实时荧光定量PCR(qPCRRTPCR)的原理及应用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,LOGO,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,LOGO,*,单击此处编辑母版标题样式,Contents,一、实时荧光定量,PCR,的定义,二、,RT-PCR,技术的原理及试验流程,三、,RT-PCR,技术的数据分析,四、,RT-PCR,技术的应用,实时荧光定量,PCR,目录,PCR,电泳,实时荧光定量,PCR,的定义,普通,PCR,在,PCR,结束后对 进行定量分析,终点产物,PCR,技术,和,荧光检测技术,的结合,通过,荧光染料,或,荧光标记的特异性探针,，对,PCR,产物进行,标记跟踪，,实时在线监控,反应过程，通过仪器和相应的软,件分析结果，对待测样品的,初始模板进行定量,或定性分析。,克服了普通,PCR,：,1,、终点定量重复性不好,2,、,EB,有毒，荧光太贵等缺点,实时荧光定量,PCR,的定义,RT-PCR,技术的原理及试验流程,RT-PCR,反应体系,模板,4.5l,Tag mixture,5.0l,F(F),0.25l,R(R),0.25l,荧光染料,SYBR Green I,荧光标记的探针,TaqMan,探针法,RT-PCR,技术的原理及试验流程,Monitoring PCR with the SYBR Green I Dye,（,SYBR Green,法）,变性,退火,延伸,RT-PCR,技术的原理及试验流程,SYBR Green,法优缺点,RT-PCR,技术的原理及试验流程,RT-PCR,技术的原理及试验流程,Monitoring PCR with TaqMan,（,TaqMan,法）,RT-PCR,技术的原理及试验流程,TaqMan,法,TaqMan,探针法优缺点,RT-PCR,技术的原理及试验流程,绝对定量,(Absolute Quantification,，,AQ),病原体检测,转基因食品检测,基因表达研究,相对定量,(Relative Quantification,，,RQ),基因在不同组织中的表达差异,药物疗效考核,耐药性研究,RT-PCR,技术的数据分析,相对定量通过内标定量,内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量,RT-PCR,技术的数据分析,内标,（,Endogenous Control,）,通常是,18S,、,28S,、,-actin,、,GAPDH,基因等看家基因,在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小,PCR,分四个阶段,RT-PCR,技术的数据分析,如何定量？,RT-PCR,技术的数据分析,-Ct,PCR,扩增循环数,扣除背景荧光后的相对荧光量,1.,荧光域值（,threshold,）的设定,在定量,PCR,中，需要经过数个循环后荧光信号才能够被检测到，一般以,15,个循环的荧光信号作为荧光本底信号。,如何定量？,RT-PCR,技术的数据分析,-Ct,PCR,扩增循环数,扣除背景荧光后的相对荧光量,2.Ct,值的定义,在荧光定量,PCR,技术中，有一个很重要的概念,Ct,值。,C,代表,Cycle,，,t,代表,threshold,，,Ct,值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图所示）。,如何定量？,RT-PCR,技术的数据分析,-Ct,3.Ct,值与起始模板的关系,研究表明，每个模板的,Ct,值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，,Ct,值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代,Ct,值。因此，只要获得未知样品的,Ct,值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,PCR,扩增循环数,扣除背景荧光后的相对荧光量,RT-PCR,技术的数据分析,3.Ct,值与起始模板的关系,研究表明，每个模板的,Ct,值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，,Ct,值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代,Ct,值。因此，只要获得未知样品的,Ct,值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,RT-PCR,技术的数据分析,相对定量分析方法,-Ct,前提,:,目标序列和内参序列的扩增效率接近,100,且偏差在,5,以内,1,、,用目标基因的,CT,值减内参基因的,CT,值：,CT,（,test)=CT,（,target,test)-CT,（,ref,test),CT,（,control)=CT,（,target,control)-CT,（,ref,control),2,、,用试验样本的,CT,值减校准样本的,CT,值：,CT=CT,（,test/control)-CT,（,calibrator),3,、计算表达水平比率：,相对表达量,RQ=,2,CT,RT-PCR,技术的数据分析,SYBR Green,熔解曲线分析,RT-PCR,技术的数据分析,临床疾病诊断,：各型肝炎、艾滋病、禽流感等传染病诊断和疗效评价；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断。,动物疾病检测,：禽流感、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等。,食品安全,：食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。,科学研究,：医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。,应用行业,：各级各类医疗机构、大学及研究所、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。,RT-PCR,技术的应用,