第二代测序数据分析原理.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二代测序数据分析原理,徐汪节,三代DNA测序技术之比较,第一代测序技术：Sanger测序法,第二代测序技术：454测序,第三代测序技术：？,直接测序法：？,10/20/2025,2,第一代测序技术：,Sanger测序法简便、快速,10/20/2025,3,逐渐被遗忘的测序技术：,Maxam-Gilbert的 DNA化学降解法,10/20/2025,4,Sanger测序的局限,通过几十年的改进，第1 代测序仪的读长可以超过1000bp，原始数据的准确率可以高达99.999%，测定每千碱基序列的成本是0.5 美元,每天的数据通量可以达到60万碱基。,但是，不管怎么改进，第1 代测序技术在速度和成本方面都已达到了极限（因为对电泳分离技术的依赖,使其难以进一步提升分析的速度和提高并行化程度，并且难以通过微型化降低测序成本）。,在此种情况下，第二代测序技术（Next-generation sequencing)应运而生。,10/20/2025,5,454,10/20/2025,8,SOLID,10/20/2025,9,Illumina,10/20/2025,10,其他,Polonator,Complete Genomics,10/20/2025,11,10/20/2025,12,第二代测序技术的共同点,1 将目标DNA剪切为小片段,2 单个小片段DNA分子结合到固相表面,3 单分子独立扩增,4 每次只复制一个碱基（A,C,T,G）并检测信号,5 高分辨率的成像系统,。,10/20/2025,13,第二代测序技术的局限,与第一代测序仪相比，以合成测序为基础的下一代测序平台速度显著提高，成本明显降低。每台设备每天产出千兆碱基的序列不足为奇。,但是,除了罗氏的454平台之外，读长短成了下一代测序平台的致命伤，这主要是由于DNA簇中存在的光学信号移相造成的。,而应运而生的单分子测序技术是解决这一问题的一种方法。,10/20/2025,14,第三代测序技术：单分子测序,Helicos Biosciences,VisiGen,Pacific Biosciences,Mobious Nexus I,10/20/2025,15,10/20/2025,16,直接测序法,在所有上述三 代测序技术中，序列都是在荧光或者化学发光物质的协助下，通过读取DNA 聚合酶或DNA 连接酶将碱基连接到DNA 链上过程中释放出的光学信号而间接确定的。,除了需要昂贵的光学监测系统，还要记录、存储并分析大量的光学图像，这都使仪器的复杂性和成本增加。依赖生物化学反应读取碱基序列更增加了试剂、耗材的使用，在目前测序成本中比例相当大。,直接读取序列信息，不使用化学试剂，对于进一步降低测序成本是非常可取的。为了实现这样的目标，目前就有很多人在研究纳米物理技术。在全球，许多公司和组织，如Agilent，DNA Electronics，IBM,NabSys，Oxford Nanopore Technologies，Sequenom 等都在进行纳米孔测序的开发，不同的只是采用的方法或策略。,10/20/2025,17,10/20/2025,18,10/20/2025,19,Second generation sequence,Roche 454 Metagenomics,De novo sequencing,RNA-seq,illumia Solexa De novo sequencing,Re-sequencing,RNA-seq,(ChromatinImmunoprecipitation，ChIP),Meth-seq,ABI SOLiD Re-sequencing,ChIP-seq,RNA-seq,Experiments,DNA-seq:de novo,resequencing,RNA-seq:mRNA,ncRNA,smRNA.,ChIP-seq:Chromatin ImmunoPrecipitation,Methyl-seq:methylated DNA(epigenome),主要的测序平台,基因组分析原理,转录组分析原理,分析策略的选择,Sequencing Glossary,Reads,.A collection of clones that over-sample the target genome.,Pair-en,d reads.,Sequence reads derived from both ends of a sequencing-library clone.,Mate-,pair reads.,Sequence reads derived from both ends of a mate-pair library clone which insert size is usually1kb.,Insert size.,The size of the clone-insert from which a clone-end pair is taken.,Contig.,The result of joining an overlapping collection of sequence reads.,Scaffold.,The result of connectiing non-overlapping contiges by using pir-end reads.,N50 size.,As applied to contigs or scaffolds,that size above which 50%od the assembled,全基因组de nove分析工具,分析所需工具,Bowtie software,-bowtie-tools,-softare,-tophat.cbcb.umd.edu/,Cufflinks software,-Cufflinks.cbcb.umd.edu/,CummeRbund software,-compbio.mit.edu/cummeRbund/,外显子组分析工具,主要的测序平台,基因组分析原理,转录组分析原理,分析策略的选择,常规分析,Transcripts quantification,Splicing sites discovery and quantification,Gene discovery,SNP/INDEL detection,Allele specific expression,UniGene,拼接,目的：将预处理后reads进行拼接，得到拼接结果。原理：应用 de Bruijn graph path 算法对reads进行denovo拼接；对上一步的拼接结果，再用Hamilton Path算法拼接。结果：UniGene序列，UniGene统计信息，序列长度分布图,3.,数据库注释,目的：对拼接得到的UniGene进行功能注释 原理：通过blast+算法将拼接得到的UniGene序列与数据库进行比对 结果：比对结果表格，物种分布统计和Evalue分布统计,UniGene,表达分析,目的：,UniGene,定量分析。原理：以,UniGene,为,reference,，分别将每个样本的,reads,进行,reference mapping,从而得到每个样本在每个,UniGenes,中的一个,reads,覆盖度，然后应用,RPKM/FPKM,标准化公式对富集片段的数量进行归一化。,RPKM,：,Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads,，公式下,:,UniGene,表达分布图，,1X,，,5X,分别为,FPKM=1,，,FPKM=5,分界点，可以大体观察到低表达，中表达以及高表达的比例关系,UniGene,样本间表达相关性散点图,样本间表达差异程度的,MA,图，可以体现差异表达总体偏差,UniGene,表达差异分析,目的：对定量结果进行统计检验分析，找出差异表达,UniGene,原理：双层过滤筛选差异基因,FC,值筛选：采用,Fold-change(FC),，表达差异倍数进行第一层此的差异基因筛选,FDR,检验：一般采用卡方检验中的,fisher,精确检验进行,p,值检验，采用,Benjamini FDR(False discovery ratio),校验方法对,p,值进行假阳性检验，即，通过,FDR,显著性参数进行第二层次的差异基因筛选。,组间差异基因上调与下调个数统计，可以通过此图观察上调与下调的一个总体趋势,差异基因火山图，可以观察到差异基因总体分布,GO,功能分类,目的：利用数据库注释信息将,UniGene,进行,GO,功能分类。原理：利用数据库的注释结果，应用,blast2GO,算法进行,GO,功能分类，得到所有序列在,Gene Ontology,的三大类：,molecular function,cellular component,biological process,的各个层次所占数目，一般取到,14,层。结果：,MF,，,BP,，,CC,三大分类结果文件以及,UniGene2GO,关系列表，三大类别中第二层次上的柱状分布图和饼图，,GO,功能的层次分布图。,KEGG,代谢通路分析,目的：对拼接得到 UniGene 进行 KEGG pathway 映射。原理：应用KEGG KAAS在线 pathway比对分析工具对拼接得到的UniGene进行KEGG映射分析。结果：标记的Pathway通路图。,IPA pathway analysis(UniGene 进行 COG功能分类。原理：利用blast+算法将拼接得到的UniGene与CDD库中的COG/KOG库进行比对，进行COG功能分类预测，将其映射到COG分类中。结果：COG分类分布情况图。,SSR,重复序列注释,目的：对拼接得到,UniGene,进行,SSR,简单重复序列的查找。原理：筛选标准：单核苷酸重复的次数在,10,次或,10,次以上，二核苷酸重复的次数在,6,次或,6,次以上，三至六核苷酸重复的次数在,5,次或,5,次以上。同时，也筛选中间被少数碱基,(,间隔小于,100,或等于,100),打断的不完全重复的,SSR,。结果：重复序列的信息文件以及统计文件。,LncRNA,预测,目的：对拼接得到的,UniGene,进行,LncRNA(Long noncoding RNA),预测。原理：通过以下过程对,UniGene,进行过滤，最终得到候选,LncRNA,序列。,1)Unigene length 200bp,；,2)Unigene ORF(Open Reading Frame)length 300,；,3),将满足长度条件的,UniGene,与多个近源物种进行进化分析，得到序列的保守性和进化特性；,4),根据上述的特性和已知数据库中,coding,、,noncoding,区域的特性建立编码筛选模型；,5),将符合,noncoding,模型的,UniGene,与,Pfam,等蛋白域数据库进行同源性比对，进一步去除可能的编码特性，最终得出,LncRNA,预测结果。,RSAM01,：模式动植物基因组数据和注释信息整合,RSAM07,：可变剪接分析,可变剪接体 与,Exon skipping junction,的识别,RSAM08,：转录起始位点（,TSS,）分析,TSS,类和转录起始位点模式的识别,（,1,）通过,tag,聚类方法将,5,端,read,进行聚类，识别出不同模式的,TSS,，例如下图所示：确定,cluster,的边界（黄色区,域）。,（,2,）每个,cluster,至少包含,100 reads,并统计这些,cluster,的定位和分布数量,（,3,）统计不同,TSS cluster,大小宽度分布，以及转录起始模式的识别,RSAM09.,融合基因的发现（,Fusion gene Discovery,）,RSAM10.,非长编码,RNA,与多外显子反义转录本的识别,图例 蛋白质编码效能分析(a，b)，进化保守性水平(c)与lincRNA 表达量，,多外显子反义转录本表达量(d)进行对比分析,RSAM11.,结构变异,SNV,识别与计算,RNAseq 是相对于全基因组测序相对廉价的探测SNV 变异体的策略。根据RNAseq 数据，我们采用探测算法准确地识别出SNV。,主要的测序平台,基因组分析原理,转录组分析原理,分析策略的选择,按照研究需求选择,实验需求分为：医疗、基础科研、问题方向等；,样本本身原因：样本量、分析难度、周期等,