组织培养细胞的生物学.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,组织培养细胞的生物学,第二章,Contents,细胞生存环境和代谢,附着底物,人工培养基,教学内容,1,2,3,5,体内、外细胞的差异和分化,体外培养细胞的分型,细胞相互关系,细胞系（株）的建立,8,7,6,4,3,组织培养细胞的生长和增殖过程,2025/10/20 周一,2,在个体发生过程中，细胞通过不断的生长和繁殖，数量增多，与此同时发生着分化。,分化：,及细胞在形态和功能上由一般发展到特殊的过程，由于分化的结果，形成了各种组织和器官。,一、体内、外细胞的差异和分化,2025/10/20 周一,3,因模拟的培养条件与体内实际情况仍有很大差异，易发生以下变化：,分化现象减少，形态和功能趋于单一，生存一定时间后衰退死亡或发生转化，变成有,无限生长能力,的,连续细胞系,或,恶性细胞系,。,如：腺细胞分泌机能丧失，肌细胞纤维细胞化。,原因：,细胞在人工培养以后，可能导致很多基因关闭，而导致分化 停止、功能丧失。,可以利用这一点，来研究基因表达和调控。,（一）差异,2025/10/20 周一,4,体外培养细胞分化能力并未完全丧失，只是因环境改变其分化表现和原体内不同。,如：体内：成纤维细胞、骨细胞胶原,体外：成纤维细胞、上皮细胞、神经细胞、,肿瘤细胞胶原。,如何揭示细胞分化的条件，阐明分化调控的机制是主要的。,（二）分化,2025/10/20 周一,5,据能否贴附在支持物上生长的性质，分：,2、悬浮型,(,ES,细胞，老鼠，初生培养；荧光，,DAPI,染色剂),1、贴附型,(心肌细胞，老鼠，初生培养),二、体外培养细胞的分型,2025/10/20 周一,6,起源于内、外胚层细胞。,如：皮肤表皮，消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等。,上皮细胞型,2、上皮细胞型,2025/10/20 周一,9,此型不稳定，有时难与其它细胞相区别。,游走细胞型,3、游走细胞型,2025/10/20 周一,10,除上述三型外，其它难以确定它们规律和形态的，统归为“多形细胞型”。如：神经组织的细胞。,多型细胞型,4、多形细胞型,2025/10/20 周一,11,培养细胞的形态受多种因素的影响，,如：温度，二氧化碳，酸、碱、密度等。,如：,Hela,细胞，本属上皮型，但过酸、过碱变成梭形。上皮细胞数量少时，,呈星形或三角形。,数量多时，呈上皮型。,它来源于美国的,Helen Lane，,她1951年死于子宫颈癌,2025/10/20 周一,12,培养时，不贴附与支持物上，而呈悬浮状态生长。,如：某些癌细胞、,白细胞。,其优点：,细胞生存空间大，,容许长时间生长，能,繁殖多量细胞，便于,做细胞代谢研究。,S180,细胞,（二）悬浮型,2025/10/20 周一,13,体外培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，需要分离出一部分细胞和更新营养液。这一过程称“,传代,”。,每次传代都要影响细胞生长过程。另外，体外生存期一般也不是无限的。,（一）,组织培养细胞生命期,（二）,组织培养细胞一代生长过程,（三）,细胞周期,三、组织培养细胞的生长和增殖过程,2025/10/20 周一,14,培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本相一致。大多生存一年左右，传3050代，相当150300个细胞周期，在全生存过程中大致经历以下三个阶段：,1、第,I,期-原代培养期（初代培养期）,从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，约14周。,与体内细胞性状相似，适宜进行疫苗制备、药物测试、移植等。,为保持二倍体体细胞性质，应在初代或传代后早期冰冻。,（一）组织培养细胞生命期,2025/10/20 周一,15,2、第,II,期-传代期,初代培养细胞一经传代后，便称做“细胞系”。,此期，是生命期中持续时间最长、细胞增殖旺盛，呈二倍体核型的细胞系称“二倍体细胞系”,3、第,III,期-衰退期,细胞仍然生存，但不增殖或增殖很慢，细胞形态轮廓增强，最后衰退死亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在不明原因的影响，细胞可能发生自发转化。标志之一，是,细胞获得不死性,即,持久性增殖能力,，这样的细胞群体称“,无限细胞系,”。,主要发生在,II,期,，核型大多变成,异倍体,，转化后的细胞,可能具有恶性性质,，也可能仅有不死性而无恶性。,（一）组织培养细胞生命期,2025/10/20 周一,16,初代培养 有限细胞系,无限细胞系,接种培养,第一次传代,传代,传代间隔,老化,死亡,转化,指数细胞数量,0 2 4 6 8 10 12 16 周,22 20 18 16 14 12 10 8 6,2025/10/20 周一,17,所有,体外培养细胞,，包括,初代培养,及,各种细胞系,，,当生长达到一定密度后，都需做,传代,处理。传代的频率或间隔与接种数量、细胞生物学性状以及营养液的性质等有关,。,细胞的“一代”,仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间。,如：某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代或倍增不同。在细胞一代中，细胞能倍增36次,（二）组织培养细胞一代生长过程,2025/10/20 周一,18,细胞传一代后，一般要经过以下,几个阶段：,1、游离期（悬浮期）,2、贴壁期,3、潜伏期,4、指数生长期,5、停止期,（二）组织培养细胞一代生长过程,来源：,人体肾脏,形态：,上皮细胞,生长特性：,贴壁,注释：,该细胞含腺病毒5,DNA,2025/10/20 周一,19,1、游离期（悬浮期）,细胞接种后，在培养液,中呈悬浮状态的阶段，,细胞胞质回缩，胞体,变成圆形。,（二）组织培养细胞一代生长过程,2025/10/20 周一,20,2、贴壁期：,细胞附着于支持物上。,原代细胞：,24,h,内贴壁。,连续细胞系：,530分钟贴壁。,单个细胞快于细胞团、组织块。,贴壁与许多因素有关：,培养基的酸度、污染，胶塞和培养器皿,的清洁度，细胞本身的活性,等等。,血清中有许多促使细胞贴壁的,冷析球蛋白（,CIG）,和纤粘素（,FN）,CIG,与多聚赖氨酸联用，有利于细胞迅速贴壁。,贴壁后细胞变成,放射延展细胞极性细胞,再经过一个潜伏期阶段后，才进入生长期。,细胞的贴壁和延展,（二）组织培养细胞一代生长过程,2025/10/20 周一,21,3、潜伏期：,此时，细胞有生长活动，而无细胞分裂。,原代细胞潜伏期：,2496,h,或更长。,连续细胞系、肿瘤细胞潜伏期短：,仅624,h。,潜伏期后，细胞分裂出现，并逐渐增多，进入指数生长期。,（二）组织培养细胞一代生长过程,2025/10/20 周一,22,4、指数生长期（对数生长期）,此时期，细胞增殖旺盛，细胞数成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。此阶段可用,细胞群体倍增时间,、,细胞分裂指数（,MI）,等来判断。,MI：,细胞群中每1000个细胞中的分裂细0.20.5%，连续细胞系、肿瘤细胞的,MI,可高达35%。持续35天，细胞数量增多，最后生长面积消失，细胞相互接触连接成片。此时，细胞由于相互接触而发生“,接触抑制,”。,表现为细胞扩展运动停止。保证细胞不重叠生长。肿瘤细胞无接触抑制特征，能相互重叠，向三维空间发展，只要原因充分，细胞仍能分裂、增多。正常细胞生长汇合成单层时，细胞达到一定密度，细胞停止分裂，这种现象称“,密度抑制,”。,导致细胞停止分裂。,（二）组织培养细胞一代生长过程,2025/10/20 周一,23,5、停止期：,数量已达饱和，停止增殖，但仍有代谢活动，营养枯竭，代谢产物积累，,PH,降低，细胞会中毒。通常，细胞长满瓶底,80%,时即,传代,，接种到23个新瓶中。,（二）组织培养细胞一代生长过程,2025/10/20 周一,24,2025/10/20 周一,25,是指细胞每一次增殖所经历的全过程。,每经过一个增殖周期，数量就增加一倍。,据细胞周期不同时期的生化特点，可划分为四个连续,的时期：,G,1,期（,DNA,合成前期）,细胞间期,S,期（,DNA,合成期）主要是,DNA,的复制。,G,2,期（,DNA,合成后期）,M,期（有丝分裂期）：完成染色体的分配。,细胞完成一次细胞周期所需要的时间称为-,“,细胞周期时间,”。,（三）细胞周期,2025/10/20 周一,26,S,期：,DNA,合成期,间期：是细胞代谢、,DNA,复制旺盛时期。,G1、G2：,两个间隙,有丝分裂：细胞核及其染色体分裂。,细胞分裂期：,胞质分裂：细胞质分裂成两个子细胞。,2025/10/20 周一,27,有丝分裂过程,2025/10/20 周一,28,细胞生长的速度与细胞周期时间有关。,正常细胞和肿瘤细胞相比较，细胞周期时间大致相接近的。如：,人的正常,肠上皮细胞,的细胞周期时间是：,13天,。,人的,结肠癌细胞,的细胞周期时间是：,2.5天,。,急性白细胞,的细胞周期时间是,24天。,正常,白细胞,的细胞周期时间是,1天。,所不同的是：,正常细胞,的增殖达到一定限度就停止了，而且增殖的细胞基本上相当于丢失的细胞数，总数始终保持,相对恒定。,肿瘤细胞,是以持续的,无限制增殖、永不停止,。,一般说来，哺乳动物的细胞周期为1030,h，,其中间期约10,h。,（三）细胞周期,2025/10/20 周一,29,在体外培养中，单个细胞也能生存和生长，有很大的独立性，但不是细胞永久存在的形式，不能长期生存，只有,群体细胞才是细胞的基本存在形式。,体外培养细胞间仍具有形态和功能的相互依存关系，细胞上仍有,桥粒、缝隙连接,，一旦两相邻细胞发生接触，便呈接触抑制现象，导致运动停止。,四、细胞相互关系,2025/10/20 周一,30,无污染环境,温度,气体环境和氢离子浓度,基本营养物质,促生长因子、激素,渗透压,五、细胞生存环境和代谢,2025/10/20 周一,31,（一）无污染环境,无菌、无毒,是保证细胞生存的首要条件。,（二）温度：,3537,0,C,3940,0,C,中1,h，,有一定损伤，但仍可以恢复。,4142,0,C,中1,h，,细胞严重损伤，但不致全部杀死，仍有可能恢复。,43,0,C,时，,很多细胞被杀死。,温度0,0,C：,能抑制细胞代谢，并无伤害作用。,4,0,C,数小时37,0,C,培养，,细胞仍能生长。,温度降至冰点以下,，细胞可因胞质结冰而死亡。,在培养液中加一定量,保护剂（二甲基亚砜或甘油）,，封入安瓿中后，冻于,液氮,中，,-196,0,C,，,能,长期贮存,，解冻后细胞复苏，仍能继续生长，细胞的生物性状不受任何影响，此为细胞保存的主要手段。,五、细胞生存环境和代谢,2025/10/20 周一,32,（三）气体环境和氢离子浓度,所需气体主要有,O,2,，CO,2,。,1、O,2,：,参与三羧酸循环，供能。缺,O,2,，,多数不能生长。一般，,95%空气,加,5%,CO,2,混合气体。,O,2,分压太高，对细胞也有毒害作用。,2、,CO,2,：,既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，与维持培养液的,PH,有直接关系。,大多数细胞,PH7.27.4，,但各种细胞对,PH,的要求也不完全相同。,原代细胞一般对,PH,变动耐受性差，无限细胞系耐受性强。,总的来说，细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸中更有利于生长。,如：原代羊水细胞，,PH6.8,时最适。,五、细胞生存环境和代谢,2025/10/20 周一,33,细胞在生长过程中，不断释放,CO,2,，,培养液变酸，为维持培养液中,PH,的恒定，最常用的方法是加,磷酸盐缓冲剂,其中，,NaHCO,3,CO,2,能调节,CO,2,的含量。,NaHCO,3,+H,2,ONa+HCO,3,-,+H,2,ONa,+,+H,2,CO,3,+OH,-,Na,+,+OH,-,+H,2,O+CO,2,。,CO,2,易于逸出，只适用于封闭式培养。,开瓶培养时，需在,5%,CO,2,气体环境中（,CO,2,培养箱）,。,为克服,Na HCO,3,的缺点，也可用,Hepes（,羟乙基派嗪乙硫磺酸）,它对细胞无毒性，是,具有较强缓冲能力的氢离子缓冲剂。,主要能稳定和抵抗快速,PH,变化。,其,最大优点：,开瓶通气观察也能维持,PH,值。,五、细胞生存环境和代谢,2025/10/20 周一,34,（四）基本营养物质,1、糖：,葡萄糖、核糖、丙酮酸。,2、12种基本氨基酸：,精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、,苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸、缬氨酸。,谷氨酰胺：,作为氮源、碳源，能促进各种氨基酸进入细胞。,3、维生素：,Vit A、D、E、K、B,族、,C。,4、,无机盐：,Fe,+,、Zn,+,、Cu,+,。,五、细胞生存环境和代谢,2025/10/20 周一,35,（五）促生长因子、激素,如：胰岛素-促进葡萄糖、氨基酸的吸收。,氢化可的松-细胞粘着，增殖。,（六）渗透压,7.6个大气压（5776,mmHg）=770KPa。,五、细胞生存环境和代谢,2025/10/20 周一,36,半固体培养基,按,物理性状,：,液体培养基,-最主要的。,按,来源分：,天然培养基：,合成培养基+血浆、血清、胎汁。,合成培养基：,据细胞所需的严格配制。,无血清培养基：,增添促细胞生长因子。,六、人工培养基,2025/10/20 周一,37,除少数悬浮型细胞外，绝大多数体外培养细胞需附着在,适宜的底物上,才能生长。,细胞贴附底物生长的性质,称“,锚着依赖性,”。,原则上讲，凡对细胞无毒性的物质，都可用作底物。但不同的细胞对底物的要求各异，底物不合适，细胞生长不良。,玻璃,一次性塑料,微载体,饲细胞（也称滋养细胞）,七、附着底物,2025/10/20 周一,38,（一）玻璃,是最常用的培养底物，透明、便于观察、洗涤，能反复使用，,质地以,中性玻璃,为上，适合于各种细胞附着生长。,缺点：,易破碎。,（二）一次性塑料,聚苯乙烯。,经加工处理，表面具有亲水性，,聚四氟乙烯。,七、附着底物,2025/10/20 周一,39,（三）微载体,由,聚苯乙烯,和,聚丙烯酰胺,制成的小球体，附着面大，有利于大量繁殖细胞。,天然葡萄糖聚合物（葡聚糖）,作载体，直径 50,um,或数百,um,不等，,如：微载体培养系统。,（四）饲细胞（也称滋养细胞）,可用,小鼠成纤维细胞,或,其它细胞,长成单层后，再用大剂量射线照射，使细胞失去增殖力，但还存活，仍能进行代谢活动，可支持其它细胞生长。,七、附着底物,2025/10/20 周一,40,（一）常用术语,1、细胞培养：,单个细胞在体外条件下的生长。,2、组织或器官培养：,是指组织、器官在体外的维持或生长，它们可以分化并保持原来的结构或功能。,3、外植块：,用于开始体外培养而切下的一小块组织或器官。,4、细胞系：,原代培养物经首次传代成功后即成,细胞系,。,如果细胞系不能继续传代或传代数有限-,有限细胞系,。,如果细胞系可连续传代-,连续细胞系,，,即已建成的细胞系。,八、细胞系（株）的建立,2025/10/20 周一,41,5、细胞一代时间,：,单个细胞两次连续分裂的时间间隔。,6、再培养：,单层细胞不经任何丢失而转移到新鲜培养基的过程。,7、原代培养：,从机体取得材料（细胞、组织或器官）在培养瓶内培养到第一次传代前，即为原代培养或初代培养。,8、传代培养或传代：,指将细胞从一个培养容器移植到另一培养容器中培养。,八、细胞系（株）的建立,2025/10/20 周一,42,（二）建立细胞系（株）的要求,限于初代培养的细胞，只要供体均一，取材部位及组织种类等条件稳定，则无须多项鉴定。,长期使用，特别是反复传代的细胞，有以下一些,要求：,1、组织来源,2、细胞生物学检测,3、培养条件和方法,八、细胞系（株）的建立,2025/10/20 周一,43,1、组织来源：,所属物种（人或动物）、性别、年龄、所取的器官组织等。,如系肿瘤组织，应说明临床和病理诊断、以及病理号。,2、细胞生物学检测：,如：细胞的一般形态、特异结构、细胞生长曲线、分裂指数、倍增指数、接种率等。,如为肿瘤细胞，应力求说明细胞确系来源于肿瘤组织。,3、培养条件和方法：,指明使用的培养基、血清种类、用量以及细胞生存的适宜,PH,值。,八、细胞系（株）的建立,2025/10/20 周一,44,再见,2025/10/20 周一,45,