核磁共振波谱学方法在分子生物学中的应用.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,核磁共振技术发展史概述,1946,年,E.M.Purcell,和,F.Bloch,发现核磁共振,(NMR),现象,1965,年前后 脉冲傅里叶变换,NMR,技术兴起,1971,年,J.Jeener,提出二维,NMR,方法,80,年代中,K.Wuthrich,发展了运用同核二维核磁共振方法,进行蛋白质,NMR,谱图的序列识别方法,80,年代末 遗传工程技术迅速发展，,13,C,和,15,N,同位素标记,样品大量制备，,A.Bax,等人提出异核二维核磁共,振方法,90,年代初 三维和四维异核核磁共振方法迅速发展，,750,MHz(1993,年,),和,800 MHz(1995,年,),高场核磁共,振波谱仪问世,现在,900MHz,核磁共振波谱仪已大量使用，并已可确,定分子量大于,3.6 KDa,的蛋白质溶液三维结构,一,、,NMR,简介,核磁共振方法简介,核磁共振是在二十世纪四十年代被发现的一种物理现象。在六十年的科学技术发展历程内，核磁共振方法在生物学、化学、物理学、药学、医学以及化学工业、食品工业、医药工业等方面显示了极大的生命力，成为研究分析各种物质及其性能的重要边缘学科。,NMR,方法的研究特点,在运用核磁共振方法分析物质时，物质分子中的原子核尤如一个精细的探针，允许核磁共振方法在分子、原子水平上探测物质，使我们得以深入了解物质的微观特性变化。,NMR,是在分子、原子水平上检测物质特性。,原子核作为,NMR,的一个精细的探针探测物质的微观特性变化。,NMR,研究不损伤蛋白质样品。,NMR,可以检测包括化学反应，构象变化等动力学过程。,核磁共振技术的优缺点,天然状态下对样品进行探测,提供原子分辨率上的结构及动力学信息,灵敏度低,样品需要量大,样品制备成本高,可研究分子的分子量有限制,仪器昂贵,维护费用,高,核磁共振实验的灵敏度,核磁共振实验的灵敏度一般用单位采样时间内的信噪比,来衡量：,式中,N,为检测线圈内被检测磁性核数目，和样品的浓度有关；,Q,是线圈的品质因子，主要取决于探头本身；,e,、,d,是核的旋磁比，下标,e,，,d,分别代表激发核与检测核；,B,0,是静磁场强度；,T,2,是横向驰豫时间；,T,是实验温度；,t max,是,FID,信号采样时间；,Tc,是不同次采样间总间隔时间（,t max,加上循环时）；,T,1,e,是激发核的纵向驰豫时间,核磁共振波谱仪简介,现代的核磁共振波谱仪是由超导磁体，包含由射频发生、功率放大、脉冲形成及控制、信号检测等各种功能电子器件的主机，以及用于设置和控制实验的计算机系统所组成。当今世界科学技术的发展也促进了核磁共振波谱仪的发展，不仅是谱仪本身已近乎于全数字化，而且已先后研制成静磁场强度更高（或共振频率更高）的超导磁体。已可提供使用的不仅有,600MHz,高场超导磁体，更有,750 MHz,和,800 MHz,超导磁体，,900 MHz,超导磁体也已问世。核磁共振谱仪技术及实验方法的迅速发展大大扩展了核磁共振技术方法的应用范围。,Magnet,NMR,实验样品,溶液样品（,500,l,，浓度,0.5-2.0,mM,),要求：高纯度，稳定性好，不聚合，溶解度高,固体粉末样品,液晶状态样品,样品配制,：,取用,适当,的,样,品量,(10 mg),选择合适的,D-solvent,取用,合适,的,NMR sample tube(5,mm),配制适当,的量,:,0.5,mL,3 cm,NMR,实验步骤,二、,NMR,基本原理,原子核自旋运动：原子核的自身旋转运动,。,用“自旋角动量”描述核自旋运动；,进行自旋运动的原子核都具有一定的自旋角动量；,核自旋角动量的大小决定于核自旋量子数,I,；,I,表示某种原子核所固有的特性，,不同的原子核,I,值不同；,核自旋量子数,I,0,1/2,1,3/2,(1),原子核的自旋运动,(2),原子核的磁矩,原子核带有一定的正电荷，可以认为这些电荷均匀地分布在原子核的表面；,I,0,的原子核有自旋运动，因此正电荷也围绕着旋转轴旋转产生环电流，从而产生一个磁场；,一般用磁矩来描述这种磁性质；,核磁矩,g,N,N,I,N,是一个常数，称为核磁子,(g,N,N,)/,=,称为旋磁比,与粒子电荷和质量的比有关，不同的原子核有不同的,值,(3),核磁共振条件,在静磁场,H,0,中,I,0,的原子核磁矩在磁场的作用下具有一定的能量；,该能量决定于核磁矩在静磁场方向的投影与磁场强度乘积的负值,E,z,H,0,核磁矩在磁场中能量不连续，即能级分裂，能量差为,E,H,0,将能量为,h,的射频场加到原子核上，如果,h,E,，原子核就会在两个能级间跃迁，吸收电磁波能量；,受激辐射和受激吸收的几率相同，在射频场作用下的净跃迁由上下能级的布居数之差决定。很小的布居数差表明核磁信号很弱，因此核磁共振的灵敏度很低。,核磁矩不为零的核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂,（,Zeeman Splitting),原子,核共振吸收一特定频率的射频,(=,B,),辐射,这一物理过程称为,核磁共振现象,。,产生核磁共振的条件：,h,g,N,N,H,0,H,0,是电磁波频率,2,H,0,在同一静磁场中，不同种原子核的核磁共振频率不等，例如氢原子、碳原子以及氮原子的核磁共振频率各不相同，即使是同一种原子核，但各核在分子中所处的微环境不同，其共振频率也不尽相同。因此，核磁共振实验可以通过氢核检测质子核磁共振谱；通过碳核检测碳13核磁共振谱；通过氮核检测氮15核磁共振谱。,几种核的,性质,核,自旋,自然丰度 (%),绝对灵敏度,核磁共振频率,1,H,1/2,99.98,1.00,600.13,2,D,1,0.015,1.45,10,-6,92.06,13,C,1/2,1.11,1.76,10,-4,150.79,15,N,1/2,0.37,3.85,10,-6,60.77,19,F,1/2,100,8.30,10,-1,564.18,23,Na,3/2,100,9.25,10,-2,158.63,31,P,1/2,100,6.63,10,-2,242.76,(4)NMR,实验基础,核磁矩在磁场中以角频率,0,围绕,H,0,旋转,0,=,H,0,0,称为,Larmor,进动,频率,如果,2,=,0,那么核磁矩也要围绕射频场进动。,NMR,实验,脉冲,射频场是,以脉冲形式,加到样品上,(5)NMR,检测的是核磁矩自由感应衰减,(Free Induction Decay),信号，即,FID,信号,(6),傅立叶变换,(Fourier Transformation),FID,信号处理,:,运用傅立叶变换,将,FID,时间域信号变换为频率域信号。,单,个,射频,脉冲的频谱,：,(7)NMR,波谱,1D NMR:,F,(,t,),F,(,f,),2D NMR:,F,(,t,1,t,2,),F,(,f,1,f,2,),3D NMR:,F,(,t,1,t,2,t,3,),F,(,f,1,f,2,f,3,),4D NMR:,F,(,t,1,t,2,t,3,t,4,),F,(,f,1,f,2,f,3,f,4,),(8)NMR,实验对谱仪要求,1,、恒定的静磁场,超导磁场,2,f,=,H,0,(,2,f,=,2,),(,1,H),(,13,C),(,15,N),0,(,1,H,),0,(,13,C,),0,(,15,N,),f(,1,H,)f(,13,C,)f(,15,N,),2,、稳定的脉冲频率和多射频通道,提供多射频通道,提供不同的脉冲实验技术,脉冲程序,(,不同的脉冲组合,),可以在实验中设置,脉冲频率可以在实验中设置,射频功率,h,可以在实验中设置,3,、能够检测微弱的,FID,信号,4,、能够,处理多维核磁共振,实验,数据,三、,NMR,波谱参数,1,、,化学位移,(Chemical Shift),同一种核在分子中不同化学环境下共振频率的位移称为化学位移,。,核外电子在外磁场作用下，产生感应磁场，对外加磁场起一个屏蔽作用，产生化学位移。,H(,核,),H,0,(1,),H,(,核,),原子核实际所感受的磁场,屏蔽常数,H,0,外加磁场,的表示式,:,(H,m,-H,s,)/H,s,10,6,ppm,H,m,是测量值,H,s,是,标准样品值,与核所处的化学微环境有关,;,与核所位于的局域结构有关,;,受芳环的影响标准,;,受溶剂效应影响,.,提供的信息,：,可以正确预测蛋白质中形成,螺旋和,折叠的氨基酸残基肽段,;,可以正确指示蛋白质发挥生理功能的活性部位,;,可以指示蛋白质与蛋白质，蛋白质与,DNA,和,RNA,，,蛋白质与药物小分子等相互作用的部位,;,可以提供蛋白质构象变化的信息,.,Range of Chemical Shifts of,1,H,13,C,15,N Resonances,1,H Chemical Shifts,:,1,H,N,:6.0 11.0 ppm,1,H,:2.5 6.0 ppm,1,H,:2.0 4.5 ppm,1,H,:1.0 3.0 ppm,CH,3,:0.0 1.5 ppm,1,H(aromatic ring):6.5 7.8 ppm,13,C Chemical Shifts:,13,C,:43 68 ppm,13,C,:25 45 ppm,13,C,(Serine):56 66 ppm,13,C,(Threonine):58 72 ppm,13,CH,3,:10 27 ppm,13,C(aromatic):108 158 ppm,13,C,:171 177 ppm,15,N Chemical Shifts,:,15,N(amide):,101,139 ppm,40 ppm,15,N(Histidine side chain):,165 222 ppm,15,N(other side chain):,110 115 ppm,&108 ppm,2,、,自旋自旋耦合常数,(spin-spin coupling or J-coupling constant),核磁矩通过围绕在核外的电子云间接传递作用而产生的自旋间的能量偶合,J,耦合常数为,Hz,1,H,N,-,1,H,J,耦合常数的表示式,(Karplus,公式,),3,J,N,=6.4cos,2,-,1.4cos,+,1.9,=,-,60,是,扭转角,是二面,角,J,值大小与外加磁场无关,;,J,值大小与耦合核之间成键数目有关,;,J,值大小与分子结构有关,(,在蛋白质中，,螺旋和,折叠氨基,酸肽段中的,J,值大小不等,);,J,耦合常数,(,3,J,N,),与耦合核的扭转角有关,.,J,耦合常数可以提供的信息：,在小分子中可以提供结构信息,;,在蛋白质中可以描述主链及侧链的构象,;,可用于分析蛋白质变性态中存在的残余结构,;,为蛋白质和核酸的溶液三级结构的测定提供几何数据,.,3,、,NOE(Nuclear Overhauser Effect,核欧沃豪斯效应,),NOE,反应原子核自旋之间通过空间的偶极偶极相互作用,;,如果两个,1,H,核间的距离小于,5,，,那么在,NMR,谱中就可以观察到,NOE,信号,(,在蛋白质中也可观察到小于或等于,6,的,NOE,信号,),I,1/,d,ij,6,I,两个,1,H,核间的,NOE,信号强度,d,ij,两个,1,H,核间的空间距离,NOE,信号强度与两个,1,H,核间的距离有关,;,NOE,与分子内部运动、化学交换有关,;,NOE,与核自旋体系内的交叉弛豫有关,;,NOE,信号强度可以提供的信息：,蛋白质中氢原子对之间的距离,(,是确定蛋白质溶液三级结构的最重要的数据,);,蛋白质构象变化情况,;,蛋白质与其靶分子相互作用的具体氨基酸残基,.,4,、共振峰强度,共振峰强度反应了在共振频率,产生,NMR,的核自旋数目,共振峰强度与蛋白质样品浓度有关,;,表观共振峰强度与,NMR,谱的信噪比有关,;,共振峰强度变化还与蛋白质分子中间存在的交换,现象有关,.,共振峰强度可以提供的信息,:,在,H/D,交换实验中的强度变化常被用以分析蛋白,质的内运动情况，指示氢键的强弱,;,利用小分子与蛋白质分子结合时峰强度变化，可,以分析小分子的结合情况,.,5,、,共振峰宽度,(,线宽,H,),H,定义为共振峰高度等于,1/2,处的峰宽,与核自旋的局域相互作用有关,|H,0,+H,local,|,与核自旋的弛豫时间,T,2,有关,H1/T,2,H,可以提供的信息：,蛋白质中氨基酸残基肽段的动态特性,蛋白质与其他生物分子相互作用的部位,6,、,T,1,，,T,2,弛豫时间,(Relaxation Time),核自旋系统受外界作用,(,外加直流磁场和射频场的共作用,),离开平衡态以后，能够自动地向平衡状态恢复，这一恢复过程称为弛豫过程。,M-,核磁化强度,M,-,核磁化强度的纵向分量,M,-,核磁化强度的横向分量,T,1,-,纵向弛豫时间,(,自旋晶格弛豫过程,),，描述,M,的恢复过程,核自旋系统与周围晶格交换能量,使各能级上的布居数恢复到热平衡状态,。,T,2,-,横向弛豫时间,(,自旋自旋弛豫过程,),，描述,M,的恢复过程,等同核自旋系统内部各自旋之间交换能量,影响谱线线宽,。,T,1,与蛋白质分子在水溶液中的翻滚运动有关，所以溶液的粘滞性也影响,T,1,时间,T,2,与蛋白质分子内的交换过程,(,构象平衡，蛋白质折叠,/,去折叠，侧链运动,),有关,T,1,，,T,2,可以提供的信息：,蛋白质骨架动态特性,蛋白质内运动及其与蛋白质生理功能关系的信息,蛋白质在水溶液中的多构象平衡信息,7,、,化学交换,(Chemical Exchange),效应,化学交换指的是核在两个,(,或两个以上,),环境之间的交换,;,与分子内的交换过程,(,多构象转化，蛋白质折叠态与去折叠态之间的平衡，芳香氨基酸环平面翻转运动,),有关,;,与分子间的交换过程,(,小分子与大分子结合，蛋白质酰胺质子与水的交换等,),有关,.,可以提供的信息：,蛋白质中氢键情况,蛋白质去折叠,(,或折叠,),过程信息,提供,X-Pro,键的异构的信息,四、核磁共振波谱,一维,1,H NMR,波谱,二维,1,H NMR,波谱,三维,NMR,波谱,三维,NMR,波谱的某一截面,三维,NMR,波谱,三维,NMR,波谱的不同截面,三维,NMR,波谱,