微生物11.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一节 微生物细胞的化学组成和营养要素,营养物质是微生物构成菌体细胞的基本原料，也是获得能量以及维持其它代谢机能必须的物质基础。,微生物吸收何种营养物质取决于微生物细胞的化学组成。,一、微生物细胞的化学组成,元素组成：碳、氢、氧、氮和各种矿物质元素（磷、硫、钾、钙、镁、铁等）。,化学组成：水分（80左右）；干物质（20左右：干物质有蛋白质、核酸、碳水化合物、脂类和矿物质等）。,二、微生物的营养物质及其生理功能,微生物的营养物质有六大要素：碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水分。,（一）水分,水分约占鲜重的,70,90,。,不同种类微生物细胞含水量不同。,同种微生物处于发育的不同时期或不同的环境其水分含量也有差异，幼龄菌含水量较多，衰老和休眠体含水量较少。,微生物所含水分以游离水和结合水两种状态存在。,结合水不具有一般水的特性，不能流动，不易蒸发，不冻结，不能作为溶剂，也不能渗透。游离水则与之相反，具有一般水的特性，能流动，容易从细胞中排出，并能作为溶剂，帮助水溶性物质进出细胞。微生物细胞游离态的水同结合态的比例为,41,。,（四）氮源物质,能提供微生物所需氮素的营养物质称为氮源。无机的氮源物质一般不提供能量，只有极少数细菌如硝化细菌可利用铵态氮和硝态氮作为氮源和能源。,微生物营养上要求的氮源物质可以分为三个类型：,1空气中分子态氮,只有少数具有固氮能力的微生物（如自生固氮菌、根瘤菌）能利用。,2无机氮化合物,如铵态氮（NH,4,+,）、硝态氮（NO,3,-,）和简单的有机氮化物（如尿素），绝大多数微生物可以利用。,3有机氮化合物,大多数寄生性微生物和一部分腐生性微生物需以有机氮化合物（蛋白质、氨基酸）为必需的氮素营养。在实验室和发酵工业生产中，常常以铵盐、硝酸盐、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、鱼粉、血粉、蚕蛹粉、豆饼粉、花生饼粉作为微生物的氮源。,（五）无机盐,矿物元素是微生物细胞结构物质不可缺少的组成成分和微生物生长不可缺少的营养物质。,无机矿质元素分为常量元素和微量元素。常量矿质元素是磷、硫、钾、钠、钙、镁、铁等。磷、硫的需要量很大，磷是微生物细胞中许多含磷细胞成分，如核酸、核蛋白、磷脂、三磷酸腺苷（ATP）、辅酶的重要元素。硫是细胞中含硫氨基酸及生物素、硫胺素等辅酶的重要组成成分。钾、钠、镁是细胞中某些酶的活性基团，并具有调节和控制细胞质的胶体状态、细胞质膜的通透性和细胞代谢活动的功能。微量元素有钼、锌、锰、钴、铜、硼、碘、镍、溴、钒等，一般在培养基中含有0.1mg/L或更少就可以满足需要。功能：许多无机矿物质元素构成酶的活性基团或酶的激活剂；并具有调节细胞的渗透压，调节酸碱度和氧化还原电位以及能量的转移等作用。,(六)生长因子,生长因子是微生物维持正常生命活动所不可缺少的、微量的特殊有机营养物，微生物自身不能合成这些物质，必须在培养基中加入。缺少这些生长因子就会影响各种酶的活性，新陈代谢就不能正常进行。生长因子是指维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等特殊有机营养物。而狭义的生长因子仅指维生素。这些微量营养物质被微生物吸收后，一般不被分解，而是直接参与或调节代谢反应。在自然界中自养型细菌和大多数腐生细菌、霉菌都能自己合成许多生长辅助物质，不需要另外供给就能正常生长发育。,第二节 微生物对营养物质的吸收,微生物对营养物质的吸收是借助生物膜的半渗透性及其结构特点来吸收营养物质和水分的。,大分子的蛋白质、多糖、脂肪，微生物则分泌出相应的酶（这类在细胞内产生，分泌到细胞外发挥作用的酶称为胞外酶）将大分子降解成小分子后，再吸收利用。,各种物质对细胞质膜的透性不一样，就目前对细胞膜结构及其传递系统的研究，认为营养物质主要以以下几种方式透过细胞膜。,一、单纯扩散,是通过细胞膜进行内外物质交换最简单的一种方式。营养物质通过分子的随机运动透过微生物细胞膜上的小孔进出细胞。,特点：,物质由高浓度区向低浓度区扩散（浓度梯度）；,单纯的物理扩散作用，不需要能量.一旦细胞膜两侧的浓度梯度消失（即细胞内外的物质浓度达到平衡),细胞内外的物质交换达到动态平衡）；,单纯扩散是非特异性的，没有运载蛋白质（渗透酶）参与，也不与膜上的分子发生反应，扩散的物质本身也不发生改变；,单纯扩散的物质主要是一些小分子物质，如一些气体（O,2,、CO,2,）、水、某些无机离子及一些水溶性小分子（甘油、乙醇等）。,二、促进扩散,在细胞膜上存在多种具有运载营养物质功能的特异性蛋白质，称为渗透酶。大多是诱导酶，当外界存在所需的营养物质时，能诱导细胞产生相应的渗透酶，每一种渗透酶能帮助一类营养物质的运输。,特点：,物质由高浓度区向低浓度区扩散（浓度梯度）；,单纯的物理扩散作用，不需要能量；,需要渗透酶；,已分离出有关葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、亮氨酸、精氨酸、酪氨酸、磷酸、Ca,2+,、Na,+,、K,+,等的载体蛋白.,三、主动运输,靠浓度梯度吸收营养物质不能满足高速生长繁殖的微生物的需要。,特点：,营养物质由低浓度向高浓度进行，可逆浓度梯度进行；,需要渗透酶携带，渗透酶与底物有高度的特异性，其与底物的亲和力随渗透酶的构型而改变；,需要消耗代谢能量ATP。先形成渗透酶-营养物质复合体。复合体旋转180从膜外方转移到细胞膜内表面，消耗能量，使渗透酶构型发生变化，亲和力减弱，被结合的物质释放到细胞质中。构型变化的渗透酶，再获得能量恢复原状，亲和力增强，结合位置朝向膜外，又可重复进行这种主动运输。,是微生物物质运输的主要方式。,四、基团转位,除具有主动运输的特点外，主要是被转运的物质改变了本身的性质，有化学基团转移到被转运的营养物质上面去。,基团转位可转运糖、糖的衍生物，如葡萄糖、甘露糖、果糖、N-乙酰葡萄糖胺和-半乳糖苷以及嘌呤、嘧啶、碱基、乙酸（但不能输送氨基酸）等。这个运输系统主要存在于兼性厌氧菌的和厌氧菌中。但某些好氧菌，如枯草杆菌和巨大芽孢杆菌(,B.megatherium,)也利用磷酸转移酶系统将葡萄糖传送到细胞内。,再 见!,第三节 微生物的营养类型,根据微生物的能源、供氢体和碳源不同，将微生物分为光能自养型、光能异养型、化能自养型和化能异养型四种营养类型。,一、光能自养型,利用光能为能源，以二氧化碳（CO,2,）或可溶性的碳酸盐利用光能为能源，以二氧化碳（CO,2,）或可溶性的碳酸盐（CO,3,2-,）作为唯一的碳源或主要碳源。以无机化合物（水、硫化氢、硫代硫酸钠等）为氢供体，还原CO,2,，生成有机物质。光能自养型微生物主要是一些蓝细菌、红硫细菌、绿硫细菌等少数微生物，它们由于含光合色素，能使光能转变为化学能（ATP），供细胞直接利用。,光,蓝细菌 CO,2,+2H,2,O-CH,2,O+H,2,O+O,2,叶绿素 光,绿硫细菌 CO,2,+2H,2,S-CH,2,O+H,2,O+2S 菌绿素,比较以上两反应，可写成以下通式,：,光 CO,2,+2H,2,A-CH,2,O+H,2,O+2A 光合色素,二、化能自养微生物,这一类微生物的能源来自无机物氧化所产生的化学能，利用这种能量去还原CO,2,或者可溶性碳酸盐合成有机物质。如亚硝酸细菌、硝酸细菌、铁细菌、硫细菌、氢细菌分别利用氧化NH,3,、NO,2,-,、Fe,+,、H,2,S和H,2,产生的化学能来还原CO,2,，形成碳水化合物。例如：亚硝酸细菌能从氧化氨为亚硝酸中获得能量，用以还原二氧化碳，形成碳水化合物。亚硝酸细菌 2NH,3,+3O,2,+2H,2,O-2HNO,2,+4H,+,+4OH,-,+能量 CO,2,+4H,+,-CH,2,O+H,2,O 这一类型的微生物完全可以生活在无机的环境中，分别氧化各自合适的还原态的无机物，从而获得同化CO,2,所需的能量。,三、光能异养型微生物,这种类型的微生物以光能为能源，利用有机物作为供氢体，还原CO,2,，合成细胞的有机物质。例如深红螺菌利用异丙醇作为供氢体，进行光合作用并积累丙酮。光 2(CH,3,),2,CHOH+CO,2,-2CH,3,COCH,3,+CH,2,O+H,2,O 光合色素,此菌在光和厌氧条件下进行上述反应。但在黑暗和好氧条件下又可能用有机物氧化产生的化学能推动代谢作用。,四、化能异养型微生物,这种类型的微生物其能源和碳源都来自于有机物，能源来自有机物的氧化分解，碳源直接取自于有机碳化合物。它包括自然界绝大多数的细菌，全部的放线菌、真菌和原生动物。根据生态习性不同可将这种营养类型分为以下几种：1腐生型 从无生命的有机物获得营养物质。引起食品腐败变质的某些霉菌和细菌就属这一类型。如引起腐败的梭状芽孢杆菌、毛霉、根霉、曲霉等。2寄生型 必须寄生在活的有机体内，从寄主体内获得营养物质才能生活称为寄生，这类微生物叫寄生微生物。,3.,兼性腐生或兼性寄生：在腐生和寄生之间存在着不同程度的既可腐生又可寄生的中间类型。,第四节 培养基（medium）,培养基是指经人工配制而成的适合微生物生长繁殖和积累代谢产物所需要的营养基质。,配制培养基不但需要根据不同微生物的营养要求，加入适当种类和数量的营养物；并要注意一定的碳氮比例（C/N）；还要调节适宜的酸碱度（pH）；保持适当的氧化还原电位和渗透压。,一、配制培养基的基本原则,配制微生物的培养基，主要考虑以下几个因素：,1、根据培养的对象和目的来配制。,应考虑培养何菌、获何产物、用于实验室还是大规模生产、作种子培养用还是发酵用等方面。,培养细菌、放线菌、酵母、霉菌的培养基不同。一般培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基；培养放线菌常用高氏一号培养基；培养酵母常用麦芽汁培养基；培养霉菌常用马铃薯培养基和察氏培养基。病毒等专性寄生微生物不能在人工制备的一般培养基上生长。,如果是为了得到大量的菌体或作种子培养基，营养成分要丰富，氮源的量要提高。如为了得到微生物代谢产物，则应提高碳源含量。,2、要注意各种营养物质的浓度。,营养要素的比例大致是：水 碳源 氮源 P、S K、Mg 生长因子。,培养基中的碳氮比(C:N)最为重要，如在谷氨酸发酵时，C:N为100:（0.52）时菌体大量繁殖，积累少量谷氨酸；当C:N为100:(1112)时，则产生大量的谷氨酸。,还需注意无机盐的量及其平衡，生长因子的适当比例。,3、要调节适宜的酸碱度。,各类微生物生长繁殖的最适pH值不同，一般来说，大多数细菌、放线菌的最适PH值为中性至偏碱性(pH在7.07.5)，而酵母和霉菌则偏酸性(pH在4.56.0)。,微生物在生长代谢过程中可引起pH值的变化，需要在培养基中加一些缓冲剂。常用的缓冲剂一般是由一氢和二氢磷酸盐（如磷酸氢二钾和磷酸二氢钾）等摩尔溶液（pH6.8）组成的磷酸缓冲剂，不仅有缓冲作用，还有磷源和钾源作用。产酸过程中还可加入CaCO3（1%5%），也可用NaHCO3。,4、选择培养基原料要经济节约。,“以粗代精”、“以野代家”、“以废代好”、“以简代繁”、“以烃代粮”、“以纤代糖”、“以氮代朊”、“以国产代进口”。例如碳源可用纤维水解物、废糖蜜等代替淀粉、葡萄糖等。氮源用花生饼、豆饼等代替黄豆粉、蛋白胨等。,二、培养基的类型,（一）根据对培养基成分的了解程度划分 1天然培养基：,是利用一些天然的动植物组织器官和抽提物，如牛肉膏、蛋白胨、麸皮、马铃薯、玉米浆等制成。它们的优点是取材广泛，营养全面而丰富，制备方便，价格低廉，适宜于大规模培养微生物之用。缺点是成分复杂，每批成分不稳定。如培养细菌的肉汤蛋白胨培养基：,牛肉膏 3g 蛋白胨 5g 水 1000ml pH 7.27.4,2合成培养基：,是利用已知成分和数量的化学物质配制而成。此类培养基成分精确，重复性强，一般用于实验室进行营养代谢、分类鉴定和选育菌种等工作。缺点是配制较复杂，微生物在此类培养基上生长缓慢，加上价格较贵，不宜用于大规模生产。如实验室常用的高氏1号培养基，察氏培养基，葡萄糖铵盐培养基。,培养细菌的葡萄糖铵盐培养基配方：,葡萄糖 20g NaCl 5g,(NH4)2SO4 2g MgSO4 0.4g,尿素 3g MnSO4 0.01g,K2HPO4 3g FeSO4 0.01g,KH2PO4 1g pH 7.07.2,H2O 1000ml,3半合成培养基：,用一部分天然物质作为碳氮源及生长辅助物质，又适当补充少量无机盐类，这样配制的培养基叫半合成培养基。如实验室常用的马铃薯蔗糖培养基。半合成培养基应用最广，能使绝大多数微生物良好地生长。,（二）根据物理状态划分,1液体培养基：,把各种营养物质溶解于水中，混合制成水溶液，调节适宜的pH，成为液体状态的培养基质。该培养基有利于微生物的生长和积累代谢产物，常用于大规模工业化生产和观察微生物生长特征和研究生理生化特性。,2固体培养基：,一般采用天然固体营养物质，如马铃薯块、麸皮等作为培养微生物的营养基质。常在液体培养基中加入一定量的凝固剂，如琼脂（1.5%2.0%）、明胶等煮沸冷却后，使凝成固体状态，常用来观察、鉴定和分离纯化微生物。,3.半固体培养基：,加入少量凝固剂（0.50.8的琼脂）则成半固体状态的培养基叫半固体培养基，常用来观察细菌的运动，和保存菌种。,（三）根据培养基的功能来划分,1、增殖培养基（加富培养基）,：自然界经常是多种微生物混杂生长，根据某种微生物的生长要求，加入有利于这种微生物生长繁殖所需的营养物质，同时还应减少其他菌的生长，使该种微生物旺盛地大量生长，这种培养基称为。如加入血、血清、动植物组织提取物，这种培养基常用于菌种筛选工作。,2、鉴别培养基,：根据微生物能否利用培养基中某种营养成分，依靠指示剂的显色反应，借以鉴别不同种类的微生物的培养基，称为鉴别培养基。鉴别培养基也可用作分离某种微生物，例如，区别大肠杆菌和致病的志贺氏菌、沙门氏菌可采用伊红美兰培养基。,EMB的成分,：,蛋白胨 10g 2%水溶伊红液 20ml,K2HPO4 2g 0.32%水溶甲基兰液 20ml,乳糖 10g 琼脂 15g,燕馏水 1000ml,其中，伊红为红色酸性染料，美兰为兰色碱性染料，当大肠杆菌分解乳糖产生大量的有机酸，能使伊红与美兰结合成黑色化合物，使大肠杆菌呈紫黑色，且伊红还能发出略呈绿色的荧光，所以紫黑色菌落表面具有金属光泽。而志贺氏菌、沙门氏菌不分解乳糖，菌落无色。,此外，属于鉴别培养基的还有明胶培养基可以试验是否液化明胶，醋酸铅培养基可检查H2S的产生等。,3、选择培养基,：在培养基中加入某种化学物质以抑制不需要菌的生长，而促进某种需要菌的生长，这类培养基叫选择培养基。常用的抑制物质有染料和抗生素，如结晶紫抑制大多数革兰氏阳性细菌，青霉素、链霉素能抑制细菌和放线菌，赤霉素、灰黄霉素能抑制霉菌和酵母菌的生长。,第五节 微生物的生长,一、微生物生长的概念,一个微生物细胞在合适的外界环境条件下，不断地吸收营养物质，,其原生质的总量（重量、体积、大小）不断增加，出现了,个体生长,现象。达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，个体发展成一个群体。群体中各个个体的进一步生长，就引起了,群体生长,，可从其重量、体积、密度或浓度来衡量。,所以：,个体生长 个体繁殖 群体生长,群体生长 个体生长 个体繁殖,微生物生长量的测定,（一）稀释平板菌落计数法,是一种最常用的活菌计数法。,（二）血球计数法,特点是测定简便、直接、快速，但测定的对象有一定的局限性，只适合于个体较大的微生物种类，如酵母菌、霉菌的孢子等；测定结果是微生物个体的,总数,。,（三）干重法,适合于丝状微生物的生长量的测定，对于细菌来说，一般在实验室或生产实践中较少使用。,（四）比浊法,二、微生物的生长曲线,（一）微生物的典型生长曲线,把一定微生物接种到一定量的液体培养基中，在一定条件下进行一次性培养，定时取样测定活菌数，以活菌数的对数值为纵坐标，以培养时间为横坐标，可以画出一条有规律的曲线，即微生物的,典型生长曲线,（growth curve）。,一般把典型生长曲线划分为适应期、对数增长期（指数期）、稳定期和衰亡期等四个时期。,只适用于单细胞微生物，包括细菌和酵母菌。,适应期,对数期,稳定期,衰亡期,1 适应期,适应期的出现，是因为在接种到新鲜培养液的细胞中，一时还缺乏分解或催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢物。,特点：,生长繁殖的速度几乎等于零。,细胞形态增大；,细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性。,合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。,对外界不良条件反应敏感。,影响适应期长短的因素,很多，除菌种外，主要有：,1）菌种的菌龄,菌龄即“种子”的群体生长年龄，即处在生长曲线上的哪一个阶段。,2）接种量,接种量的大小明显影响适应期的长短。发酵工业上，采用1/10的接种量。,3）培养基成分,2 对数增长期,又称为指数增长期，在生长曲线中，紧接着适应期的一个细胞以几何级数速度分裂的一段时期。,1）特点：,生长繁殖的速度很快，世代时间均匀一致；,酶系活跃，代谢旺盛；,细胞的形态特征均匀一致，最代表种的特征；,细胞的生化特性均匀一致，并且典型。,这个时期的微生物，是发酵工业生产上的良好种子，也是进行科学研究的好材料。,2）代时（G）的计算：,代时（G）：细胞每分裂一次所需的时间。,细胞数目：1 2 481632x个,即：2,0,2,1,2,2,2,3,2,4,2,5,2,n,繁殖代数：0 1 23 4 5n代,设：在时间t,0,时的细胞数为x,0,，到t时，繁殖代数为n，细胞数为x。,则：x=x,0,2,n,两边取对数：lgx=lg x,0,+nlg2,n=(lgx-lgx,0,)/lg2 n=3.3(lgx-lgx,0,),则：G=(t-t,0,)/n=(t-t,0,)/(3.3(lgx-lgx,0,),3）影响代时长短的因素,：菌种、营养成分、营养物浓度、培养温度。,3 稳定期,稳定期是微生物群体中新繁殖的细胞数目与死亡细胞数目处于平衡稳定的状态，群体的生长速度等于零。,稳定期到来的原因：,营养物尤其是生长限制因子的耗尽；,营养物的比例失调，例如C/N比值不合适等；,酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的累积；,pH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜等等。,特点：细胞开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物；芽孢杆菌开始形成芽孢；开始合成抗生素等次生代谢产物；菌细胞的总数也达到最高峰。,稳定期的微生物总活菌数处于最高，所以此时是发酵生产的最佳“收获季节”（如单细胞蛋白、乳酸）。,4 衰亡期,在衰亡期中，个体死亡的速度超过新生的速度，整个群体就呈现出负生长。,特点：,总活菌数下降；,细胞形态出现不正常，呈多样性；,生理生化出现异常现象，例如会产生很多膨大、不规则的退化形态；,蛋白水解酶活力增强，发生自溶；,产生或释放次生代谢产物如抗生素等，芽孢释放。,此时期生产上最适合收集代谢产物。,（二）微生物的连续培养,连续培养：,连续培养是在研究生长曲线的基础上,当微生物以单批培养的方式培养到指数期的后期时，一方面以一定速度连续流加新鲜培养基，并立即搅拌均匀，另一方面，利用溢流的方式，以同样的流速不断流出培养物。这样，培养物就达到动态平衡，其中的微生物可长期保持在指数期的平衡生长状态和稳定的生长速率上。,三、环境因素对微生物生长的影响,（一）温度,每种微生物都有自己的生长温度三基点：,最低生长温度:,最适生长温度:,最高生长温度:,在生长温度三基点内，微生物都能生长，但生长速率不一样。微生物只有处于最适生长温度时，生长速度才最快，代时最短。一般情况下，每种微生物的生长温度三基点是恒定的，但也常受其它环境条件的影响而发生变化。,最低温度,最适温度,最高温度,嗜热液化芽孢杆菌,37,60,70,嗜热纤维芽孢杆菌,50,60,68,丙酮丁醇梭菌,20,37,47,植物乳杆菌,10,30,40,干酪乳杆菌,10,30,40,大肠杆菌,10,37,47,乳脂链球菌,10,30,37,嗜热链球菌,20,4050,53,枯草杆菌,15,3037,55,黑曲霉,7,3039,47,啤酒酵母,10,28,40,根据微生物最适生长温度的不同，可分为三个类型:,1.嗜低温微生物,：多数在零度条件下能够生长,一般最适生长温度在1015，最高生长温度为20。,2.嗜中温微生物,：最适生长温度一般在2045之间。又可分为两类。,室温型微生物：多数是腐生型微生物,最适生长温度一般为2028；,体温型微生物：最适生长温度与其宿主体温接近，在3745之间，人和温血动物的寄生菌属于此类。,3.嗜高温微生物,：能在45以上生长。存在于温泉、堆肥、土壤中。在发酵工业中，用好热菌作为菌种，可以缩短生产周期，防止杂菌污染。,（二）水分,1水分活性值的概念,Aw,值是指在密闭容器内含有水溶性物质的蒸汽压与相同条件下纯水蒸汽压的比值。以纯水的蒸汽压为,P,0,，水溶性物质的蒸汽压为P，则,Aw=P/P,0,。,不含任何固形物成分的纯水的,P=P,0,，即,Aw,=1；绝对不含水分的物品的,P,=0，即,Aw,=0，因此,Aw,值最大为1，最小为0。所以,Aw,值在0与1之间。,一些微生物主要类群的最低水分活度(Aw),微生物,最低,Aw,值,微生物,最低,Aw,值,一般细菌,090,嗜盐细菌,075,一般酵母菌,088,干性霉菌,065,一般霉菌,080,耐渗透压酵母菌,060,（三）氧气,1专性好氧微生物：其生长必需氧，正常情况下进行有氧呼吸，但高浓度氧有毒。绝大多数丝状真菌、放线菌和部分细菌属于这个类型。,2兼性需氧微生物：有氧情况下进行有氧呼吸，无氧情况下进行无氧呼吸。绝大多数酵母菌和部分细菌属于这种类型。,3微量需氧微生物：在较低氧气分压下才能正常生长。只有少数细菌属于此类型，如霍乱弧菌。,4耐氧性厌氧微生物：不需要氧，但可耐受氧，并在氧存在下仍可生长。主要是一些乳酸菌和粪链球菌。,5厌氧微生物：不需要氧，有氧即被杀死或被抑制。如梭状芽孢杆菌属、产甲烷杆菌属、双歧杆菌属等。,（四）pH,pH对微生物生长的影响，主要表现在：,（1）影响营养物质的可给态和有毒物质的毒性；,（2）影响菌体细胞膜的带电荷性质、膜的稳定性及膜对物质的吸收能力；,（3）菌体表面蛋白变性或水解。,大多数细菌、放线菌在中性偏碱性的环境中生长，细菌的最适pH7.07.6，放线菌的最适pH7.58.5；酵母菌、霉菌在中性便酸性的环境中生长，霉菌的最适pH4.05.8，酵母菌的最适pH3.86.0。,但对每种具体的微生物，有其自己生长的三基点：最低pH、最适pH、最高pH。根据微生物对pH的要求不同，可将微生物分为：,1、嗜酸性微生物：在pH5.4以下生长；,2、嗜中性微生物：在pH5.48.5生长；,3、嗜碱性微生物：在pH7.011.5生长。,微生物在生命活动过程中，会改变培养基或外界的pH。培养过程中pH发生变化的可能原因：,1、糖类经过微生物的发酵或氧化，产酸，使pH下降；,2、脂类水解，产生有机酸，使pH下降；,3、蛋白质脱羧，产生胺类，使pH升高；,4、（NH4）2SO4中的NH4+被选择性吸收，产生H2SO4，pH下降；,5、NaNO3中的NO3-被选择性吸收，产生NaOH，pH升高。,一般，微生物在培养过程中会使培养基变酸，为了避免pH大幅度改变，在配制培养基时，采取如下措施：（1）加入磷酸盐缓冲剂（KH2PO4、K2HPO4）；（2）产生大量酸时，加入不溶性的CaCO3。,（五）渗透压,微生物最适合在等渗溶液中生长；在低渗溶液中，微生物会产生水溶现象，细胞吸水、膨胀、破裂而死亡；在高渗溶液中，微生物发生质壁分离现象，细胞内的水分渗透到细胞外，造成细胞质与细胞壁分离。,微生物根据耐盐性（NaCl），可分为四类：非嗜盐微生物、海洋微生物、中等嗜盐微生物、极端嗜盐微生物。,利用微生物不能耐高渗透压的原理，生产上常利用高浓度的糖或盐来保存食品，如腌渍咸鱼或咸肉(用5%30%食盐)，糖渍果脯或蜜饯（70%80%）。,（六）辐射,绝大多数微生物厌光，只有少数需光。,在各种波长的电磁波中，紫外线、X射线、射线和宇宙,线对生物体有害。,紫外线,波长200,300nm的紫外光杀菌作用最强。其杀菌作用是因为它可以被蛋白质（约280nm）和核酸（260nm）吸收，使这些分子变性失活。如核酸中的胸腺嘧啶吸收紫外光后形成二聚体，导致DNA合成和转录过程中遗传密码阅读错误，引起致死突变。,紫外线对物质的穿透力很差，不易透过玻璃、衣物、纸张、或大多数其他物体，只适于空气及物体表面的消毒。,X射线、射线和宇宙线,x射线、射线与宇宙线为电离辐射，其能量足以使分子电离，产生极不稳定的游离基，这些离子与O2结合产生强氧化性的物质，使细胞内蛋白质和酶发生变化，引起细胞损伤或死亡。,主要用于其他消毒方法所不能解决的塑料制品、医疗设备、药品和食品的灭菌。射线其穿透力强，对各种生物都有强烈的致死作用，杀菌效果很好。,可见光辐射,波长400,700nm的强可见光具有杀菌作用。能氧化细菌细胞内的光敏感因子，如核黄素和卟啉环。,（七）氧化还原电位（Eh）,需氧微生物在Eh+0.1V可生长，在+0.3,0.4V合适；,厌氧微生物在Eh+0.1V才可生长，兼性厌氧微生物的要求较广泛。,实践生产上，以通入空气或加入氧化剂提高Eh，加入谷胱甘肽等还原性物质降低Eh。,（八）化学药物,重金属盐类：如汞、铜盐；,氧化剂：如H2O2、次氯酸钙；,有机化合物：如酚、醇、醛等；,表面活性剂：如新洁而灭；,卤族元素及其化合物：如碘、氯化物；,染料：如结晶紫；,毒性物质：如KCN、CO等；,无机酸、碱：如HCl、石灰水等,四、微生物生长繁殖的控制,（一）基本概念,1、灭菌：,采用强烈的理化因素，使物体表面和内部的微生物全部杀死（包括芽孢、孢子和营养体全杀死）。经过灭菌以后的物品不存在具有生命力的微生物。,2、消毒：,采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面和内部对人体有害的病原菌。如对皮肤、水果、饮用水进行药剂消毒的方法；对啤酒、果汁、牛奶、酱油进行巴氏消毒。,3、防腐：,采用某种理化因素或生物因素，抑制物体上微生物的生长繁殖。只是一种抑菌作用，一般用来保藏食物。如用盐腌制鱼、肉，防止腐烂变质。,4、无菌：,没有活的微生物存在。只有彻底灭菌，才能达到无菌要求。,5、商业无菌：,某些食品经过适度杀菌后，不含有致病微生物，也不含有在通常温度下能在其中繁殖的非致病微生物。,（二）物理因素的控制,1、温度,一般，高温灭菌，低温抑菌。,（1）高温灭菌的方法,在食品工业上，最耐热的微生物是芽孢杆菌属和梭状芽,孢杆菌属，其次是非芽孢的链球菌属和乳杆菌属。,干热灭菌法,a、烘箱热空气法,利用热空气进行灭菌，160加热1h。,适用于金属和玻璃器皿的灭菌。,b、火焰灼烧法,利用火焰直接把微生物烧死。适用于接种针、环、试管口等经灼烧不会损坏的物品，医院焚烧污染物和实验动物尸体也用此法。,湿热灭菌法,利用热蒸汽灭菌。,在同样温度下，效果比干热灭菌好，因为细胞内蛋白质,含水量高，容易变性；蒸汽穿透能力更强；蒸汽潜热,大，可迅速提高温度。,a、巴氏消毒法,温和加热，既降低了微生物群体的数量，又保持了食品的营养与风味。62.9处理30min，或71.6快速处理15s。适合牛奶、酱油、啤酒、果酒的消毒。,b、煮沸消毒法,将要消毒的物品放入清水中，煮沸15min，杀死细菌的全部营养体和部分芽孢。若延长消毒时间，或在水中加入1%碳酸钠或2%石炭酸，效果更好。适用于注射器、解剖用具、家庭餐具的消毒。,c、间歇灭菌法,将待灭菌物品加热至100，1530min，杀死营养体，冷却后37或室温过夜，让残留的芽孢萌发成营养体，第二天再重复，3次左右即可彻底灭菌。适用于农村推广。,d、高压蒸汽灭菌法,将物品放入高压蒸汽锅内，大量蒸汽使其中压力上升，水的沸点也升高。在压力1kg/cm2或0.103MPa 时，水蒸汽温度达121，处理1520min，可杀死所有的微生物（包括芽孢）。适合一般培养基、生理盐水等溶液、工作服、实验器材等。,e、高温瞬时连续灭菌法（连消法）,135140处理515s。如发酵工厂培养基的灭菌。,灭菌对培养基成分的影响,a、pH下降；,b、产生混浊或沉淀；,c、颜色加深；,d、体积和浓度有所变化；,e、营养成分有时受到破坏。,（2）低温的抑制,一般的低温仅使微生物的生长受到抑制，但不能杀死微,生物。温度再进一步降低，降至冰点以下时，微生物细,胞内水分逐渐变成冰晶而脱水，原生质逐渐浓缩，冰晶,对细胞有损伤，导致微生物死亡。,2、辐射,接种室、手术室、食品、药物包装室常用紫外线杀菌；射线可用来食品表面杀菌，射线用来食品内部杀菌。,3、过滤作用,适用于对热敏感液体的灭菌以及气体的灭菌。如含有酶或维生素的溶液、血清。口罩、试管棉塞都是滤器，起供氧除菌的作用。自来水通过砂滤器除去微生物。,（三）化学因素的控制,消毒剂和防腐剂,（1）消毒防腐剂的作用原理：,a、使微生物蛋白质变性或凝固，发生沉淀。如重金属离子能与菌体蛋白质结合，使蛋白质变性；酒精能与菌体蛋白质或氨基酸结合，发生脱水而凝固。,b、破坏菌体的酶系统，影响菌体的代谢。如高锰酸钾、过氧化氢可与酶蛋白中的硫氢基（-SH）结合，使酶失去活性，导致代谢机能发生障碍而死亡。,c、降低菌体表面张力，增加细胞膜的通透性，使细胞破裂或溶解。如低浓度的来苏尔等酚类化合物，能破坏细胞膜。,（2）食品中常用的防腐剂有,：,a、山梨酸及山梨酸钾。,常用于糕点、干果、果酱、果汁、饮料中，最大使用量为0.2克至1克/公斤，常用浓度0.1%。,b、丙酸钙及丙酸钠。,它防止霉菌较为有效，而对酵母的活性影响最小，故多用于面包等用酵母发酵的食品中，一般用量为2克/公斤。,c、苯甲酸。,用于果酱、果汁、汽水饮料中。对各种细菌均有效果，是酸型防腐剂，pH2.54.0时，效果最好，中性时无效。最大使用量为0.2至l克/公斤，常用浓度0.1%。,（3）常用的消毒剂有：,漂白粉（学名次氯酸钙）、漂白液（学名次氯酸钠）、双氧水（常用浓度0.3%）。,2、抗代谢物,在结构上与生物体内的代谢物相类似，能与特定的酶结合，阻碍酶的正常功能，干扰代谢进行，这类物质称抗代谢物。在生物体内，它能与正常代谢物发生竞争，与相应的酶发生结合。,3、抗生素,抗生素是一类主要由微生物合成的化学治疗剂。其抗菌作用表现在：,抑制细胞壁的合成，例如青霉素抑制细菌肽聚糖的合成；,影响细胞膜功能，例如制霉菌素能与真菌细胞膜的麦角醇起作用，使膜失去功能；,阻止蛋白质合成，例如四环素，庆大霉素与细菌体内的核蛋白体结合；,干扰核酸的合成，例如争光霉素抑制DNA的合成。,第六节 微生物的退化、复壮和保藏,一、微生物的变异现象,1、形态发生变异,2、代谢发生变异 如营养缺陷型菌株,3、结构发生变异,4、毒性发生变异,5、抗药性发生变异,6、抗原性发生变异,二、菌种的退化与复壮,（一）菌种退化的现象,1、菌落和细胞形态改变,有的菌落大小或颜色常发生改变。如有的放线菌和霉菌在斜面上多次传代以后，产生“光凸”型，出现生长不齐或不产生孢子的退化。,2、生产性能的下降,发酵能力下降，代谢产物减少。如黑曲霉的糖化力降低，抗生素产量的下降。,3、对生产环境的适应能力减弱,如抗噬菌体菌株变为敏感菌株，原来能利用某种物质的能力降低。,（二）菌种退化的原因,1、主要原因是有关基因的自发突变。DNA快速复制导致基因发生差错，繁殖代数越多，突变率越高。,2、环境条件的改变。如营养条件（培养基成分和传代次数），环境温度（温度高，突变率高）。,（三）防止菌种退化的措施,1、减少传代次数,2、选择合适的培养基和培养条件,3、利用孢子接种,4、采用好的保藏方法,(四)菌种的复壮,1、分离纯化。,2、接种到相应的昆虫、动植物体内恢复其毒力。,3、高剂量紫外线或低剂量化学诱变剂联合处理，或低温处理。,三、菌种的保藏,（一）菌种保藏的原理,根据菌种的生理、生化特点，挑选优良纯种，最好是采用它们的休眠体（如分生孢子、芽孢等），人为地创造低温、干燥、缺氧、缺乏营养等条件，使菌种的代谢活动和生长繁殖处于受抑制的休眠状态。,（二）菌种保藏的常用方法,1、斜面冰箱保藏法,4左右的冰箱中进行保藏。,原理：低温；适宜菌种:所有微生物；保藏期:16个月。,2、半固体穿刺保藏法,4左右的冰箱中进行保藏。,原理：低温；适宜菌种：细菌、酵母菌；保藏期：612个月。,3、石蜡油封存法,原理：低温、缺氧；适宜菌种：各类微生物；保藏期：12年。,4、砂土管保藏法,原理：干燥、营养缺乏；适宜菌种：芽孢、孢子；保藏期：110年。,5、真空冷冻干燥保藏法,原理：低温、干燥、缺氧；适宜菌种：各类微生物；保藏期：515年。,补充：微生物的分离纯化和纯培养,（一）微生物的分离纯化,自然界中各种微生物常混杂在一起生存，生产上为了得到所需微生物的纯种，必须进行纯种分离，常用的纯种分离方法有：,1、平板划线分离法,是最常用的分离纯化方法。将熔化的琼脂培养基倒入无菌平皿中，冷凝成平板。用接种环挑取少量菌种在平板表面作多次划线、稀释，最后可得到纯种的单菌落。,2、稀释涂布分离法,液体样品经过适当的稀释，吸取0.2-1ml菌液至平板上，用涂布棒均匀涂布，可得到许多单菌落。,3、组织分离法,主要用于食用菌菌种的分离，以食用菌的子实体等作为材料进行分离的方法。分离时，先用10%漂白粉水或75%酒精对子实体进行表面消毒，并用无菌水洗涤多次，无菌操作取一小块组织，移植于固体培养基表面进行培养，数天后可看到从组织块周围长出菌丝，并向外扩展。,（二）纯培养,只有一种微生物生长的培养物称为纯培养物。分离培养后，在平板上出现很多单个菌落，通过鉴定，将分离纯化的目的菌种转接到试管斜面上，培养扩大的培养方法，称为纯培养。,