课题1--菊花的组织培养.ppt

单击此处编辑标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,专题,3,植物的组织培养技术,通过必修课的学习，我们已经了解到大多绿色开花植物都是靠种子来繁殖的。那么，有没有不用种子来培育植物的方法呢？,营养繁殖,扦插,嫁接,压条,【,知识回顾,】,扦插,嫁接,压条,压条,植物组织培养是二十世纪发展起来的新技术，近三十年来由于组织培养基础理论研究的深入，发展极为迅速，发表的文献浩如烟海，几乎以植物为研究对象的各个分支学科都在广泛进行组织培养。,植物组织培养简介,除此以外还有没有其它无性繁殖的方法呢？,组织培养,那么，,1,、什么是植物的组织培养？,组织培养：,是指离体的植物器官、组织或细胞脱分化、再分化成完整植物体的过程。,你听说过袖珍马铃薯吗？,为什么当年从市场上买回家的菊花开放非常美丽、花瓣长、花朵大、花期特别长？,因为市场上销售的菊花多半是当年用菊花植株的幼嫩茎扦插培育而形成，感染的病毒少，几乎不影响菊花的生命活动。,从第二年开始为什么菊花的花瓣、花期逐渐缩短，花朵与杭白菊相似？,随着种植时间的延长，菊花感染的病毒增多，严重影响了菊花的生命活动。,2,、植物组织培养技术有哪些方面的应用,?,（,P,31,）,实现优良品种的,快速繁殖；,培育,脱毒,作物；,制作,人工种子,；,培育作物,新品种,以及细胞产物的,工厂化生产,等。,如：,培养紫草愈伤组织,提取紫草素,（治疗烫伤和割伤的药物以及染料和化妆品的原料）。,人工种子,课题,1,菊花的组织培养,一、,基础知识,(,一,),、植物组织培养的基本过程,1,、细胞的分化,概念：,在个体发育中，细胞在,形态,、,结构,、,生理功能,上发生,稳定性差异,的过程。,过程：,【,举例,】,受精卵增殖、生长、分化形成组织、器官和系统。,特点,稳定性：,不可逆性：,持久性：,原因：,基因在,特定的时间,和,空间条件,下的,选择性表达,的结果。,2,、细胞的,全能性,定义：,生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能的特性。,原因：,（物质基础）,生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的,全套遗传物质,，都有发育成为完整个体所必需的,全部基因,。,高度特化的,动物细胞,，从整个细胞来说，全能性受到限制。但它的,细胞核仍然保持着全能性,，这是因为细胞核内含有该物种遗传性所需要的遗传物质。,已分化的植物细胞，仍具有全能性。,实例,受精卵,生殖细胞,体细胞,全能性大小的比较,:,4,、植物组织培养的原理是,什么？,植物细胞具有,全能性,。,5,、植物组织培养的流程图：,3,、植物组织培养的必要条件,：,细胞离体,一定的营养物质、激素和其他外界条件,脱分化,再分化,植物组织培养过程,离体的植物器官、组织、细胞,愈伤组织,根,芽,植,物,体,【,提问,】,什么是脱分化、再分化？,脱分化：,由,高度分化,的植物组织或细胞产生,愈伤组织,的过程，又叫去分化。,再分化：,脱分化产生的,愈伤组织,继续进行培养，又可以,重新分化成根或芽,等器官的过程。,【,注意,】,培养完整的试管苗，必须先进行,生芽培养,，再进行,生根培养,。,愈伤组织（,呈乳白色或黄色的瘤状物,）,愈伤组织有何特点？,愈伤组织是通过,细胞分裂,形成的，其细胞,排列疏松而无规则,，是一种,高度液泡化,的呈,无定形状态,的,薄壁细胞,。,人参的愈伤组织,菠萝的愈伤组织,（二）影响植物组织培养的因素（阅读,P,33,）,(1),不同的植物组织，培养的难易程度差别很大。,(2),同一植物的不同材料，其材料的年龄、保存时间的长短等也会影响实验结果。,(3),适宜的培养基。常用的培养基是,MS,培养基，,其主要成分包括,大量元素,、,微量元素,和,有机物,，常常需要添加,植物激素,(,而,不是必须,),。,A,、大量元素,:,N,、,P,、,K,、,Ca,、,Mg,、,S,等；,B,、微量元素,:,B,、,Mn,、,Cu,、,Zn,、,Fe,、,Mo,、,I,、,Co,等,；,C,、有机物,:,如甘氨酸、烟酸、肌醇、维,生素，蔗糖等。,菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝,(4),环境条件：,pH,、,温度,、,光照等。（举例）,菊花的组织培养，一般将,pH,控制在,5.8,左右，温度控制在,18,22,。,C,每日用日光灯照射,12h,。,(5),植物激素：常用的植物激素有生长素、细胞分裂素和赤霉素等。,【,举例,】,（,P,33,右中）,植物激素的浓度、使用的先后顺序以及用量的比例等，都会影响实验结果。,【,注意,】,生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。,A,、,生长素与细胞分裂素使用顺序对实验结果的影响,使用顺序,实验结果,先使用生长素，后使用细胞分裂素,有利于细胞分裂，但细胞不分化,先使用细胞分裂素，后使用生长素,细胞既分裂也分化,同 时 使 用,分化频率提高,B,、生长素与细胞分裂素用量比例影响植物的发育方向,比例适中,生长素多于细胞分裂素,生长素少于细胞分裂素,使用的量及比例,实验结果,促进愈伤组织的生长,有利于根的分化，抑制芽的形成,有利于芽的分化，抑制根的形成,【,思考,】,生长素和细胞分裂素同时使用时是如何促进分化的呢？,【,小结,】,离体组织或细胞,植物体,脱分化,细胞分裂素生长素,愈伤组织,芽,根,细胞分裂素,生长素,细胞分裂素,生长素,再分化,植物细胞培养,不需要光,需要光,你能说出各种营养物质的作用吗？同专题,2,中微生物培养基的配方相比，,MS,培养基的配方有哪些明显的不同？,旁栏思考,微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的,无机盐,；,蔗糖,提供,碳源和能源,，同时能够维持细胞的,渗透压,；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。,微生物培养基,以,有机营养,为主。与微生物的培养不同，,MS,培养基,则需提供,大量无机营养,，无机盐混合物包括植物生长必须的,大量元素和微量元素,两大类。,二、实验操作,制备,MS,固体培养基,外植体消毒,接,种,培,养,移,栽,栽,培,MS,培养基配制方法表,（一）制备,MS,固体培养基,（实验室一般使用,4,0,C,保存的配制好的,培养基母液,制备）,二、实验操作,（一）制备,MS,固体培养基,MS,培养基包括,20,多种营养成分，实验室一般使用,4,。,C,保存配制好的培养基母液来制备,1,、配置各种母液,为了避免每次配制培养基都要称量几十种成分，减少工作量，可以将各种成分按比例配置成浓缩液，即培养基母液，一般将常用药品配成比所需浓度高,10,100,倍的母液。使用时，根据浓缩比例计算用量，加水稀释,无机物中大量元素浓缩,10,倍，微量元素浓缩,100,倍，常温保存,激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按,1mg/ml,的质量浓度单独配制成母液,用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量,2,、配置培养基,分装到锥形瓶中，每瓶分装,50ml,或,100ml,配制培养液,配制,1LMS,培养基，先将称好的琼脂加,800ml,蒸馏水，加热使琼脂溶化，然后加入蔗糖,30g,，取配制好的大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液，依次加入，加蒸馏水定容至,1000ml,调,PH,培养基的分装,由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素,3,、灭菌,分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌,1,选材：,菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝。,（二）外植体消毒：,2,消毒：,流水冲洗：,菊花茎段用,流水冲洗,后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗,20min,左右,。,酒精处理：,用,无菌吸水纸,吸干外植体表面的水分，放,入,体积分数为,70,的酒精,中摇动,2,3,次，,持续,6,7s,，立即将外植体取出，在,无菌水,中清洗。,消毒液处理：,取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入,质量分数为,0.1,的氯化汞溶液,中,1,2min,，取出后，在,无菌水,中至少清洗,3,次，漂净消毒液。,（三）接种,污染的主要来源是空气中的,细菌和孢子,，接种室消毒是至关重要的。用,70,的酒精,喷雾使空气消毒，酒精或新洁尔灭搽洗,工作台,并用,紫外线照射,20,分钟,。,1,、接种室消毒,2,、无菌操作要求,操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。,先用肥皂洗手，穿上工作服，戴上口罩和工作帽。,放入培养瓶和灭菌后的接种用具,(,镊子、解剖刀、接种针,),，把镊子、解剖刀、接种针插入内盛,70%,酒精的广口瓶中。,3,、过程：,小心打开三角瓶，把花茎插入培养基。,（,将形态学下端插入,）,用记号笔在瓶壁上写明,培养材料,、,培养基代号,、,接种日期,。,4,、接种注意事项,每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为,70,的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种,外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜,3,4,块，菊的茎或叶,6,8,块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件,插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分,思考,：,你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？,答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。,（四）培养,接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养。培养期间应定期消毒温度控制在,，并且,每日照光小时,.,观察记录生长情况，并照相存档。,【,注意,】,培养期间应定期消毒。,（六）移栽,（五）栽培,用流水清洗根部的将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间。,待幼苗长壮后再移栽到土壤中。,珍珠岩,：,珍珠岩是一种火山喷发的酸性熔岩，经急剧冷却而成的玻璃质岩石，有弧形或圆形裂隙，如珍珠的结构，所以被命名为珍珠岩。,蛭石：,是一种天然、无毒的矿物质，在高温作用下会膨胀的矿物。它是一种比较少见的矿物，属于硅酸盐。,2,、外植体在培养过程中可能会被污染，你认为造成污染的原因有哪些？,外植体消毒不彻底；培养基灭菌不彻底；接种中被杂菌污染；锥形瓶密封性差等。,1,、在外植体消毒过程中，是不是强度越大越好，为什么？,不是。对外植体进行表面消毒时，既要考虑到药剂的,消毒效果,，又要考虑到植物的,耐受力,。,【,思考,】,三、结果分析与评价,（一）对接种操作中污染情况的分析,接种,3,4 d,后，在接种操作中被杂菌污染的培养物会表现出被污染的现象。请学生适时统计污染率，分析接种操作是否符合无菌要求。,分析原因：一般情况下，,细菌污染,可能是由接种人员造成的，如未戴口罩、接种时说话或手及器械消毒不严等；,真菌污染,可能是植物材料灭菌不当。,（二）是否完成了对植物组织的脱分化和再分化,观察实验结果，看看是否培养出了愈伤组织，记录多长时间长出愈伤组织；统计更换培养基后愈伤组织进一步分化成根和芽的比例和时间。,（三）是否进行了统计、对照与记录,做好统计和对照，填好结果记录表，培养严谨的科学态度。从实验的第一步开始就要求做好实验记录，实验小组配制不同培养基，如诱导愈伤或直接分化丛芽的培养基，然后做不同配方的比较。,（四）生根苗的移栽是否合格,生根苗移栽技术的,关键,是既要充分清洗根系表面的培养基，又不能伤及根系。,一般使用,无土栽培,的办法。,培养基质要,提前消毒,。可以向培养基质喷洒质量分数为,5%,的高锰酸钾，并用塑料薄膜覆盖,12 h,。掀开塑料薄膜后,24 h,才能移栽。,新移栽的组培苗要在,温室过渡几天,，等,壮苗后,再定植大田或进行盆栽。,学生可以在课后统计自己移栽的成活率，看看移栽是否合格。,四、课题延伸,1,、一般来说，容易进行,无性繁殖,的植物，也容易进行,组织培养,。,2,、实例：芦荟、豆瓣绿、秋海棠、月季。,本课题知识小结,人工种子：,诱导愈伤组织形成的,胚状体,，通过包裹,人工胚乳,和,人工种皮,，可以制成人工种子。,借助于组织培养生产人工种子，可以解决某些作物品种,繁殖力差、结子困难或发芽率低,等问题。,课后练习,（,P,36,）,植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，对培养条件的要求较高。用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长，如一些细菌、真菌等的生长。而培养物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此要进行严格的无菌操作。,外植体的生理状态是成功进行组织培养的重要条件之一。生长旺盛的嫩枝生理状况好，容易诱导脱分化和再分化。,在植物组织培养过程中，为什么要进行一系列的消毒，灭菌，并且要求无菌操作？,在选取菊花茎段的时候，为什么要选取生长旺盛的嫩枝？,21.,下图是植物组织培养的简略表示。据此回答：,练习,1,、下图是植物组织培养的简略表示。据此回答：,（,1,）表示,_,，它能被培养成为的根本原因是,_,。,（,2,）表示,_,，它与相比分化程度,_,，全能性,_,。,（,3,）若想制成人工种子，应选用,_,。,（,4,）若是花药，则是,_,，继续对其使用,_,处理可获得,_,正常植株，该过程称为,_,。,（,5,）若是胡萝卜根尖细胞，则培养成的叶片的颜色为,_,，这说明,_,。,（,6,）若利用此项技术制造治疗烫伤、割伤的药物,紫草素，培养将进行到,_,。,脱分化,再分化,离体的植物组织或器官,植物细胞具有全能性,愈伤组织,低,高,单倍体植株,秋水仙素,纯合体,单倍体育种,绿色,细胞含有表达叶绿体的基因,练习,2,、基因型为,AaBb,的水稻（含,24,条染色体）的花药通过无菌操作接入试管后，在一定条件下形成试管苗，问：,（,1,）愈伤组织是花粉细胞不断分裂后形成的不规则的细胞团，愈伤组织形成过程中，必须从培养基中获得,_,等营养物质。,（,2,）要促进花粉细胞分裂生长，培养基中应有,_,和,_,两类激素。,（,3,）愈伤组织分化是指愈伤组织形成芽和根，再由芽发育成叶和茎。这一过程必须给予光照，其原因是,_,能利用光能制造有机物，供试管苗生长发育。,（,4,）试管苗的细胞核中含,_,条脱氧核糖核苷酸链。,（,5,）培育成的试管苗可能出现的基因型有,_,。,水、无机盐、维生素和小分子有机物,细胞分裂素,植物生长素,叶绿体,24,AB,、,aB,、,Ab,、,ab,制备,MS,固体培养基,外植体消毒,接种,培养,移栽,栽培,四、实验操作,思考：高等植物是光能自养型生物，为什么在植物组织培养过程中还需要提供有机物培养基？,答案：,此时的组织或细胞为离体的，即细胞所生活的环境为液体有机物营养环境，而不是能体现其整个植物体的光能自养,冲洗,酒精,无菌水冲洗,氯化汞,无菌水冲洗至少三次之上,思考：培养过程中为什么需要进行光照？,答案：,在培养过程中，是脱分化、再分化的过程，随着芽和根的形成，就具有了自养的能力，是由细胞到一个个体的演变过程。,思考：在整个操作过程中，是如何来实现无菌环境的？,1,、培养基的灭菌；（高压蒸汽灭菌）,2,、外植体的消毒；（酒精、氯化汞）,3,、接种的无菌操作；（酒精、酒精灯,灼烧）,4,、无菌箱中的培养；,5,、移栽到消过毒的环境中生存一段时间。,方法：酶解法,在温和条件下，用纤维素酶、果胶酶分解,物理法：离心、振动、电刺激等,化学法：用聚乙二醇（,PEG,）等试剂作为诱导剂,包括膜融合和核融合,形成多种杂种细胞,AA,、,AB,、,BB,等,植物组织培养的过程,右图为植物体细胞杂交过程示意图。据图回答：（,1,）步骤是,，最常用的方法是,。（,2,）步骤一般常用的化学试剂是,，目的是,。,(3),在利用杂种细胞培育成为杂种植株的过程中，运用的技术手段是,，其中步骤相当于,，步骤相当于,。,（,4,）植物体细胞杂交的目的是获得新的杂种植株。使,能够在新的植物体上有所表现，其根本原因是,。,去掉细胞壁，分离原生质体,酶解法,聚乙二醇（,PEG,）,诱导植物原生质体融合,植物组织培养,脱分化,再分化,远缘杂交亲本的遗传特征,杂种植株获得双亲的遗传物质,（,5,）若远源杂交亲本,A,和,B,都是二倍体，则杂种植株为,倍体。,（,6,）从理论上讲，杂种植株的育性,。若运用传统有性杂交方法能否实现？,。,并说明现由,。,因此，这项研究对于培养作物新品种方面的重大意义在于,。,（,7,）利用植物体细胞杂交的方法培育作物新品种过程中，遗传物质的传递是否遵循孟德尔的遗传规律？为什么？,。,四,可育,不能,因为不同种生物之间存在生殖隔离,克服远缘杂交不亲和的障碍，大大,扩展了可用于杂交的亲本组合范围,不遵循。因为在生物进行有性生殖的过程中，才遵循,孟德尔的遗传规律，而植物体细胞杂交育种的过程不属于有性生殖,快速繁殖,植物组织培养技术有何意义？,特点：,稳定性：,细胞分化是稳定的，一般是不可逆转的。,全能性：,已分化的细胞，仍具有发育成完整 个体的潜能。,持久性：,是一种持久性的变化，它发生在生物体的整个生命过程中,在胚胎期达到最大限度。,1,、配制母液,按照,MS,培养基成分表,分别配制培养基的母液。,(1),大量元素母液,(10,倍液,),分别称取,10,倍用量的各种大量无机盐，依次溶解于大约,800ml,热的（,60-80,）蒸馏水中。（一种成分完全溶解后再加入下一种，最后加水，定容至,1000ml,后装入试剂瓶中，冰箱内贮存备用）。,(2),微量元素母液,(,100,倍液,),分别称取,100,倍用量的微量无机盐，依次溶解于,800ml,重蒸水中，加水定溶到,1000ml,。,(3),铁盐母液（,100,倍液,）,称取,100,倍用量的,Na,2,-EDTA(,乙二胺四乙酸钠,),和,FeSO,4,7H,2,O,，溶于,800ml,重蒸水中，最后定容到,1000ml,。,(4),有机物质母液,(,100,倍数,),分别称取,50,倍用量的各种有机物质，依次溶解于,400ml,重蒸水中，定容至,500ml,，装入棕色试剂瓶中，贮存冰箱备用。,(5),激素类、维生素类及用量较少的有机物一般可按,1mg/ml,的质量浓度,单独,配制成母液。,生长素,如,2,4-D,、,IAA,、,NAA,等。准确称取,20mg,，先用,2ml95%,乙醇溶解，然后加水，定容至,20ml,，浓度为,1mg/ml,，再放置冰箱内贮存备用。,细胞分裂素,如激动素,(Kt),、,6-,苄基嘌呤,(6-BA),。准确称取,20mg,，先用,2ml,的,1mol/ml HCL,或,NaOH,溶解，然后加水，定容至,20ml,，浓度为,1mg/ml,，再放置冰箱内贮存备用。,注意,:,配制培养基时，一定要注意调节,pH,。,(1),取,1000ml,烧杯一只，加大量元素,10,倍母液,100ml,，微量元素,100,倍母液,10ml,，铁盐,100,倍母液,10ml,有机物质,100,倍母液,10ml,。此外,根据培养材料和实验目的还要附加一定量的生长素,细胞分裂素及蔗糖等,然后加水至,1000ml,待蔗糖充分溶解后用,1mol/L,的,NaOH,或,HCl,调酸碱度为,pH5.8,最后加入琼脂粉,6.5g,如用琼脂条,则要加,8g,。,2.,培养基配制与分装：,(2),将盛有培养基的烧杯在电磁炉上，煮至琼脂完全融化，补加蒸馏水至,1000ml,。,将配制好的培养基分装到培养用三角瓶中，每只,100ml,三角瓶约装,40ml,培养基。,分装时要,避免把培养基倒在瓶口上，否则培养时容易引起杂菌污染,。,（,1,）把装好的培养基的三角瓶放入高压灭菌锅中，盖好锅盖。,（,2,）设置灭菌参数为,121,，,20min,，开始灭菌。,3,、灭菌（,高压蒸汽灭菌法,）,无菌技术是植物组织培养能否获得成功的关键。,