目的基因导入受体细胞,4,、目的基因的检测与鉴定,有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用,载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。,才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。,一、目的基因的获取,1,目的基因主要是,编码蛋白质的基因,：,如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相,关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、,与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的,基因；也可以是,具调控作用的因子,等。,2,获取目的基因的常用方法：,1、从基因文库中获取,2,、利用,PCR,技术扩增,3,、人工合成,1.,从基因文库中获取目的基因,1.,基因文库的概念,:,将含有某种生物不同基因的许多,DNA,片断，导入到受体菌的,群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。,2.,基因文库的种类,:,基因组文库：,含有一种生物的,全部,基因,部分基因文库：,只包含了一种生物的,部分,基因，,如：,cDNA,文库,基因的结构,非编码区,非编码区,编码区,RNA,聚合酶结合位点,外显子,内含子,终止子,启动子,原核,真核,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是,_,的，边,_,边,_,编码区是间隔的、,_,的，先,_,后,_,相同点,都由能够编码蛋白质的,_,和具有调控作用的,_,区组成的,连续,不连续,编码区,非编码,转录,翻译,转录,翻译,基因文库的构建方法,基因组文库的构建,提取某种生物的,全部,DNA,用适当的限制酶酶切,一定大小的,DNA,片段,将,DNA,片段与载体连接,重组载体,基因组文库,导入受体菌中储存,cDNA,文库的构建,-,逆转录法：,提取某种生物的某器官或,特定,发育时期的,mRNA,单链,DNA,双链,cDNA,片段,重组载体,与载体连接,cDNA,文库,反（逆）转录酶,DNA,聚合酶,导入受体菌中储存,思考？,真核生物的基因用逆转录法得到的,cDNA,与原基因相同吗？,真核细胞的,cDNA,的获取,编码区,非编码区,非编码区,DNA,聚合酶,剪接有关的酶,RNA,聚合酶,mRNA,前体,mRNA,单链,DNA,cDNA,逆转录酶,转录,剪接,逆转录,复制,启动子,终止子,基因,不含,非编码序列,。即不含,非编码区,和,内含子,基因组,DNA,文库与,cDNA,文库的比较,文库类型,cDNA,文库,基因组文库,文库大小,基因中启动子（具有启动作用的,DNA,片段）,基因中内含子,(,位于编码蛋白质序列的非编码,DNA,片段）,基因多少,物种间的基因交流,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,2.,利用,PCR,技术扩增目的基因,1,概念：,PCR,全称为,_,，是一项,在生物,_,复制,_,的核酸合成技术。,2,原理：,DNA,双链复制,原料：,模板,DNA,；,DNA,引物；四种脱氧核苷酸；热稳定,DNA,聚合酶,(TaqDNA,聚合酶,),多聚酶链式反应,体外,特定,DNA,片段,3,前提：,已知目的基因的一段核苷酸序列,PCR,技术的操作过程,a,、变性,（,90-95,）：双链,DNA,模板在热作用下，,_,断裂，形成,_,b,、复性,（,复性,55-65,）：系统温度降低，,引物,与,DNA,模板结合，形成局部,_,。,c,、延伸,（,70-75,）：在,Taq,酶,的作用下，合成与模板互补的,_,。,氢键,单链,DNA,双链,DNA,链,d.,重复,a.b.c,步骤：每重复一次，目的基因增加,_,倍,一,PCR,的基本反应步骤,变性,90-95,C,延伸,70-75,C,退火,55-60,C,过程：,PCR,技术的操作过程,PCR,反应体系中目的基因成,指数,(2,n,),形式扩增,思考？,1,个,DNA,分子进行,PCR,扩增,循环,4,次，,理论上至少需要几个引物？,2,（,2,n,-1,）,(n,为循环次数,),（,2,4,-1,）,2=30,PCR,技术扩增与,DNA,复制的比较,DNA,复制,PCR,技术,场所,原理,条件,解旋方式,酶,特点,结果,碱基互补配对原则,碱基互补配对原则,四种脱氧核苷酸、模板、酶、,ATP,四种脱氧核苷酸、模板、酶、,引物,DNA,在高温下变性解旋,解旋酶催化解旋,半保留复制、,边解旋边复制,半保留复制、,全解旋再复制,体外复制,主要在细胞核内,大量的,DNA,片段,形成整个,DNA,分子,热稳定的,DNA,聚合酶,细胞内的,DNA,聚合酶、解旋酶、,DNA,连接酶等,3.,人工合成法,在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用,DNA,合成仪人工合成,蛋白质的氨基酸序列,mRNA,的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,化学合成,推测,推测,思考：,化学法合成的目的基因含,内含子、启动子和终止子,吗？,人工合成法,（,真核生物,）,反转录法,目的基因的信使,RNA,目的基因,化学合成法,肽链氨基酸序列,信使,RNA,序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,推测,推测,单链,DNA,合成,那么原核生物和真核生物基因结构有没有区别呢？,课堂小结,目的基因的获取,1,、从基因文库中获取,2,、利用,PCR,技术扩增,3,、人工合成,种类,基因组文库：,含有一种生物的,全部,基因,部分基因文库：,只包含了一种生物的,部分,基因，,如：,cDNA,文库,二、基因表达载体的构建,基因工程的核心,1,目的：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可,以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达,和发挥作用。,2,基因,表达载体,的组成：,复制原点,+,目的基因,+,启动子,+,终止子,+,标记基因,表达载体,启动子：,位于基因的首端的一段特殊的,DNA,片断，它是,RNA,聚合酶识别和结合的部位,，有了它才能,驱动基因转录出,mRNA,，,最终获得蛋白质,终止子：,位于基因的尾端的一段特殊的,DNA,片断，,能终止,mRNA,的转录,标记基因,的作用是,为了,鉴别,受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,基因表达载体的构建过程,质粒,DNA,分子,限制酶处理,两个切口,获得目的基因,DNA,连接酶,重组,DNA,分子（重组质粒）,同一种,一个切口,两个黏性末端,三、将目的基因导入受体细胞,1,转化：,目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞,内维持稳定和表达的过程。,2,常用的受体细胞：,大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌,和动植物细胞等。,3,目的基因导入受体细胞的原理：,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,1,、目的基因导入植物细胞的方法,（,1,）农杆菌转化法,农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植 物，对大多数单子叶植物没有感染能力。,原理：,Ti,质粒上的,T-DNA,可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的,DNA,上。,三、目的基因导入受体细胞,构建基因表达载体,转入,农杆菌,植物细胞,导入,稳定维持和表达,过程：,1,、目的基因导入植物细胞的方法,（,2,）基因枪法：,目的基因导入单子叶植物细胞,操作方法：利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属粒表面的表达载体,DNA,打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法,。,钨粉粒子和金粉粒子，,粒子的直径一般在,0.6,4um,。,适用：,单子叶植物,1,、目的基因导入植物细胞的方法,（,3,）花粉管通道法：,将目的基因导入植物细胞,操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入,DNA,（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞,特点,:,十分简便经济。,例：转基因抗虫棉,2,、将目的基因导入动物细胞,方法：显微注射法,程序,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显微注射 受精卵 新性状动物,3,、将目的基因导入微生物细胞,微生物作受体细胞原因,：,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,常用菌：大肠杆菌,常用法：,Ca,2+,处理,获得感受态细胞,过程：,Ca,2+,处理,大肠杆菌,感受态,细胞,感受态细胞,吸收,DNA,表达载体,与感受态,细胞混合,小结：,将目的基因导入受体细胞,生物种类,植物细胞,动物细胞,微生物细胞,常用方法,农杆菌转化法,显微注射技术,Ca,2+,处理法,受体细胞,体细胞,受精卵,原核细胞,转化过程,将目的基因插入到,Ti,质粒的,T-DNA,上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的,DNA,表达,将含有目的基因的表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物,Ca,2+,处理细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收,DNA,分子,四、目的基因的检测与鉴定,导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组,DNA,分子吗？,1,真正能摄入重组,DNA,分子的受体细胞很少。,2,目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？,不一定，需要检测,1,、鉴定,分子水平的鉴定,转基因生,物的DNA,探针,15,N,15,N,1,4,N,1,4,N,（,1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了,目的基因,基因探针：,放射性同位素等标记的DNA分子,方法,DNA,分子杂交技术,变性,变性,1,、鉴定,分子水平的鉴定,变性,方法,分子杂交技术,（,2,）检测目的基因是否转录出了,mRNA,探针,15,N,15,N,转基因生物,的,mRNA,1,4,N,1,4,N,1,、鉴定,分子水平的鉴定,提取,（,3,）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法抗原,-,抗体杂交,苏云金杆菌,Bt,毒素蛋白,将,Bt,毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗,Bt,毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,2,、鉴定,个体水平的鉴定,抗虫、抗病接种实验，活性比较实验,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,思考？,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了,表达,。,受体细胞摄入,DNA,分子后就说明目的基因完成了表达吗？,目的基因的表达和检测,接种实验,抗原抗体杂交法,DNA-RNA,分子杂交法,DNA,分子杂交法,受体是否具有,转基因特征,个体,水平,目的基因是否翻译,目的基因是否转录,目的基因是否导入,分子,水平,方法,检测对象,归纳,:,基因工程的基本操作程序,获取目的基因,从基因文库,利用,PCR,化学方法人工合成,构建基因表达载体,目的基因、启动子、终止子、标记基因,将目的基因导入受体细胞,转化法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）,目的基因的检测与鉴定,检测：是否插入、转录、翻译,基因工程的应用,一,、植物基因工程硕果累累,植物基因工程技术：,1.,提高农作物的抗逆能力,2.,改良农作物的品质,3.,利用植物生产药物,1.,抗虫转基因植物,抗虫棉叶子,正常棉叶子,使用化学农药的缺点：,造成环境污染,损害人类健康,增加生产成本,用于杀虫的基因主要是：,Bt,毒蛋白基因,蛋白酶抑制剂基因,淀粉酶抑制剂基因,植物凝集素基因等,2.,抗病转基因植物,抗烟草花叶病毒转基因甜椒,抗病毒转基因西葫芦,抗病转基因植物所采用的基因：,病毒外壳蛋白基因,病毒的复制酶基因,抗真菌的基因：,几丁质酶基因,抗毒素合成基因,3.,其他抗逆转基因植物,耐寒、耐旱转基因水稻,4.,利用转基因改良植物的品质,含大量维生素的转基因玉米,抗癌抗衰老的紫色西红柿,转入维生素,A,合成酶基因的大米,转基因矮牵牛,转基因蓝玫瑰,转入荧光酶的转基因烟草苗,1.,用于提高动物生长速度,二,、动物基因工程前景广阔,转入外源生长激素基因的“超级小鼠”,2.,用于改善畜产品的品质,“乳糖不耐症”,乳糖含量低的奶牛：,将,肠乳糖酶,基因导入奶牛基因组,3.,用转基因的动物生产药物,人治疗性抗体转基因奶牛,含有人凝血因子,的转基因羊,乳腺生物反应器生产抗凝血酶,蛋白,4.,用转基因的动物作器官移植的供体,导入人基因具特殊用途的猪和小鼠,三、基因工程药品异军突起,基因工程肝炎疫苗,基因工程药物发酵设备,胰岛素是,治疗糖尿病,的,特效药,。一般临床上使用的胰岛素主要从,猪、牛等家畜的胰腺,中提取，一名糖尿病患者每年需用的胰岛素需要从,40,头牛或,50,头猪的胰脏中才能提取到。,1978,年，科学家将动物体内的,胰岛素基因与大肠杆菌,DNA,分子重组,，用,2000ml,大肠杆菌发酵液得到,100kg,胰岛素。,1982,年，美国一家基因公司用基因工程方法生产的胰岛素投入市场，售价降低了,30%50%,。,基因工程药品,胰岛素,治疗侏儒症,的,唯一方法,，是向人体注射生长激素。而生长激素的获得很困难。治疗一名侏儒症患者每年需要从,80,具尸体的脑下,垂体,中提取生长激素。,现可利用基因工程方法，将人的,生长激素基因导入大肠杆菌,中，使其生产生长激素。人们从,450 L,大肠杆菌培养液中提取的生长激素，相当于,6,万具尸体的全部产量。,基因工程药品,生长激素,干扰素是,病毒侵入细胞后产生,的一种,糖蛋白,。干扰素几乎能,抵抗所有,病毒引起的,感染,，是一种,抗病毒,的,特效药,。此外干扰素对,治疗,某些,癌症,和,白血病,也有一定疗效。,传统的干扰素生产方法是从人血液中的,白细胞内提取,，每,300L,血液只能提取出,1mg,干扰素。,19801982,年，科学家用基因工程方法在,大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素,，是传统的生产量的,12,万倍。,1987,年上述干扰素大量投放市场。,基因工程药品,干扰素,基因工程干扰素,传统疫苗存在许多缺点：生产过程需,大量繁殖病原体,，对工作人员,健康造成很大威胁,；病原体的减毒、灭活有可能,不够彻底,，导致接种者,直接感染,。,基因工程疫苗,：将起关键作用的、序列保守的蛋白质基因重组到细菌或真核细胞内，生产蛋白质，制作成疫苗。它不使用病原体本身，所以,安全,，还可以把不同病原体的抗原基因重组到同一受体细胞，生产,多价疫苗,。,基因工程药品,基因工程疫苗,基因工程艾滋病疫苗,基因工程乙肝疫苗,基因诊断：,也称为,DNA,诊断,或,基因探针技术,，即在,DNA,水平分析检测某一基因，从而对特定的疾病进行诊断。,探针制备：,放射性同位素,(,如,32,P),、荧光分子,等标记的,DNA,分子；,原 理：利用,DNA,分子杂交原理,；,四,、基因治疗曙光初照,基因探针：,基因探针就是一段与目的基因或,DNA,互补的,特异核苷酸序列,。它包括整个基因，或基因的一部分；可以是,DNA,本身，也可以是由之转录而来的,RNA,。,DNA,分子杂交原理：,DNA,分子杂交是基因诊断最基本的方法之一。其基本原理是：,互补的,DNA,单链,能够在一定条件下,结合成双链,，即能够进行杂交。这种结合是,特异,的，即严格按照碱基互补配对进行。因此，当用一段,已知基因的核苷酸序列作为探针,，与被测基因进行接触，若两者的碱基完全配对成双链，则表明被测基因中含有已知的基因序列。,基因诊断技术在什么方面发展迅速？,在,诊断遗传性疾病,方面发展迅速。目前已经可以对几十种遗传病进行,产前诊断,。,1,）,珠蛋白的,DNA,探针 镰刀状细胞贫血症,2,）苯丙氨酸羧化酶基因探针 苯丙酮尿症,3,）白血病患者细胞中分离出的癌基因制备的,DNA,探针 白血病,举例,基因治疗：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。,是指是把,健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞,中，达到治疗疾病的目的。,患半乳糖血症的患者，由于细胞内半乳糖苷转移酶,基因缺陷,而缺少半乳糖苷转移酶，使过多的半乳糖在体内积聚，引起肝、脑等功能受损。,1971,年，美国科学家在体外做了试验，用,带有半乳糖苷转移酶基因的噬菌体侵染患者的离体组织细胞,，结果发现这些组织细胞能够利用半乳糖了。这表明，用基因替换的方法治疗这种遗传病是可能的。,首例基因治疗的,受益者,（,美国,1990,年,）,到,1998,年底，世界范围内累计,3134,人接受了基因转移试验,1990,年美国国立卫生,研究院,治愈一位“重症联合免疫缺陷综合症”的,4,岁女孩,基因治疗：用一个正常的基因来代替缺陷基因,ADA,基因缺陷,ADA,：腺苷酸脱氨酶,基因治疗的分类,体外基因治疗,：先从病人,体内,获取某种细胞，例如,T,淋巴细胞，进行培养，然后，在,体外,完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。,体内基因治疗,：直接向人体组织细胞中转移基因的治病方法。,基因工程与食品业,基因工程为人类开辟,新的食物来源,。,1,）,鸡蛋白基因,在大肠杆菌和酵母菌中表达获得成功。这表明，未来能用发酵罐培养的大肠杆菌或酵母菌来生产人类所需要的,卵清蛋白,。,2,）用基因工程的方法,从微生物中获得,人们所需要的,糖类,、,脂肪,和,维生素,等产品。,基因工程为食品工业中提供了什么前景？,基因工程与环境保护,1,）用于,环境监测,。,2,）用于被污染,环境的净化,。,基因工程在环保方面有什么应用？,例如：用,DNA,探针,可以检测,饮用水中病毒,的含量。此方法的特点是,快速,、,灵敏,，,1,吨水中有,10,个病毒也能检测出来。,通过基因工程方法怎样进行环境监测？,1,）用基因工程产物,“,超级细菌,”分解石油，可以大大提高细菌分解石油的效率。具体方法：将能分解三种烃类的,假单孢杆菌,的基因都转移到能分解另一种烃类的假单孢杆菌内，创造出了能同时分解四种烃类的“超级细菌”。,2,）用基因工程培养出,“吞噬”汞和降解土壤,中,DDT,的,细菌,，以及能够,净化镉污染,的,植物,。,3,）通过基因重组构建新的,杀虫剂,，取代生产过程中耗能多、易造成环境污染的农药，并试图通过基因工程,回收和利用工业废物,。,通过基因工程方法怎样净化被污染的环境？,蛋白质工程流程图,从预期的蛋白质,功能,出发,设计预期的蛋白质,结构,推测应有的,氨基酸,序列,找到相应的,脱氧核苷酸序列(即基因),板书：用干扰素例子，反推过程。第,4,步后接着做什么？,基因,DNA,mRNA,氨基酸序列,多肽链,蛋白质,三维结构,转录,翻译,折叠,生物功能,预期功能,分子,设计,DNA,合成,以中心法则为原理和线索,蛋白质工程,比较：基因工程和蛋白质工程,基因工程,蛋白质工程,相同点,都要改造基因，都属于分子水平,产生新的,基因型，无新基因,基因（型）,产生的蛋白质,原有的,可以是新的,联系,蛋白质工程是以基因工程为基础，,是基因工程的应用和延伸；前者可为后者修饰、改造酶,