共聚焦课件2010.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,近年来,激光共聚焦显微镜在医学和生物学研究方面的应用越来越广泛，它成像清晰、精确、客观，大有淘汰普通光学显微镜和荧光显微镜的趋势。因此，作为医学工作者，了解和应用这种仪器亦是大势所趋。,显微镜成像清晰度的决定因素:,1.分辨率2.球差3.色差,1、分辨率：,指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,通常是用显微镜所能分辨清楚最近的相邻两点间的距离来表示。,人眼及各类显微镜的分辨率,人眼分辨率：0.20 mm,光学显微镜分辨率：0.,25 m,m,共焦显微镜分辨率：0.18,m,m,电子显微镜分辨率：0.20 nm,2、球差：,是由于透镜不能把近轴光线和远轴光线在光轴上共聚焦，以至透过标本一点的光线，在通过透镜时不能聚焦成一点,而是形成一个光斑,从而使成像模糊不清。,3、,色差：,是由于显微镜透镜类似于三棱镜,对不同颜色的光线具有不同的折射率。所以光线透过透镜后,不同色的光聚焦在不同点上,从而使成像模糊,而且像的边缘尚带有色晕。,在显微镜基础上配置,激光光源,，,扫描,装置，,共扼聚焦,装置和,检测系统,而形成的新型显微镜。,利用共聚焦光路和激光扫描获得生物样品的显微断层图象，,动态扫描记录,、,图像处理及三维立体构建,、,成份分析,等软件。,原理简介,硬件：,激光源 共聚焦显微镜 步近器 检测器 光电倍增管 计算机 图象输出设备（显示器 彩色打印机）。,软件：,显微镜自动控制和扫描系统、图像处理和分析系统,共聚焦扫描显微镜的系统组成,激光共聚焦显微镜构成,激光器,光电倍增管,检测器,显微镜,步近器,计算机,电子图像,软件,共聚焦显微镜的特点,光源,共聚焦技术,点扫描技术,信号放大 电子图像,软件,1、光源,用激光做光源，从理论上消除了色差。因为激光的单色性强、光源波束集中、波长相同。,2、采用了共扼聚焦技术,在物镜的焦平面上放置了一个小孔，将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差。,共扼聚焦原理图,激光器,扩光器,样品,滤光片,针孔,检测器,入射光,发射光,长通滤光片,入射光,发射光,长通滤光片,激光器,扩光器,样品,滤光片,针孔,检测器,入射光,发射光,长通滤光片,激光器,扩光器,样品,滤光片,针孔,检测器,普通光学显微镜与激光共聚焦显微镜的区别,3、点与面扫描技术,共聚焦显微镜：将样品分解成二维或三维空间上的无数点，用十分细小的激光束（点光源）逐点逐行扫瞄、成像，通过计算机软件组合，最后得到一个整体平面的或立体的像。普通光镜：是在可见光源下一次性成像。,Z,通过精细平面光切，形成生物样品不同平面的精细图象，将一个连续的光切图象Z轴重叠就可形成一个完整的三维图象,4、图像信号及处理：,光电倍增管放大信号，计算机采集和处理光信号。计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像，得到的图象是数字化的，可以在电脑中进行处理，再一次提高图象的清晰度。,共聚焦显微镜的应用,高清晰成像,半定量荧光强度分析,荧光探针表达量测定,分层扫描,多种荧光标记同时检测,荧光标记物绝对定量分析,扩展应用,高清晰成像,激光共聚焦显微镜因使用共扼光路使非焦平面的光线被抑制，减少了成像的干扰，以及使用光色较纯的激光，所以成像分辨率可达普通光学显微镜的1.4倍。,可以清晰的表现某些细微结构。,牛肺动脉内皮细胞,，,微管,高清晰成像,牛肺动脉内皮细胞，,微管,高清晰成像,鼠成纤维细胞,单克隆anti,-tubulin,标记,高清晰成像,检测人类癌细胞表皮生长因子,高清晰成像,涡虫纲扁虫肌动蛋白丝,鬼笔环肽,高清晰成像,培养的293细胞绿色荧光蛋白,高清晰成像,培养的人肝癌细胞哑叮橙染色,高清晰成像,透射光扫描（DIC）,利用激光透射扫描成像，用特殊滤光片达到相差显微镜的效果，可获得清晰的具有立体感的图片,树突状细胞,培养细胞,半定量荧光强度分析,荧光信号通过光电倍增管转化为电信号，经过电脑分析可对荧光信号进行相对定量测定。,细胞中特异性荧光标记的蛋白在不同药物环境和不同培养时间条件下的表达差异。,荧光探针的特异性标记：即荧光强度与特异性标记蛋白的表达量成正相关。,随机选择细胞或区域，测定其荧光强度值，并进行统计分析。,半定量荧光强度分析,随机圈取细胞,可得到所圈细胞的相对荧光强度值,半定量荧光强度分析,获得数据的TXT文件,将TXT文件导入EXCEL进行统计分析,荧光表达量测定,利用荧光与透射光同时扫描，观测相等面积内不同组间荧光标记蛋白表达的差异。,荧光表达量测定,分层扫描（切片扫描）,按,共扼聚焦,的原理，通过调节针孔的大小，可控制样品扫描层面的厚度。即样品中相当薄的一层被探测到，而其他层面不影响成像。,分层扫描（切片扫描）,当观测较厚样品时，普通透射光不能透过样品，则可以通过切片扫描检测荧光的方法来观测。,入射光,被检测层面,整个样品,白光（不能透过）,发射光,分层扫描（切片扫描）,较厚层面 较薄层面,人血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。,分层扫描（切片扫描）,较厚层面,（平滑肌损伤可见）,较薄层面,兔动脉血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。,分层扫描（切片扫描）,连续分层扫描，可得到CT片类似的效果，对样品Z轴的结构进行分析。经计算机数据重组，可观测空间结构，空间定位，三维重组。,利用专用图象处理软件，还可以实现其他许多数据分析。,293细胞GFP的表达,细胞“CT”片,细胞测量,荧光强度分析,空间定位,Z轴分析,3D模拟,三维重建,植物切片三维重建,动态观测,激光共聚焦显微镜的一大特点就是可以对活细胞进行连续扫描，实现实时动态观测。这样可记录细胞在外界某种条件的刺激下瞬时发生的变化。,常用的有检测细胞内游离Ca 离子变化、细胞内PH值变化，等等。,Ca离子动态检测,荧光染料：Fluo-3AM。,此染料可特异性标记细胞内游离Ca离子，胞外不标记。,Ca离子动态检测,加药,峰值,所选细胞,Ca离子动态检测,胞浆,胞核,胞浆胞核同时测量,多色荧光标记检测,普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光，要观测多种荧光标记的样品需要多次观测，对样品损伤大。激光共聚焦显微镜可以多激光多通道同时扫描，多通道同时探测。,绿色：SYBR 14染色，活精子,红色：PI染色，死精子,牛精子,绿色：MitoTracker Green,紫色：Hoechst 33342,Mouse 3T3 cells,红色：ethidium homodimer1，染核,绿色：BODIPY FL phallacidin，染肌丝蛋白,牛肺动脉内皮细胞,蓝色：Hoechst 33342,染DNA,红色：PI，染核仁RNA,绿色：Alexa Fluor 488,染肌丝蛋白,藤黄微球菌,绿色：活菌,红色：死菌,染色：LIVE/DEAD,Bac,Light Bacterial Viability Kit,猴胚肾细胞内弓形虫繁殖,吖叮橙染色,绿色为DNA,红色为RNA,激光共聚焦显微镜的,优势,在结构方面,激光做光源，光色纯，波长固定，成像效果好，分辨率高，图象清晰，荧光检测信噪比高,可实现分层扫描,可实现连续扫描，可动态记录变化,可多根激光管同时扫描，多色荧光同时成像,扫描速度快，对样品损伤小,在应用方面,形态观察,-,高清晰成像,半定量,-,荧光强度分析,荧光探针表达量测定,定位研究,-,分层扫描,多种荧光标记同时检测,荧光标记物绝对定量分析,扩展应用,-,如，,FRAP,法、细胞切割、细胞筛选等,激光共聚焦显微镜的优势,在效果方面,更灵敏：,共聚焦显微镜采用了光电倍增技术，可将很微弱的荧光信号放大。只要有信号就能被检测到。,定位更精确：,不仅可以定位到细胞水平，还可以定位到亚细胞水平、和分子水平。这也是荧光标记的抗体被称为分子探针的原因。,显微镜,扫,激光共聚焦显微镜的,优势,定量测量：,静态的定量测量,对于不同组的样品，可以单纯比较一种成分，也可以同时比较两种甚至三种成分。也可以在同一张切片上比较不同成分含量。,动态的定量测量,共聚焦显微镜还能对活细胞内的特定成分（如：钙、钠、氢等）进行动态变化测量，并给出动态变化曲线；还可以同时测量几种成分，并给出含量比值。,激光共聚焦显微镜的,优势,在效果方面,快速性：,由于利用光源光束点扫描，检测过程快，时间短，计算机精确控制激发光强度，光漂白和荧光淬灭作用很小。,数据图像可及时输出或长期储存：,用计算机代替了普通的照相机，得到的图像是数字化的，不存在暴光方面及胶卷冲洗方面的问题（如荧光太弱，无法暴光；或曝光过程中荧光淬灭等）；而且图像可进一步加工处理。,激光共聚焦显微镜的,优势,在效果方面,制样简单,石蜡切片，冰冻切片，涂片，印片、铺片，培养的粘附细胞，悬浮细胞，,各种染色，非染色荧光标记的组织（包括活组织）,注：用于共聚焦显微镜观察的切片厚度不宜太薄（4050um)，最厚可达500um。,（一）细胞生物学：细胞结构：细胞骨架，细胞膜结构、流动性、受体，细胞器结构和分布变化，细胞凋亡、细胞周期等。（二）生物化学：酶、核酸、荧光原位杂交、受体分析。,共聚焦显微镜的应用领域,应用领域,（三）药理学：药物对细胞的作用及其动力学分析。（四）生理学：膜受体，离子通道，细胞内离子含量、分布及其动态分析,。,（,五）遗传学和胚胎学：细胞生长、分化，细胞组织的三维结构，染色体分析，基因表达，基因诊断 （六）神经生物学：神经组织、细胞结构，神经递质的成分、运输和传递，递质受体，离子内外流。,应用领域,（七）微生物学和寄生虫学：细菌、寄生虫形态结构（表面和内部结构）；（八）病理学研究及病理学临床诊断：活检标本的快速诊断，肿瘤诊断，自身免疫性疾病的诊断，宫颈上皮细胞涂片诊断,应用领域,荧光漂白恢复实验（FRAP）,常用荧光探针介绍,细胞活性探针,细胞器探针,细胞骨架探针,核酸探针,细胞内离子探针,细胞活性探针,活细胞探针：吖叮橙（AO）,是一种离子泵活性指示剂，弱碱性，在动物细胞溶酶体、植物液泡和含胰岛素的分泌小粒等酸性细胞器中浓集。,死细胞探针：碘化丙锭（PI）,膜不透性DNA探针，细胞膜破损后与DNA结合,细胞器探针,线粒体探针：罗丹明,123,（,Rhodamine123,）,，,能渗入细胞，带阳离子的荧光探针，不染色内质网。,溶酶体探针：中性红（,Neutral Red,）,内质网探针：,DiOC,6,（,3,）,属于短链碳酸花青苷染料。可标记活细胞内质网，也可用于甲醛固定的细胞内质网。（,但现在尚无一种理想的内质网特异性探针，因此类燃料内内质网和其他细胞器同样着色，必要时可用内质网特异蛋白抗体。）,细胞骨架探针,F-肌动蛋白荧光探针：,鬼笔环肽：特异性地与F-肌动蛋白荧光探针结合，纳摩尔浓度下也可标记,核酸探针,1.吖叮橙（AO）,与DNA结合，发射波长525nm，显绿色与RNA结合，发射波长650nm，显红色,2.Hoechst：,与DNA结合，分辨率高,3.DAPI：,与双链DNA结合荧光增强20倍，与单链DNA结合无荧光增强。荧光强度比Hoechst低，光稳定性强于Hoechst。,细胞内离子探针,钙离子探针：,Fluo-3，游离态无荧光，与钙结合后荧光增强50-100倍，钙荧光探针中变化最大,胞内pH值探针,BCECF,SNAFL类,SNARF类,其他离子探针,钠离子探针：SBFI,钾离子探针：PBFL-2,镁离子探针：mag-fura-2,荧光素衍生物,常用荧光探针的染色方法,1PI(Propidium Iodide）,DNA,2AO(Acridine Orange）,DNA,RNA双染,3DiBAC4(3),膜电位,4NBD-C6-HPC,膜磷脂的流动性,5Rhodamine l23,线粒体跨膜电位,6Flou-3-AM,细胞内游离钙离子浓度,7H2DCF(2,7-Dichlorofluorescin Diacetate）,自由基,8Snafl calcein-AM,细胞内pH,9CFDA-AM,细胞间通讯,10FITC,细胞总蛋白,PI(Propidium Iodide)染色,中文名称；碘化丙啶,目的：,显示细胞内DNA、RNA；不能对活细胞进行染色，可用于检测细胞死活,。,EX/EM(最大吸收峰波长/发射峰波长，nm)：536/617,染液的配制：用Hanks液(不含酚红)将PI溶解成50ug/ml，lml/支分装，4条件下保存。染色前用Hanks液将其稀释为5ug/ml。,染色步骤：,样品用PBS(或Hanks、D-Hanks等)漂洗3次,在75乙醇中浸泡10分钟,PBS漂洗3次,在PI(浓度为5ug/ml)染色15-30分钟,(把PI储备液50ug/ml稀释成浓度5ug/ml),缓冲液漂洗3次,加入PBS 0.5ml,上机测量,注意：如需只显示DNA，不显示RNA，则用RNA酶消化掉RNA。,AO(Acridine Orange)染色,中文名称：丫啶橙,目的：,DNA、RNA双重染色,EX/EM：DNA-502/506，RNA-460/650,染液的配制：,A液：Triton X-100 0.1%,HCl 008mol/L,NaCl 0.15mol/L,A液可在4冰箱中保存2周,B液：AO 6ug/ml,EDTA-Na 10-3mol/L,枸掾酸缓冲液(含NaHPO4 0.2mol/L，枸掾酸0.1mol/L)调至pH6.0。,配制：将0.2mol/L NaHPO4 63ml加入0.1mol/L枸掾酸37ml混合,然后加入NaCl、EDTA-Na和AO。,注：不含AO的B液可在冰箱中保存数月，加入AO之后，应在24h内使用，不能保存日期过长。,染色步骤：培养细胞,用PBS缓冲液漂洗2次,加入A液0.4ml 静置0.5分钟,随后加入B液1.6ml静置10分钟,上机测试,DiBAC4(3)染色,英文全称：bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)trimethine oxonol,目的：,测细胞跨膜电位,(慢反应荧光调整),EX/EM：细胞外液中的DiBAC4(3)无荧光，进入细胞后最大吸收峰和放射峰波长493/516。,染液的配制：将DiBAC4(3)溶于乙醇配制成1mg/ml，25ul/支分装，-20保存。染色前用缓冲液稀释成1-5uM(每支可配成浓度为5uM的染液10ml)。,染色步骤：,培养细胞,缓冲液洗2次(不含血清),0.2-0.5ml(1-5uM)DiBAC4(3)37避光孵育20分钟,保留染色液,上机测量,注意:1)刺激物需用含相同浓度的DiBAC4(3)染液配制。,2)测量时保留染色液，使细胞内外染料处于动态平衡,NBD-C6-HPC染色,英文全名：2-(6-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)dodecanoyl-1-hexadecanoyl sn-glycero-3-phosphocholine,目的：,测细胞膜磷脂的流动性,EX/EM：466/531,染液的配制：将一支NBD-C6-HPC 5mg溶于1m1无水乙醇，配制成5000ug/ml，10ul/支分装染色时用Dulbeccos PBS将其稀释为1-10ug/ml(如为10ug/m1,则稀释为5ml)。,染色步骤：,培养细胞,Dulbeccos PBS漂洗2次(或Hsaks液),1-10 ug/ml NBD-C6-HPC 4下静置20分钟,Dulbeccos PBS漂洗3次,加0.5ml Dulbeccos PBS,上机测试,Rhodamine l23染色,中文名称：若丹明123,目的：,测细胞内线粒体的跨膜电位,EK/EM：505/534,染液的配制：Rhodamine 123粉剂,用甲醇配制成1mg/ml的储备液,100ul/支分装，存放于-20冰箱中。染色时取一支，用Dulbeccos PBS稀释成5ug/ml,染色步骤：,培养细胞,Dulbeccos PBS漂洗2次(缓冲液预热至室温或37)。,Rhodamine l23(5ug/ml)37孵育1小时,Dulbecoos PBS漂洗3次,加入0.5ml Dulbeccos PBS,上机测试,Fluo-3-AM染色,目的：,测细胞内游离钙离子浓度,EX/EM：探针在细胞外无荧光，进入细胞后最大激发波长和发射波长为464/526。,方法一：,染料的配制：Fluo-3-AM 50,u,g溶于45ul DMSO(浓度lmM)，15ul/支分装，冻存。染色时用1550mM HEPES缓冲液将Fluo-3-AM稀释成1-20uM(如1.5ml为10uM)。,染色步骤：,培养细胞,缓冲液漂洗2次,1020ml Fluo-3-AM(20uM)，37(或室温)避光孵育30-60分钟,缓冲液漂洗3次,加入0.5ml缓冲液，上机测量,H,2,DCF染色,英文全称：2,7-dichlorofluorescin diacetate,目的：,测自由基(LPO),EX/EM：504/529,染液的配制：用DMSO将H2DCF配成lmM的溶液，50ul/支分装，冻存。染色前用PBS(含葡萄糖的PBS)稀释至5ul/ml。,染色步骤：,培养细胞,在0.5ml H2DCF染色液(5ul/ml)37(或室温)孵育30-60分钟,PBS漂洗5次,加入0.5ml PBS，上机测量,SNAFL-calcein-AM染色,目的：,测细胞内pH值,EX/EM：506/535，适用于比率法定量测量。,溶液的配制：将SNAFL-calcein-AM溶于DMSO中，配成1mmol/l的储备液，分装冻存于-20或以下环境中。染色前用不含血清和酚红的培养基(如RPMl 1640)或缓冲液将其稀释至510uM。,染色步骤：,培养细胞,RPMI l640漂洗3次,滴入5-l0uM的Snafl calcein-AM将细胞覆盖即可，置室温孵育30分钟,RPMI 1640漂洗3次,加入0.5ml RPMI l640，上机测量,CFDA-AM染色,英文全称：5-carboxyfluorescein diacetate-aeetoxymethyl ester,目的：,测细胞间通讯,EX/EM：500/520nm,溶液配制：将CFDA-AM溶于DMSO成浓度为l0mg/ml储备液，l0ul/支分装，冻存于-20或以下温度。染色时用Hanks液将其稀释成10-50ug/ml。,染色步骤：,培养细胞,Hanks液漂洗3次,10200ul染液(1020ug/m1)避光室温孵育15-30分钟,Hanks液漂洗3次,加0.5ml Hanks液,上机测量,FITC染色,中文名称：异硫氰酸荧光素,目的：,测细胞总蛋白,EX/EM：最大吸收峰495nm。最大发射峰525mn,溶液的配制：用无水乙醇将FITC配成浓度为1mg/l的储备液，使用前用PBS将其稀释至0.05ug/L。,染色步骤：培养细胞,PBS漂洗3次,75酒精固定1520分钟,PBS漂洗3次,0.05ug/ml FITC室温下染色2030分钟,PBS漂洗3次,1）凋亡观察、鉴别细胞的死活,2）细胞内Ca、H、Na、K、Mg、Ni等离子的定性、定量及实时动态分析,3）细胞骨架,4）细胞器定位、定量,5）细胞膜电位,6）细胞间通讯,7）细胞膜流动性,8）自由基分析,9）DNA、RNA含量分析,我室较为成熟的技术,医学领域中的应用进展,耳鼻喉科学,毛细胞形态观察、离子变化及定量分析,嗅细胞离子变化及定量分析,神经科学,离子通道及定量分析,细胞骨架,核膜结构,跨膜大份子迁移率,细胞间通讯,肿瘤研究,DNA RNA 蛋白定量分析,离子定量分析,细胞间通讯,抗肿瘤药物的细胞内分布及药物动力学过程,肿瘤受体的分布与定位,呼吸系统,支气管哮喘细胞受体变化,炎性介质、细胞因子、细胞内离子变化,肺泡及其上皮损伤后的形态变化,肺泡表面活性物质测量,肺泡及肺泡管微解剖图象观察,内分泌领域研究,分泌物的胞内定性、定量、定位,离子定量分析,细胞间通讯,细胞形态研究,血液病学研究,离子定量分析,细胞凋亡形态研究,药物的细胞内分布及药物动力学过程,光照瞬间细胞的细微变化（光敏剂应用）,眼科研究,晶状体、角膜、视网膜形态结构观察,青光眼小梁网结构变化,细胞间缝隙连接,离子分析,骨科领域的研究,移植部位新生骨形成,成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞生理病理研究,骨肿瘤研究,周围神经研究,肌腱研究,内置材料研究,肾病研究,肾单位三位重建观察,多种生物活性物质对LLC-PK1细胞Ca的影响,肾小管间质成纤维细胞胞间通讯,消化领域研究,肝细胞线粒体、离子研究,肝细胞胞间通讯,肝细胞凋亡,胃癌,Bravo,LSM!,再见,