生长曲线.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,*,细胞生长曲线,康正强,概述,细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长曲线的测定是最为基本的指标。细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。,步骤,1，取生长状态良好的细胞，消化制成悬液。经计数后，精确地将细胞分别接种于2130个大小一致的细胞瓶里（常用10ml培养瓶，也可用24孔培养板）每瓶接种细胞量要求一致，加入培养液也一致。细胞接种数不能过多也不能过少。太少细胞适应期太长，太多细胞将很快进入增殖稳定期。一般接种量以7-10天能长满而不发生生长抑制为度。同种细胞的生长曲线先后测定要采用同一接种密度，才能做纵向对比。不同的细胞也要接种细胞数相同，才能进行比较。,2，酌情每天或每隔一天取出三瓶细胞进行计数，计算均值。一般每隔24h取一瓶连续观察12周或到细胞总数有明显减少为止（一般需10天左右）。培养35天后常要给未计数的细胞换液。,3，以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），描绘在半对数坐标纸上。连接成曲线即为该细胞生长曲线。,一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮后贴壁，随后度过长短不一的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期，在达到饱和密度后，细胞停止生长，进入平顶期，然后退化衰老。,典型的生长曲线即可分为潜伏期、指数生长期、平,台,期及退化衰老四个部分，其中的三个不同生长时相（潜伏期、指数生长期和平顶期）是每个细胞系所共有的特征。通过测定生长曲线，不仅可以了解培养细胞生物学特性的基本参数、测定细胞绝对生长数、判断细胞活力，而且也可用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响。,实验原理,12日,，三瓶细胞均铺满瓶底，冻了两瓶，剩下一瓶一传三，预计周五换液。,14日,换液，细胞生长约瓶底70%，预计周日冻存两支，再一传三。,16日,早晨去见细胞片状浮起，弃掉旧培养液，pbs清洗后见瓶底仍有少量细胞贴附，遂将三瓶消化转移至新瓶(A)继续培养。,分析原因：1，周五细胞密度已经较大，应传代,2，细胞生长特别迅速（很多分裂相），加上密度大，周日情况应是细胞密度抑制及代谢酸中毒,。,17日,上午见(A)仍有较多单个细胞漂浮，背景很脏（小黑点）,反复冲洗，换液，见少量细胞贴附瓶底。,17日,下午,复苏一支细胞(B),。,18日,见(B)细胞部分贴附，换液，细胞较少；(A)个别细胞漂浮，背景较脏。,19日,见（B）细胞仍较少;(A)细胞变圆，少量漂浮，换液,20日见(B),细胞略有增多，见分裂相细胞。背景稍脏，预计明日换液 （A)细胞仍有悬浮细胞，背景脏，拟丢弃,。,分析原因：（A）虽然瓶壁有少量贴壁细胞，但状态应该也不好，加上消化，所以转移至新瓶生长不好。,微生物污染途径：,一，空气,超净台内操作，戴口罩，不大声讲话或咳嗽,（瓶盖拧紧再拿出温箱）,瓶盖拧松半圈，是否会造成培养瓶间污染的传染？,二，器材各种培养器皿及器械清洗消毒不彻底，例如洗刷不干净，污物残留及培养液等灭菌不彻底都可引入有害物质。另外需注意CO2温箱，由于温箱内湿度大，温度适宜，取存细胞时不慎将培养液漏出，易使细菌、霉菌孳生。而温箱是开放式培养，如不定期消毒，可形成污染。（进温箱前酒精喷手）,三，操作,无菌观念不强，操作不准确，使用污染的器皿，或封瓶时不严，都可发生污染。培养两种以上细胞时，操作不规范，交叉使用吸管或培养液等都有可能 导致细胞交叉污染。,四，血清,有些血清在生产时就已经被支原体或病毒等污染，即可成为污染的来源。,五，组织样本,原代培养的污染多数来源于组织样本；另一方面手术时使用碘酒消毒，这些混入组织中的点可以影响细胞生长。,微生物污染的检测,1，真菌的污染,真菌的种类很多，污染培养细胞的多为烟曲菌、黑曲菌、毛霉菌、孢子菌,白念、酵母等。霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物，一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不混浊，倒置显微镜下可见细胞之间有纵横交错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝，并悬浮飘荡在培养液中。很多菌丝在高倍镜下可见到有链状排列的菌株；念珠菌或酵母菌形态呈卵形，散在细胞周边和细胞之间生长。有时通过显微镜观察可能发现瓶底外面生长的菌丝，不要错当培养瓶内的污染。瓶外的污染物，需及时用酒精棉球擦洗清除，以防其通过瓶口传入瓶内。,2，细菌污染,多见大肠杆菌，白色葡萄球菌，假单胞菌等。加用抗菌素的培养液一般可预防和排除个别少量细菌的污染。一旦发生细菌污染很易发现，多数情况下培养液短期内颜色变黄，表明有大量酸性物质产生，出现明显混浊现象，有时静置的培养液瓶初看不混，稍加震荡就会有混浊物漂起。倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，有时在细胞表面和周围有大量细菌存在，细胞生长停滞并有中毒表现。必要时可取少量培养液涂片染色检查以正式细菌种类。有的培养液改变不明显又疑有污染，亦可向肉汤培养基内滴入少量培养液，37下培养以检测。,细菌和霉菌污染多在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且由于增生迅速，多在发生污染48h以内就很明显。因而要在实验的最初两天密切观察试验样本是否有污染发生，这样可以及时采取措施予以补救或排除。,3，支原体是大小介于细菌和病毒之间（最小0.2um）并独立生活的微生物，约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁，形态多变，可为圆形、丝状或梨形。,多数支原体适合于偏碱性条件下生存（7.68.0）。对酸耐受性差，对一般抗生素不敏感。,支原体污染后，培养液可不发生混浊，多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代换液而缓解，因此易被忽视。但严重者可致细胞增殖缓慢，甚至脱落。,微生物污染防治：,1，抗生素,多用于预防污染。已发生的污染多难以根除，反复使用会使微生物耐药，而且对细胞生长也有影响。当有价值的细胞污染时，可抗生素抢救：一般用常用量的510倍做冲击疗法。用药2448h后，再换常规培养液，有时污染早期此法可能奏效。,2，加温处理,支原体对热敏感，可将支原体污染的细胞置于41C作用510h，最长不超过18h，以杀灭支原体。但如此高温对细胞生长也有很大影响，因而在实验前应先用少量细胞做实验以找出最合适的时间和温度，以尽可能保证既杀灭支原体又使细胞不致受到太大损伤。,3，动物体内接种：将受支原体污染的细胞接种在同种动物的皮下或腹腔，借动物体内的免疫系统消灭支原体。待一定时间后取出细胞，做原代培养再进行繁殖。目前国外有能滤除支原体的新型滤膜系统。能滤除培养液中的支原体，但不能滤除细胞上的支原体。,细胞交叉污染防治,1，在进行多种细胞培养时，所用器具严格区分，标记。对每一种细胞按顺序操作，避免一起进行时发生混乱。,2，进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及培养液瓶瓶口以免把细胞带到培养液中，防止进行其他细胞培养操作时导致细胞污染。,3，所有从别处转来的细胞或自己所见的细胞系都要在早期留有充足的冻存储备，一旦怀疑发生细胞交叉污染，可做细胞遗传学方面的鉴定。如发现原有标志性遗传物发生改变，可以复苏早期冻存细胞使用。,细胞悬液制备：取生长良好接近汇合的细胞，胰酶消化，再加新鲜培养基制成细胞悬液后计数。,接种：根据细胞计数结果，按每瓶5104个接种细胞,，,作传代培养（,接种七组，每组三孔,）。,计数：24h后开始作细胞计数，以后每隔24h计数一次，连续计数7天。,绘图：根据计数结果，绘制细胞生长曲线。,（横轴时间天数，纵轴细胞数，万/mL）,实验方法,细胞生长曲线的绘制及注意事项,取对数生长期细胞，用胰酶消化收集，调整单细胞悬液密度为104105个/mL视细胞贴壁后的大小，倍增时间等因素确定接种密度。按200l/孔（1104个细胞）接种于96孔培养板内，每组细胞接种5个孔，取平均值，切记各孔的接种密度一致。,置37、5CO2气相和饱和湿度的CO2培养箱中培养,，,用PBS配制5mg/ml的MTT溶液，0.22微膜过滤除菌，4度保存。(MTT溶剂需避光4度保存，配好的溶剂有效期两周，过期的不能再用于实验，须重配),从第24 h开始，每隔24 h随机取1块96孔板，96孔板每孔加入20l 5mg/mL MTT液，继续培养4 h后，吸出孔内培养液；向每孔加入150l DMSO。将培养板置于微孔板振荡器上振荡10 min，使结晶物溶解。,5.酶联免疫检测仪检测各孔OD值，检测波长570 nm,以时间为横坐标，平均OD值为纵坐标，记录并绘制细胞生长曲线。,备注：A.选择适当的细胞接种浓度。因此，在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止时不致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成的量与细胞数呈良好的线性关系。B.细胞生长曲线方法96孔板太小,接种细胞多时,用不了几天就长满,因一般要做5-7天);接种细胞少时,不易养活.,C.避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高浓度的血清物质会影响试验孔的吸光值。由于试验本底增加，会降低试验敏感性。因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。,D.操作过程中按常规换液.一般2-3天换液,如果不换液,则酸性产物等代谢产物积聚,一方面培养环境改变影响细胞生长,另一方面细胞营养消耗过多,生长变慢.做细胞生长曲线的目的是反映其生长特性,增殖能力,不换液则与我们平时细胞生长环境不一致.结果不科学.,E.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。,MTT是什么,简单地说：,MTT,是一种检测细胞存活和生长的方法。,MTT主要有两个用途,1药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性,的测定；,2细胞增殖及细胞活性测定。,MTT检测原理为,:,活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。,MTT 溶液配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂,.,在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。,配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感l MTT一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。,MTT有致癌性，用的时候小心,最好带手套.,二甲基亚砜DMSO，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。,MTT法实验步骤,1:胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10104/ml。,1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。,2.5%CO2，37孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度，每孔100ul，设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况,3.5%CO2，37孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。,4.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。,5.终止培养，小心吸去孔内培养液。,6.每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。,7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）,