微生物菌种的筛选、诱变与保存技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,微生物菌种的保藏、筛选及诱变技术,实验,4-1,降解苯酚微生物的选育,实验,4-2,紫外线诱变育种,实验,4-3,微生物菌种的保藏方法,实验,4-4,苏云金杆菌的虫体复壮,实验,4-1,降解苯酚微生物的选育,一、实验目的,1.,学习从含酚工业污水、活性污泥中筛选苯酚降解菌。,2.,学习通过活性污泥驯化分离耐酚菌。,二、实验原理,酚类化合物是化工、造纸、钢铁等工业废水的主要有害成分，含酚污水的排放，污染水源、毒死鱼虾、危害庄稼、严重危害人类健康，是各国研究关注的污染物之一。,含酚废水中分离出的生物降解酚能力强的菌为：假单胞菌、白乳杆菌、假丝酵母和野丝膜菌等。含酚废水生物处理目前主要采用活性污泥法。,实验,4-1,降解苯酚微生物的选育,三、实验材料,1.,菌源 含酚工业废水或含酚废水曝气池中的活性污泥。,2.,培养基 耐酚真菌培养基,(,固体、液体和斜面,),，耐酚细菌培养基,(,固体、液体和斜面,),，碳源对照培养液,a,，苯酚培养液,b,，见附录,。,3.,试剂,2%4-,氨基安替比林溶液，,8%,铁氰化钾溶液，氯仿，氨性氯化铵缓冲液，溴酸钾,-,溴化钾溶液，硫代硫酸钠溶液,1%,淀粉溶液，（见附录,）。,4.,其他 稀释分离所用的无菌水，无菌培养皿，无菌移液管，测定酚所用的移液管，容量瓶，试剂瓶，酸式滴定管等。,实验,4-1,降解苯酚微生物的选育,图,4-1,梯度平板,实验,4-1,降解苯酚微生物的选育,涂布法分离：将采集的样品按涂布法分离，,30,培养,2,天后，平板上生长的菌落也形成密度梯度，苯酚低浓度区形成菌苔，苯酚高浓度区出现稀少菌落，将此菌落在含耐酚细菌或真菌培养基平板上连续划线分离，最后挑取单菌落接种到耐酚斜面培养基上，,30,培养,2,天。,实验,4-1,降解苯酚微生物的选育,3.,耐酚菌驯化,先将从含酚废水采集的活性污泥放入含酚量小于,l00mg/L,含酚废水中，添加,0.3%MgSO47H2O,、,0.3%KH2PO4,，,30,振荡培养,6,7,天，使苯酚降解菌大量增殖，淘汰对酚不适应的微生物；再流加含酚废水，使苯酚浓度增加至,200mg/L,，,30,振荡培养,4,6,天；再提高到流加,250mg/L,含酚废水，,30,培养,4,天，从中选出对酚耐受力强的菌株。,实验,4-1,降解苯酚微生物的选育,4.,性能测定。,初筛：制备不同含酚浓度的耐酚平板培养基，苯酚浓度为,0.025%,、,0.045%,、,0.060%,、,0.075%,，将选出的耐酚力强的的菌株在以上平板培养基上划线分离，自高酚浓度平板上长出的菌落，即为酚降解力高的菌株。,复筛：将初筛纯化的菌种分别接入碳源对照培养液,a,和苯酚培养液,b,中，,30,振荡培养,48h,，,0,、,12,、,24,、,36,、,48h,取样测,A600,光密度值，绘制生长曲线，以不含酚的碳源,(,葡萄糖,),培养液为对照。若与对照相比，在,250mg/L,苯酚浓度培养液中生长速度下降不明显，同时，用,4-,氨基安替比林法检测发酵初时发酵液和发酵终止时发酵液苯酚浓度，计算降解率，若苯酚降解率达,80%,，表明确系分离到有效苯酚降解菌。,实验,4-1,降解苯酚微生物的选育,五、实验报告,1,记录分离得到的苯酚降解菌情况于表,4-1,。,2,根据复筛耐酚试验，绘制对照组与试验组生长曲线。,3,记录在平板上和显微镜下观察的苯酚降解菌的菌落特征和镜检特征。,实验,4-1,降解苯酚微生物的选育,表,4-1,苯酚降解菌株的降解率,菌源,菌株,不同酚浓度平板生长状况,0.025%,0.045%,0.060%,0.075%,菌源,菌株,苯酚降解率,70%,71%,80%,81%,90%,91%,100%,返回,实验,4-2,利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株,一、实验目的,1,掌握紫外线诱发微生物突变的基本原理。,2,学习筛选、检出和鉴定营养缺陷型突变株的方法。,二、实验原理,本实验以紫外线作为诱变因素，照射时间为,60s,，用青霉素法将缺陷型进行浓缩。再根据营养缺陷型在基本培养基上不能生长，只能在完全培养基或基本培养基中加有它所缺陷的那种物质才能生长的原理，采用逐个点种法，将营养缺陷型检出，然后用生长谱法将缺陷型加以鉴定。,实验,4-2,利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株,三、实验材料,1.,菌种 野生型大肠杆菌（,E.coli,）。,2.,培养基 肉汤液体培养基，加倍肉汤液体培养基,(2E),，固体完全培养基，基本培养基,(,固体,),，无,N,基本液体培养基，,2N,基本液体培养基，见附录,。,3.,生长因子类别,混合氨基酸和混合维生素的配制（若所用氨基酸为,DL,型，量需加倍），共分八组（见表,4-2,）,.,.,器材 培养皿,(9cm,、,6cm),，三角瓶,(150mL),，,lmL,吸管，,10mL,吸管，离心管,(10mL),，带,15 W,紫外灯管照射装置，离心机等。,实验,4-2,利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株,表,4-2,混合氨基酸和混合维生素的配制,I,赖,精,甲硫,半胱,胱,嘌,II,组,精,苏,谷,天冬,嘧,丙,甲硫,苏,羟脯,甘,丝,亮,半胱,价,羟脯,异亮,缬,苯丙,胱,天冬,甘,异亮,酪,色,嘌,嘧,缬,酪,脯,混合维生素（含多种常用维生素）,实验,4-2,利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株,四、实验方法,1.,诱变处理,（,1,）实验前,14,16h,挑取野生型大肠杆菌,1,环于盛有,5mL,肉汤的三角瓶中，置,37,培养过夜。,（,2,）第,2,天添加,5mL,新鲜的肉汤培养液，充分混匀后，继续培养,5h,。,（,3,）取,5mL,培养好的溶液倒入离心管中，离心,(3500r/min,，,10min),。,（,4,）倒去上清液，打匀沉淀，吸入,5mL,生理盐水，制成菌悬液。,实验,4-2,利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株,（,5,）吸上述菌液,3mL,于直径为,6cm,的小培养皿内,(,皿内放一搅拌子，下为磁力搅拌器,),，将培养皿放在,15W,的紫外光灯下，距离,28.5cm,。,（,6,）处理前先开紫外灯稳定,10min,以上，将待处理的培养皿连盖放入灯下灭菌,lmin,，然后开盖在搅拌条件下处理,lmin,，照射后盖上皿盖，再关紫外灯。,（,7,）吸,3mL,加倍肉汤培养液倒入处理后的培养皿中，放置在,37,温箱内，避光培养,12h,以上。,实验,4-2,利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株,2.,用青霉素法淘汰野生型,（,1,）吸,5mL,处理过的菌液于已灭菌的离心管，离心,10min(3500r/min),。,（,2,）倒去上清液，打匀沉淀，加入生理盐水，离心洗涤,3,次，吸生理盐水到原体积。,（,3,）吸取经离心洗涤的菌液,0.1mL,于,5mL,无,N,基本培养液，,37,培养,12h,。,（,4,）培养,12h,后，按,11,加入,2N,基本培养液,5mL,，称取青霉素钠盐，使青霉素在菌液中的最终浓度约为,500,u,/mL,，再放入,37,温箱中培养。,（,5,）从培养,12,，,16,，,24h,的菌液中，各取,0.1mL,菌液到预先倒好的基本培养基和完全培养基的平板中涂皿。放入,37,温箱中培养。,实验,4-2,利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株,3.,缺陷型的检出,（,1,）以上平板培养,36,48h,后，进行菌落计算，选用完全培养基上长出的菌落数大大超过基本培养的那一组，用无菌牙签挑取完全培养基上长出的菌落,100,个，分别点种于基本与完全培养基平板上，先基本后完全，于,37,温箱培养。,（,2,）培养,12h,后，选在基本培养基上不长，完全培养基上生长的菌落，在基本培养基的平板上划线复证。,37,温箱培养，,24h,后不生长的可能是营养缺陷型，便可用于鉴定。,实验,4-2,利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株,4.,生长谱鉴定,（,1,）将可能是缺陷型的菌落接种于盛有,5mL,肉汤培养液的离心管中，,37,培养,14,16h,。,（,2,）培养,16h,后，以,3500r/min,离心,l0min,，倒去上清液，打匀沉淀，然后离心洗涤三次，最后加生理盐水到原体积。,（,3,）吸取经离心洗涤的菌液,lmL,于灭菌的培养皿中，然后倒入熔化后冷至,40,50,的基本培养基，摇匀放平，待凝，共做两皿。,实验,4-2,利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株,（,4,）将两只培养皿的皿底，等分,8,格，依次放入混合氨基酸，混合维生素和核酸碱基混合物，然后放入,37,温箱培养,24,28h,。,整个实验过程参见图,4-2,。,五、实验报告,观察生长圈，确定是哪种营养缺陷型。,实验,4-2,利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株,图,4-2,紫外线诱变筛选大肠杆菌营养缺陷型突变株流程图,返回,实验,-,微生物菌种的保藏方法,一、实验目的,了解并掌握菌种保藏的常用方法、基本原理及其应用。,二、实验原理,菌种保藏的原理是微生物在低温、干燥、缺氧的条件下会降低代谢活动，使细胞处于休眠和代谢停滞状态，从而能够较长期地保藏菌种，并能推迟细胞退化，降低菌种的变异率。,常用的保藏方法包括斜面传代保藏法、穿刺保藏法、液体石蜡保藏法、砂土管保藏法等。这些方法操作简便易行，不需要特殊设备，为一般实验室及生产单位广泛采用。,实验,-,微生物菌种的保藏方法,三、实验材料,1.,菌种 细菌、放线菌、酵母菌、霉菌斜面菌种。,2.,培养基 牛肉膏蛋白胨培养基，高氏,1,号培养基，马丁氏培养基，马铃薯葡萄糖培养基。,3.,试剂,10%HCl,，筛子，无水氯化钙，医用液体石蜡（比重,0.83,0.89,），河沙，瘦黄土（含有机物少的黄土）。,4.,器材 干燥器，,40,目及,100,目无菌筛子，无菌试管，无菌移液管（,1mL,及,5mL,），接种环，接种针，无菌滴管，超净工作台，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌锅。,实验,-,微生物菌种的保藏方法,四、实验方法,1.,砂土管保藏法,此法仅适用于保藏产生芽孢或孢子的微生物，常用于保藏芽孢杆菌、梭菌、放线菌或霉菌等。,(1),无菌砂土管制备,河砂处理 取河砂,1000,1500g,，用,40,目筛子过筛，除去大的颗粒。再用,10%HCl,溶液浸泡，除去有机杂质，盐酸用量应浸没砂面，约浸泡,24 h,，倒出盐酸，用自来水冲洗至中性，烘干。用磁铁石除去黄砂中的铁质。,筛土 取,30cm,以下的较贫瘠非耕作层的黄土若干，自来水冲洗至中性，烘干磨细，用,100,目筛子过筛。,实验,-,微生物菌种的保藏方法,砂和土混合 砂和土以,11,或,32,混合均匀，装入,100mm10mm,小试管中。装量约,1 cm,高即可，塞上棉塞，包上牛皮纸。,灭菌 高压蒸汽灭菌，,121,灭菌,1,1.5 h,。每天一次，连续灭,3 d,。在,50,以下烘干。,无菌检查 取灭菌后的砂土少许，接入牛肉膏蛋白胨培养液中，,37,培养,1,2 d,，观察有无杂菌生长。如有，则需重新灭菌。,实验,-,微生物菌种的保藏方法,（,2,）制备菌悬液 首先使斜面菌体生长健壮，孢子饱满，吸取,3,5 mL,无菌水至,1,支已培养待保藏的菌种斜面中，用接种环轻轻刮下孢子或菌苔（注意不要带入菌丝和培养基），使成菌悬液，细胞浓度为,108,1010mL-1,。,（,3,）加样 用无菌吸管吸取菌悬液，在每支砂土管中滴加,4,5,滴菌悬液，用接种环拌匀，塞上砂土管棉塞。,（,4,）干燥 将已滴加菌悬液的砂土管置于干燥器内。干燥器内应预先放置无水氯化钙用于吸水。当无水氯化钙因吸水变成糊状时则应进行更换。如此数次，砂土管即可干燥。有条件时，也可用真空泵连续抽气约,4 h,，即可达到干燥效果。,实验,-,微生物菌种的保藏方法,（,5,）抽样检查 从抽干水分的砂土管中，每,10,支抽取,1,支进行检查。用接种环取少许砂土，接种到适合于所保藏菌种生长的斜面上，并进行培养。检查有无杂菌生长及所保藏菌种的生长情况。,（,6,）保藏 若经检查没有发现问题，可将砂土管继续放在干燥器内（干燥器底部盛有硅胶、石灰或五氧化二磷等物），用橡皮塞或棉塞塞住试管口，并置于室温或,4,冰箱保存。也可用真空泵抽干水分后火焰封口。,实验,-,微生物菌种的保藏方法,2.,斜面保藏方法,（,1,）贴标签 在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期，贴在试管斜面正上方距离试管口,2,3cm,处。,（,2,）斜面接种 将待保藏的菌种用斜面接种法接种在已注明菌名的试管斜面上。,（,3,）培养 细菌置,37,恒温箱中培养,18,24 h,，酵母菌置,28,30,恒温箱中培养,26,60 h,，放线菌和丝状真菌置,28,培养,4,7,天。,（,4,）保藏 斜面长好后，直接放入,4,的冰箱中保藏。这种方法一般可保藏三个月至半年。,实验,-,微生物菌种的保藏方法,3.,液体石蜡保藏法,（,1,）液体石蜡灭菌 将液体石蜡置于,100 mL,的小锥形瓶内，每瓶装,10 mL,，塞上棉塞，外包牛皮纸，高压蒸汽灭菌，,121,灭菌,30 min,。灭菌后将装有液体石蜡锥形瓶置于,105,110,的烘箱内约,1 h,，以 除去液体石蜡中的水分。,（,2,）接种 将菌种接种至适宜的斜面培养基上。,（,3,）培养 在适宜温度条件下培养，使其充分生长。,（,4,）加液体石蜡 用无菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡，注入到已长好菌的斜面上，液体石蜡的用量以高出斜面顶端,1,2 cm,左右为宜，使菌种与空气隔绝,实验,-,微生物菌种的保藏方法,（,5,）保藏 将已注入液体石蜡的斜面培养物直立，置于,4,5,冰箱或室温下保存。,（,6,）转接 到保藏期后，需将菌种转接至新的斜面培养基上，培养后再加入适量灭菌液体石蜡，进行保藏。,注意：,从液体石蜡下面取培养物移种后接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅。,五、实验报告,记录各种菌种保藏的方法和结果。,返回,实验,4-4,苏云金杆菌的复壮,一、实验目的,学习从病虫体内复壮病原菌的一般方法。,二、实验原理,苏云金杆菌及其变种杀螟杆菌、青虫菌和松毛虫杆菌等都是昆虫的致病细菌。将它们经过固体或液体培养基大量培养后，可收集其菌体并添加适量的填充料如碳酸钙等，以制成杀虫菌粉。它对玉米螟、稻苞虫、粘虫、松毛虫、棉铃虫和菜青虫等几十种鳞翅目昆虫的幼虫均具有很强的感染力。,实验,4-4,苏云金杆菌的复壮,生产菌种经过若干代之后往往会出现菌种衰退，表现为产芽孢或伴孢晶体的数量越来越少，体积变小，毒力下降等。为了保证生产菌种能保持较强的毒力和原有的性状，就要进行经常性的菌种复壮工作。对于杀虫菌来讲，复壮就是用原来生产菌种制成悬浮液，然后将它拌到饲料中饲养昆虫,(,选健壮的,3,龄幼虫,),，待昆虫死后再从虫体内重新分离出苏云金杆菌。如此重复,4,8,次即可得到毒力强的菌种。另外，也可从自然界死亡虫体中分离菌种。,实验,4-4,苏云金杆菌的复壮,三、实验材料,1.,培养基 牛肉膏蛋白胨培养基。,2.,器材 显微镜，无菌培养皿，无菌三角瓶,(,内装玻璃珠,),，镊子，解剖针，无菌滴管等。,3.,试剂,75%,乙醇，,5.25%,次氯酸钠,(,即漂白粉,),，,10%,硫代硫酸钠。,四、实验方法,1.,制备菌液将菌接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，置,30,恒温培养,24h,后，用无菌水洗下菌苔制成孢子悬液。,实验,4-4,苏云金杆菌的复壮,2.,感染昆虫将上述菌液滴加在喂饲昆虫的叶片上，晾干后任昆虫,(,挑选健壮的,3,龄幼虫,),取食，然后将虫子放,25,恒温条件下饲养，待昆虫死亡后采集死虫。,3.,采集死虫濒于死亡的昆虫幼虫停止取食后，口吐褐色体液，排泄稀粪于叶片或其他附着物上，部分或大部分的虫体开始变为褐色。由于细菌在虫体内大量繁殖，结果使幼虫的体壁变得薄而易破，因此采集时要特别小心。将采集来的昆虫放在无菌培养皿或无菌小瓶中。如果死虫紧贴在粘附物上可连同基物一起采集。,实验,4-4,苏云金杆菌的复壮,4.,虫体表面消毒为防止消毒溶液渗入体腔，应用棉线结扎虫体的口腔和肛门。将虫体浸入,75%,乙醇中，浸数秒钟后即移入含,5.25%,漂白粉的溶液中，浸,3,5 min,，再将虫体转入,10%,硫代硫酸钠溶液内浸,3,5min,，以除去游离的氯，最后用无菌水冲洗虫体,5,次，供分离菌种用。,5.,分离细菌把消毒好的幼虫置无菌培养皿中，在无菌条件下，用手术小剪刀沿虫体的背线或侧线剖开，即可流出褐色的体液，或用小剪将肛门端剪掉，轻压另一端，也可挤出褐色的体液。然后，用无菌滴管吸取褐色体液于盛有,50mL,无菌水的三角瓶内,(,瓶内装有玻璃珠,),，充分振荡三角瓶，以分散菌体。然后用平板划线法或稀释涂布法进行分离纯化。,实验,4-4,苏云金杆菌的复壮,6.,挑单菌落 苏云金杆菌在牛肉膏蛋白胨培养基中，于,30,培养,24h,后即可形成灰黄色、不透明、有皱纹、边缘不规则的菌落，然后用接种环挑若干个单菌落分别接种至牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，置,30,培养,48h,后，再用显微镜观察细菌形态。,7.,镜检制备苏云金杆菌的涂片，经染色后置油镜下观察；苏云金杆菌菌体呈杆状，两端钝圆。,8.,保藏将检查合格的菌株直接放入,4,冰箱保藏或将斜面菌苔用生理盐水洗下制成高浓度的孢子悬液，然后取,0.2 mL,菌液于无菌的砂土管中，置真空干燥器内,(,装有,CaCl,2,或,P,2,O,5,),，用真空泵抽干后放,4,冰箱保藏。,实验,4-4,苏云金杆菌的复壮,五、实验报告,将分离苏云金杆菌的结果记录于表,4-2,中。,注意事项：,1.,不要采集死亡时间较长的虫体。因死亡时间太长，昆虫肠道内的微生物及外界其他微生物可能同时侵入组织中进行繁殖，从而会增加分离的困难。,2.,注意辨别所挑的菌落是昆虫体内的病原菌还是由于消毒不严或操作不慎而带入的杂菌。除了观察其菌落形态外还可从以下两方面进行判断：进行释稀涂布分离时，在不同稀释度平板上具有苏云金杆菌特征的菌落数是否按比例递减；将分离前的菌液与分离得到的单菌落各做一张涂片，观察两者细胞形态是否相同。,实验,4-4,苏云金杆菌的复壮,表,4-2,苏云金杆菌的分离结果,挑选的单菌落,菌落特征,芽孢形状,有无伴孢晶体,菌种保藏方式,1,2,3,4,5,