第九章蛋白质的研究历史与方法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,蛋白质的研究历史与方法,第一节 蛋白质研究的历史回顾,蛋白质是一类重要的生物大分子，protein字源出自希腊文，是,“,最原初的,”,，,“,第一重要的,”,意思,19世纪30年代中期以前，认识其,化学元素组成,情况及,原子之间结合比例,，即确定经验性的分子式,蛋白质,(protein),是由许多,氨基酸,(amino acids),通过,肽键,(peptide bond),相连形成的具有特定空间结构的高分子含氮化合物,组成蛋白质的元素,主要有,C,、,H,、,O,、,N,和,S,有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘,H,甘氨酸,CH,3,丙氨酸,L-氨基酸的通式,R,两性解离及等电点,氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度,等电点(isoelectric point,pI),1937年，,A.W.k.Tiselius,建立了研究蛋白质的,移动界面电泳(electrophoresis)方法,于,1948年获诺贝尔化学奖,1941年，,A.J.P.Martin,和,R.L.M.Synge,建立了,分配层析(partition chromatography)技术，,被授予,1952年的诺贝尔化学奖,The Nobel Prize in Chemistry 1948,for his research on electrophoresis and adsorption analysis,especially for his discoveries concerning the complex nature of the serum proteins,Arne W.K.,Tiselius,Uppsala University Uppsala,Sweden,1902-1971,The Nobel Prize in Chemistry 1952,for their invention of partition chromatography,Archer J.P.,Martin,Richard L.M.,Synge,1/2 of the prize,1/2 of the prize,National Institute for Medical Research London,United Kingdom,Rowett Research Institute Bucksburn(Scotland),United Kingdom,1910-2002,1914-1994,1953年，,F.Sanger,利用纸层析和纸电泳技术第一次揭示出,牛胰岛素的一级结构,，开创了以后数千种蛋白质序列分析的先声，被授予,1958年诺贝尔化学奖,The Nobel Prize in Chemistry 1958,for his work on the structure of proteins,especially that of insulin,Frederick,Sanger,University of Cambridge Cambridge,United Kingdom,1918 2013年11月,The Nobel Prize in Chemistry 1980,for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids,with particular regard to recombinant-DNA,for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids,Paul,Berg,1/2 of the prize,Stanford University Stanford,CA,USA,1926-,Walter,Gilbert,Frederick,Sanger,1/4 of the prize 1/4 of the prize,Harvard University,Biological Laboratories Cambridge,MA,USA,MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge,United Kingdom,1932-,1918-,2013年11月,J.C.Kendrew,(1958)及,M.F.Perutz,(1960)利用X射线技术解析了,肌红蛋白(myoglobin),和,血红蛋白,(hemoglobin)的三维结构，使人们第一次能够洞察生物大分子的空间结构，共同赢得了,1962年的诺贝尔化学奖,The Nobel Prize in Chemistry 1962,for their studies of the structures of globular proteins,Max Ferdinand,Perutz,1/2 of the prize,MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge,United Kingdom,1914-2002,John Cowdery,Kendrew,1/2 of the prize,MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge,United Kingdom,1917-1997,20世纪70年代中后期，,Gunter Blobel,利用体外蛋白质翻译系统发现动物细胞中很多分泌蛋白的跨膜方式，提出,“信号假说”(signal hypothesis),，获得了,1998年的诺贝尔生理医学奖,20世纪50年代后期，,E.W.Sutherland,发现细胞内,cAMP,的存在，,1971年被授予诺贝尔生理医学奖,70年代末80年代初，,A.G.Gilman,和,M.Rodbell,独立发现,G蛋白,的存在，因此二人在,1994年获得诺贝尔生理医学奖,“信号转导”(signal transduction),The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1994,for their discovery of G-proteins and the role of these proteins in signal transduction in cells,Alfred G.,Gilman,Martin,Rodbell,1941-,1925-1998,University of Texas,Southwestern Medical Center Dallas,TX,USA,National Institute of Environmental Health Sciences Research Triangle Park,NC,USA,60年代，,P.Mitchell,提出“,化学渗透学说,”，获,1978年获诺贝尔化学奖,70年代，,P.D.Boyer,提出“,结合改变机制,”；90年代，,J.E.Walker,测定ATP合酶的晶体结构，他们,共享了1997年的诺贝尔化学奖,揭示能量转化机制,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1993,for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry,Michael Smith,1944-,1932-2000,La Jolla,CA,USA,Kary B.Mullis,University of British Columbia,Vancouver,Canada,for his invention of the polymerase chain reaction,(PCR),method,for his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based,site-directed mutagenesis and its development for protein studies,Nature 1998;391:806-811.,Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in,Caenorhabditis elegans.,What Roger Kornberg himself has now done is to describe how the genetic information is copied from DNA into what is called messenger-RNA,Kornberg had described how genetic information is transferred from a mother cell to its daughters.,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2007,for their discoveries of principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells,Mario R.Capecchi Sir Martin J.Evans Oliver Smithies,USA United Kingdom USA,University of Utah Salt Lake City,UT,USA;,Howard Hughes Medical Institute b.1937(in Italy),Cardiff University Cardiff,United Kingdom,b.1941,University of North Carolina at Chapel Hill Chapel Hill,NC,USA,b.1925(in United Kingdom),The Nobel Prize in Chemistry 2008,for the discovery and development of the green fluorescent protein,GFP,Osamu Shimomura Martin Chalfie Roger Y.Tsien,Marine Biological,Laboratory(MBL)Woods Hole,MA,USA;,Boston University Medical School Massachusetts,MA,USA,b.1928(in Kyoto,Japan),Columbia University New York,NY,USA,b.1947,University of California San Diego,CA,USA;Howard Hughes Medical Institute,b.1952,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2008,for his discovery of human papilloma viruses causing,cervical cancer,for their discovery of human immunodeficiency virus,Harald zur Hausen,Franoise Barr-Sinoussi,Luc Montagnier,Germany,France,France,German Cancer Research Centre Heidelberg,Germany,b.1936,Regulation of Retroviral Infections Unit,Virology Department,Institut Pasteur,Paris,France,b.1947,World Foundation for AIDS Research and Prevention,Paris,France,b.1932,化学奖：,(1),分离纯化蛋白质,测定蛋白质分子质量,蛋白质结构分析,蛋白质生物学活性分析,探索结构与功能的关系,Summary(2),学科交叉,分子生物学是一门实践性、应用性强的学科,生化方法学是在不断发展的,蛋白质样品的提取,目的蛋白的获取,直接从生物体内获取,基因工程表达重组蛋白,采用免疫学方法获取相关抗体,获取蛋白质的编码序列(cDNA),基因组测序,基因组测序进行推导,获取部分肽段氨基酸序列,捕获相应蛋白质,经典的细胞蛋白质分离纯化流程由下述主要步骤组成,：,清洗组织或细胞,裂解细胞,离心除去膜组分等获得可溶性蛋白质,离心、层析、电泳等进一步纯化,获取产物蛋白,一、细胞的破碎,各种组织和细胞的常用破碎方法,细胞破碎方法 组织种类,旋刀式匀浆 大多数动、植物组织,手动式匀浆 柔软的动物组织,高压匀浆 细菌、酵母、植物细胞,研磨 细菌、植物细胞,高速珠磨 细胞混悬液,酶溶 细菌、酵母,去垢剂渗透 组织培养细胞,有机溶剂渗透 细菌、酵母,超声破碎 细胞混悬液,低渗裂解 红细胞、细菌,冻融裂解 培养细胞,二、去污剂处理溶解,膜蛋白,去污剂为,双极性(amphipathic),脂类分子，可在水中溶解。通常由线性或带有分枝的碳氢化合物尾部和结构各不相同的亲水性头部组成,SDS,Triton X-100,NP-40,Tween-20,三、蛋白质分子的稳定,在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑,制剂以防止蛋白水解,PMSF(35 ug/ml),EDTA(0.3 mg/ml),Pepstatin(0.7 ug/ml),Leupeptin(0.5 ug/ml),Aprotinin(5 00unit/ml),目的：,保证蛋白质的生物活性,细胞内有许多种还原成分，一旦细胞破碎,由于和氧的接触以及稀释作用而使抗氧化,成分减少，导致许多蛋白质被氧化而失去活,性，如巯基蛋白,常用的还原剂,抗坏血酸,巯基乙醇(mercaptoethanol),二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT),蛋白质的环境因素,表面效应,温度,储存,四、离心去除细胞碎片,五、目标蛋白的纯化,1.盐析,(salting out),2.离子交换层析,3.凝胶过滤层析,4.亲和,层析,蛋白质的检测和鉴定,光谱学特性,190,200 nm,230,300 nm,电泳检测,SDS-PAGE,IEF,分子量测定,凝胶过滤层析,沉降平衡超速离心,动态弹性光散射,孔径梯度电泳,质谱,氨基酸序列测定,用抗体检测蛋白质,蛋白质免疫印迹,免疫共沉淀,一类是测定,溶液中蛋白质分子的结构,如核磁共振,(NMR),、圆二色谱法、激光拉曼光谱法、荧光光谱法、紫外差光谱法以及氢同位素交换法,另一类是测定,晶体蛋白质的分子结构,如,X,射线衍射,分析法、小角中子衍射法,蛋白质空间结构分析,蛋白质分子的生物学功能研究,基因敲除技术,细胞转染技术,酵母双杂交系统,蛋白质研究的发展趋势,一、单个蛋白质到所有蛋白质,全方位生物学，高通量研究,1.,蛋白质组学,一种细胞或一种组织在某种状态条件下所有蛋白质的定性和定量分析的研究思路。,2.,蛋白质芯片技术,二、从统计行为到单个分子行为,三、从体外活性到体内功能,每一种蛋白质至少都有一种构象在生理条件下是稳定的，并具有生物活性，这种构象称为蛋白质的天然构象。,蛋白质的天然折叠决定于,3,个因素,1.,蛋白质的氨基酸序列,2.,与溶剂分子,(,一般是水,),的相互作用,3.,溶剂的,pH,和离子组成,蛋白质结构的基础,一、蛋白质的天然构象,二、稳定蛋白质三维结构的作用力,a,离子键,b,氢键,c,疏水键,d,范德华引力,三、多肽主链的空间限制,(,一,),酰胺平面与,-,碳原子的二面角,(,和,)(,二,),可允许的,和,值：拉氏构象图,二面角,(,和,),所规定的构象能否存在取决于两个相邻肽单位中非共价键合原子之间的接近有无阻碍。,（四）二级结构：多肽链折叠的规则方式,二级结构：是指多肽链借助主链基团,（CO.HN）,形成氢键排列成有规则的构象。,螺旋、折叠片层、转角和无规则卷曲。,四、二级结构：多肽链折叠的规则方式,(一)-螺旋,1950年美国Pauling等人在研究纤维状蛋白质时，提出了-螺旋，后来发现在球状蛋白质分子中也存在-螺旋。,-螺旋结构要点：,蛋白质多肽链像螺旋一样盘曲上升，每3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈，每圈螺旋的高度为0.54nm，每个残基沿轴向高度0.15nm，螺旋上升时，每个残基沿轴旋转100。,在同一肽链内相邻的螺圈之间形成氢链。,-螺旋有右手螺旋和左手螺旋之分，天然蛋白质绝大部分是右手螺旋，到目前为止仅在嗜热菌蛋白酶中发现了一段左手螺旋。,-螺旋的稳定性主要靠氢键来维持。,四、二级结构：多肽链折叠的规则方式,影响-螺旋形成的因素,一些侧链基团虽然不参与螺旋，但可影响,-,螺旋的稳定性。,在多肽链中连续的出现,带同种电荷的极性氨基酸,，,-,螺旋就不稳定。（,Lys,、,Glu,）,在多肽链中只要出现,pro,，,-,螺旋就被中断，产生一个弯曲（,bend,）或结节（,kink,）。,Gly,的,R,基太小，难以形成,-,螺旋所需的两面角，所以和,Pro,一样也是螺旋的最大破坏者。,肽链中连续出现带,庞大侧链,的氨基酸如,Ile,，由于空间位阻，也难以形成,-,螺旋。,四、二级结构：多肽链折叠片的规则方式,(二)-折叠片,也是pauling等人提出来的，,它是与-螺旋完全不同的一种结构。,-折叠主链骨架以一定的折叠形式形成一个折叠的片层。,碳原子位于折叠线上，在两条相邻的肽链之间形成氢链。,四、二级结构：多肽链折叠的规则方式,(二)-折叠片,-,折叠有平行和反平行的两种形式,:,平行的,-,折叠疏水侧链位于平面的两侧，反平行时疏水侧链位于平面的同一侧。,四、二级结构：多肽链折叠的规则方式,(三)-转角(-turn),-转角是指蛋白质的分子的多肽链经常出现180的回折，在回折角上的结构就称-转角，也称发夹结构，或称U形转折。由第一个氨基酸残基的C=O与第四个氨基酸残基的NH之间形成氢键。,四、二级结构：多肽链折叠的规则方式,(四)无规卷曲,无规卷曲是指没有规律性的肽链结构，但许多蛋白质的功能部位常常埋伏在这里。,四、二级结构：多肽链折叠的规则方式,环,存在于球状蛋白质中的一种新的二级结构，这种结构的形状象希腊字，所以称环。环特征：1、由不超过16个残基(最常见的是由68个残基)组成的肽段；2、这个肽段改变了蛋白质肽链的走向，构成环的首尾两个残基间的距离小于1nm。,五、纤维状蛋白质,分布,在动物,(,脊椎动物和无脊椎动物,),体内存在大量纤维状蛋白质。,功能,为结构蛋白，纤维状蛋白质是动物体的基本支架和外保护成分。,含量,占脊椎动物体内蛋白质总量的一半以上。,形状,外形呈纤维状或细棒状。,分类,不溶性,(,硬蛋白,),和可溶性两类,不溶性纤维状蛋白,角蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白,可溶性纤维状蛋白,肌球蛋白和血纤蛋白原,五、纤维状蛋白质,角蛋白,(keratin),来源于外胚层细胞，是外胚层细胞的结构蛋白质。,角蛋白包括皮肤以及皮肤的衍生物：发、毛、鳞、羽、翮,(h,鸟翎的茎,),、甲、蹄、角、爪、啄等。,角蛋白可分为,-,角蛋白和,-,角蛋白两类。,(一)-角蛋白,五、纤维状蛋白质,丝心蛋白,(fibroin),是蚕丝和蜘蛛丝的一种蛋白质。,丝心蛋白的性能,丝心蛋白具有抗张强度高，质地柔软的特性。具有,0.7nm,的周期。,丝心蛋白的构象,丝心蛋白是典型的,反平行,折叠片,，多肽链取锯齿状折叠构象。侧链交替地分布在折叠片的两侧。反平行,折叠片以平行的方式堆积成多层结构。链间主要氢键连接，层间主要靠范德华力维系。,(二)丝心蛋白和其他-角蛋白：-折叠片蛋白质,五、纤维状蛋白质,(三)胶原蛋白：一种三股螺旋,五、纤维状蛋白质,(四)弹性蛋白,弹性蛋白,(elastin),是结缔组织中的另一种蛋白质。它的最重要性质就是弹性，因此得名。,弹性蛋白使肺、血管特别是大动脉管以及韧带等具有伸展性。弹性蛋白与胶原蛋白的不同点,弹性蛋白只有一个基因，胶原蛋白每种亚基都有自己的基因；弹性蛋白富含,Gly,、,Ala,、,Val,和,Pro,。,弹性蛋白是由可溶性单体合成的，它是弹性蛋白纤维的基本单位，称原弹性蛋白。,Lys,的赖氨酰氧化酶的催化氧化脱氨成醛基，,3,个这样,Lys,和未被修饰的,Lys,形成类,吡啶啉,锁链素和异锁链素交联体。使原弹性蛋白交联成网。,五、纤维状蛋白质,(四)弹性蛋白,六、超二级结构和结构域,(一)超二级结构,由若干个相邻的二级结构元件组合在一起，彼此相互作用，形成种类不多的、有规则的二级结构组合或二级结构串，在多种蛋白质中充当三级结构的构件，称为超二级结构。,六、超二级结构和结构域,(二)结构域,（Structural domain,domain）,多肽链在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是独立的紧密球状实体称为结构域。,铁氧还蛋白（一个结构域）,功能域（酵母已糖激酶2个结构域）,六、超二级结构和结构域,(二)结构域,（Structural domain,domain）,(2)多肽链折叠中的手性效应,发夹,右手,左手,右手,左手,六、超二级结构和结构域,(二)结构域,（Structural domain,domain）,(2)多肽链折叠中的手性效应,马鞍形扭曲片,平行,桶,六、超二级结构和结构域,(二)结构域,（Structural domain,domain）,(3)结构域类型,反平行,螺旋结构域,(,全,结构,),平行或混合型,折叠片结构域,(,结构,),反平行,折叠片结构域,(,全,结构,),富含金属或二硫键结构域,七、球状蛋白质与三级结构,(,一,),球状蛋白质的分类,1.,全,结构,(,反平行,螺旋,),蛋白质,2.,结构,(,平行或混合型,折叠片,),蛋白质,3.,全,结构,(,反平行,折叠片,),蛋白质,4.,富含金属或二硫键（小的不规则）蛋白质,七、球状蛋白质与三级结构,(,二,),球状蛋白质三维结构的特征,1.,蛋白质分子含多种二级结构元件,2.,三维结构具有明显的折叠层次,3.,分子是紧密的球状或椭球状实体,4.,疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面,5.,球状蛋白质分子的表面有一个空穴,八、膜蛋白的结构,膜蛋白是膜的功能分子,膜蛋白质与纤维状蛋白质及球状蛋白质结构不同,膜蛋白质可分为膜周边蛋白质和膜内在蛋白质,膜周边蛋白质,(peripheral protein),实际上属于可溶性球状蛋白质，它们分布在膜双脂层的表面，主要通过与膜内在蛋白质的静电相互作用和氢键键合相互作用与膜结合。,膜内在蛋白质,(integral protein,）,是与脂双层强缔合的膜蛋白。它们有的一部分或大部分埋入脂双层，有的横跨脂双层。,脂锚定蛋白质（,lipid anchored protin,）,这些蛋白质与膜的缔合是通过各种共价连接的脂锚钩实现的。,八、膜蛋白的结构,（一）膜内在蛋白质,1.,具有单个跨膜肽段的膜蛋白,人血型糖蛋白,人白细胞结合蛋白,八、膜蛋白的结构,（一）膜内在蛋白质,2.,具有,7,个跨膜肽段的膜蛋白（,G,蛋白偶联受体）,细菌的紫膜质,八、膜蛋白的结构,（一）膜内在蛋白质,3.,桶型膜蛋白膜孔蛋白,麦芽糖膜孔蛋白,八、膜蛋白的结构,（二）脂锚定膜蛋白,1.,酰胺连接的豆蔻酰锚钩,2.,硫酯连接的脂肪酰锚钩：,3.,硫醚连接的异戊二烯锚钩：,4.,糖基磷脂酰肌醇锚钩,八、膜蛋白的结构,（二）脂锚定膜蛋白,1.,酰胺连接的豆蔻酰锚钩：,cAMP,依赖性蛋白激酶催化亚基，,HIV,1,的,gag,蛋白等,八、膜蛋白的结构,（二）脂锚定膜蛋白,2.,硫酯连接的脂肪酰锚钩：,转铁蛋白受体、某些病毒的表面糖蛋白受体等,八、膜蛋白的结构,（二）脂锚定膜蛋白,3.,硫醚连接的异戊二烯锚钩：,酵母交配因子，核纤蛋白等,八、膜蛋白的结构,（二）脂锚定膜蛋白,4.,糖基磷脂酰肌醇锚钩：,真核生物细胞表面抗原。粘着分子和细胞表面水解酶，原核中未见。,九、蛋白质折叠和结构预测,(,一,),蛋白质的变性,物理因素：热紫外线照射、高压、微波和表面张力等。,化学因素：有机溶剂、脲、胍、酸和碱等,生物活性的丧失；内部的侧链暴露；物理化学性质发生改变；生物化学性质发生改变，易被酶水解等。,变性剂：,脲素和盐酸胍；十二烷基磺酸钠（SDS）。,九、蛋白质折叠和结构预测,(,二,),氨基酸序列规定蛋白质的三维结构,1.,核糖核酸酶的变性与复性实验,2.,二硫桥在稳定蛋白质构象中的作用,九、蛋白质折叠和结构预测,(,三,),蛋白质折叠,1.,蛋白质折叠不是通过随机搜索找到自由能最低的构象,2.,用于研究折叠中间体的一些方法,3.,蛋白质折叠经过熔球态的中间体阶段,4.,体内蛋白质折叠有异构酶和伴侣蛋白质参加,二硫键异构酶（,PDI,）,分子伴侣（,Molecular Chaperone,）,Hsp70,蛋白,ATP,酶结构域和肽结合结构域,九、蛋白质折叠和结构预测,图5-46,(,一,),蛋白质的变性,(,二,),氨基酸序列规定蛋白质的三维结构,1.,核糖核酸酶的变性与复性实验,2.,二硫桥在稳定蛋白质构象中的作用,(,三,),蛋白质折叠的热力学,(,四,),蛋白质折叠的动力学,1.,蛋白质折叠不是通过随机搜索找到自由能最低的构象,2.,用于研究折叠中间体的一些方法,3.,蛋白质折叠经过熔球态的中间体阶段,4.,体内蛋白质折叠有异构酶和伴侣蛋白质参加,(五)蛋白质结构的预测,1.二级结构的预测,Glu、Met、Ala、Leu在,螺旋中出现频率高,。Gly、Pro、Ser、Thr、Asn、Ile,不利于,螺旋的形成,；,Gly、Pro在,转角中很高。,Val、Ile 及芳香族氨基酸在,折叠片中频率高,。而Asp、Glu、和Pro则很,低,。,Chou和Fasman二级结构预测的经验规则：,（残基倾向性因子）P,i,=A,i,/T,i,(1),螺旋预测：4/64,P,1.03,P,P,(2),折叠预测：3/5 4,(3),转角预测：P,t,1.0,P,和,P,其他预测法：GOR算法，多序列列线预测，基于神经网络的序列预测，混合方法等。,2.三级结构的预测折叠的计算机模拟,九、蛋白质折叠和结构预测,十、亚基缔合和四级结构,图5-46,(,一,),蛋白质的变性,(,二,),氨基酸序列规定蛋白质的三维结构,1.,核糖核酸酶的变性与复性实验,2.,二硫桥在稳定蛋白质构象中的作用,(,三,),蛋白质折叠的热力学,(,四,),蛋白质折叠的动力学,1.,蛋白质折叠不是通过随机搜索找到自由能最低的构象,2.,用于研究折叠中间体的一些方法,3.,蛋白质折叠经过熔球态的中间体阶段,4.,体内蛋白质折叠有异构酶和伴侣蛋白质参加,(一)有关四级结构的一些概念,蛋白质的四级结构,球状蛋白质通过非共价键彼此缔合在一起，形成的聚集体，就是蛋白质的四级结构。,亚基或单体,四级结构的蛋白质中每个球状蛋白质称为亚基，有时也称单体(monomer)。亚基一般是一条多肽链。,寡聚蛋白质,由两个或两个以上亚基组成的蛋白质统称为寡聚蛋白质。很多酶和转运蛋白质是寡聚蛋白质。,单体蛋白质,仅由一个亚基组成并因此无四级结构的蛋白质称为单体蛋白质,如核糖核酸酶等。,同多聚蛋白质,由单一类型亚基组成的蛋白质称同多聚,(homomultimeric),蛋白质。如肝乙醇脱氢酶(,2,),十、亚基缔合和四级结构,图5-46,(,一,),蛋白质的变性,(,二,),氨基酸序列规定蛋白质的三维结构,1.,核糖核酸酶的变性与复性实验,2.,二硫桥在稳定蛋白质构象中的作用,(,三,),蛋白质折叠的热力学,(,四,),蛋白质折叠的动力学,1.,蛋白质折叠不是通过随机搜索找到自由能最低的构象,2.,用于研究折叠中间体的一些方法,3.,蛋白质折叠经过熔球态的中间体阶段,4.,体内蛋白质折叠有异构酶和伴侣蛋白质参加,(一)有关四级结构的一些概念,杂多聚蛋白质,由几种不同类型的亚基组成的蛋白质称杂多聚（heteromultimeric）蛋白质。如血红蛋白(,2,2,)、天冬氨酸转甲酰酶(r,6,c,6,)等。,对称寡聚蛋白质,可视为由两个或多个不对称的相同结构成分组成，这种相同结构成分被称为原聚体或原体(protomer)。同多聚蛋白质中原体就是亚基，但是杂多聚蛋白质中原体由两种或多种不同的亚基组成。如血红蛋白(,2,2,)的原体是。因此把原体看作单体，血红蛋白为二聚体，亚基为单体，血红蛋白是四聚体。,蛋白质四级结构内容,亚基种类和数目以及各亚基或原聚体在整个分子中的空间排布，包括亚基间的接触位点和作用力。大多数寡聚蛋白质分子中亚基数目为偶数，其中以2个和4个为主。个别的为奇数。如荧光素酶分子含3个亚基。,十、亚基缔合和四级结构,(二)四级缔合的驱动力,范德华引力、氢键、离子键、,疏水作用,、二硫桥,(三)亚基相互作用的方式,(极性基团间的氢键和离子键;相同亚基的同种缔合和异种缔合),(四)四级结构的对称性,对称性是四级结构蛋白质最重要的性质之一,对称性,：空间对称性，时间对称性，置换对称性，联合变换对称等,对称操作,:,如果一个操作能使某体系从一个状态变换到另一个与之等价的状态，即体系的状态在此操作下保持不变，则该体系对这一操作对称，这一操作称为该体系的一个对称操作,。旋转操作，反映操作。,对称元素,：蛋白质聚集体结构的对称元素只有旋转轴。,基转角(,)，2,/,=n，,n-重对称轴,十、亚基缔合和四级结构,(,四,),四级结构的对称性,点群对称：,如果一个物体的所有对称元素都相交于一个不为任何对称操作所改变的固定点，则称该物体具有点群对称。环状对称,(,C,n,),，高级点群对称（二面体点群对称和立方体点群对称）。,二面体对称,：如果寡聚蛋白质含有一个,C,n,旋转轴，并且在一个垂直该旋转轴的平面内存在着,n,个与该轴相交的,C,2,轴，则称它为具有二面体对称,(,D,n,),。,十、亚基缔合和四级结构,(,四,),四级结构的对称性,立方体点群对称：,四面体、八面体和二十面体等,十、亚基缔合和四级结构,(,四,),四级结构的对称性,螺旋对称和平移对称,十、亚基缔合和四级结构,平移对称聚集体（微管的原纤丝）,(五)四级缔合在结构和功能上的优越性,1.增强结构稳定性：,面积与体积比降低,2.提高遗传经济性和效率,3.使催化基团汇集在一起：,细菌谷氨酰胺合成酶，,色氨酸合成酶(,2,2,)。,4.具有协同性和别构效应,十、亚基缔合和四级结构,