微生物发酵产酶医学讲座课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,微生物发酵产酶医学讲座,*,微生物发酵产酶医学讲座,Contents of chapter 2,1、酶生物合成过程,2、常见产酶微生物,3、酶的发酵工艺条件及控制,4、酶生产过程的动力学,Go,Go,Go,Go,2,微生物发酵产酶医学讲座,酶的生产方法,提取分离法,(Extraction),生物合成,(Biosynthesis),化学合成,(chemicalsynthesis),SOD-blood,Papain-Papaya,Chymotrypsin-Pancrea,organ/tissue/cell,Amylase from Bacillus,Protease from Bacillus,Phosphatase from Bacillus,Glucoamylase from Aspergillus,Plant cell culture,Animal cell culture,Few example,3,微生物发酵产酶医学讲座,微生物发酵产酶,酶的发酵生产：,经过预先设计，通过人工操作，利用微生物的生命活动，获得所需的酶的技术过程。,大多数酶的生产采用发酵生产,原因：微生物具有种类多、繁殖快、易培养、代谢能力强等特点,4,微生物发酵产酶医学讲座,微生物发酵产酶,优良的产酶微生物具备的条件：,（1）酶的产量高；,（2）产酶稳定性好；,（3）容易培养和管理；,（4）利于酶的分离纯化；,（5）安全可靠、无毒性等。,5,微生物发酵产酶医学讲座,微生物发酵产酶,酶的发酵生产的方式：,固体培养发酵,液体深层发酵,固定化微生物细胞发酵,固定化微生物原生质体发酵,6,微生物发酵产酶医学讲座,微生物发酵产酶,酶生物合成的基本理论,蛋白类酶和核酸类酶酶的生物合成主要是指细胞内RNA和蛋白质的合成过程.,合成过程:,酶的基因（DNA）（转录）RNA（翻译）多肽链（加工、组装）蛋白质,7,微生物发酵产酶医学讲座,酶生物合成过程 The biosynthesis process of Enzyme,1、中心法则-Central Dogma,2、RNA的生物合成-Transcription,3、蛋白质的生物合成-Translation,4、酶生物合成的调节-Regulation,Go,Go,Go,Go,8,微生物发酵产酶医学讲座,Reverse,transcription,1、中心法则-,Central Dogma,9,微生物发酵产酶医学讲座,2、,RNA的生物合成(转录)-Transcription,细胞内RNA的生物功能,在蛋白质的生物合成过程中，各种RNA起着,重要的作用。其中，tRNA作为氨基酸载体，,并由其上的反密码子识别mRNA分子上的密码,子；mRNA作为蛋白质合成的模板，由其分子,上的三联体密码控制蛋白质分子中氨基酸的,排列顺序；rRNA与蛋白质一起组成核糖核蛋,白体（核糖体），作为蛋白质生物合成的场,所。,10,微生物发酵产酶医学讲座,3、蛋白质的合成(翻译)-Translation,翻译,:以RNA中mRNA为模板,按照其,核苷酸顺序所组成的密码指,导蛋白质的合成的过程.,mRNA,蛋白质,翻译,各种信息 各种蛋白质,（核苷酸排列顺序）（氨基酸排列顺序）,11,微生物发酵产酶医学讲座,酶生物合成的调节,原核生物中酶生物合成的调节机制,原核生物中酶生物合成的调节主要是转录水平的调节,雅各（Jacob）和莫诺德（Monod）于1960年提出的操纵子学说（Operon theory）来阐明的。,12,微生物发酵产酶医学讲座,酶生物合成的调节,原核生物中酶生物合成的调节机制,操纵子学说概述,操纵子（Operon）：是基因表达和控制的一个完整单元，其中包括结构基因，调节基因，操纵基因和启动基因。,13,微生物发酵产酶医学讲座,酶生物合成的调节,原核生物中酶生物合成的调节机制,操纵子学说概述,启动基因（Promoter gene）：由两个位点组成，一个是RNA聚合酶的结合位点，另一个是环腺苷酸（cyclic AMP,cAMP）与CAP组成的复合物(cAMP-CAP)的结合位点。,操纵基因（Operator gene）：与调节基因产生的变构蛋白（阻遏蛋白）中的一种结构结合，从而操纵酶生物合成的时机和合成速度。,14,微生物发酵产酶医学讲座,酶生物合成的调节,原核生物中酶生物合成的调节机制,操纵子学说概述,调节基因（Regulator gene）:产生一种阻遏蛋白。阻遏蛋白是一种由多个亚基组成的变构蛋白，它可以通过与某些小分子效应物（诱导物或阻遏物）的特异结合而改变其结构，从而改变它与操纵基因的结合力。当阻遏蛋白与操纵基因结合时，由于空间排挤作用，RNA聚合酶就无法结合到启动基因的位点上，也无法进行结构基因的位置进行转录，酶的生物合成也就无法进行。,15,微生物发酵产酶医学讲座,酶生物合成的调节,原核生物中酶生物合成的调节机制,操纵子学说概述,结构基因（Strutural gene）：结构基因与多肽链有各自的对应关系。结构基因上的遗传信息可以转录成为mRNA上的遗传密码，再经翻译成为酶蛋白的多肽链，每一个结构基因对应一条多肽链。,16,微生物发酵产酶医学讲座,酶生物合成的调节,原核生物中酶生物合成的调节机制,操纵子学说概述,诱导型操纵子（Inducible operon）大肠杆菌乳糖操纵子,17,微生物发酵产酶医学讲座,酶生物合成的调节,原核生物中酶生物合成的调节机制,操纵子学说概述,阻遏型操纵子（Repressible operon）色氨酸操纵子(Trp operon),色氨酸操纵子(tryptophane operon)负责色氨酸的生物合成，当培养基中有足够的色氨酸时，这个操纵子自动关闭，缺乏色氨酸时操纵子被打开，trp基因表达，色氨酸或与其代谢有关的某种物质在阻遏过程（而不是诱导过程）中起作用。,18,微生物发酵产酶医学讲座,19,微生物发酵产酶医学讲座,酶生物合成的调节,真核生物酶生物合成的调节,目前为止，还没有统一的理论和模型来阐述真核生物酶生物合成的调节规律。,20,微生物发酵产酶医学讲座,常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production,基本要求,：,不是致病菌,发酵周期短,产酶量高,不易变异退化,最好是产生胞外酶的菌种,利于分离。,对医药和食品用酶,还应考虑安全性：,凡从可食部分或食品加工中传统使用的微生物生产的酶,安全!,由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。,非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实验。,21,微生物发酵产酶医学讲座,常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production,1、细菌,细菌是在工业上有重要应用价值的原核微生物。在酶的生产中常用的细菌有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。,22,微生物发酵产酶医学讲座,常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production,1、细菌,细菌属于真细菌纲(,Schizomycetes,)，是单细胞，横分裂或二分裂繁殖，依细胞的形状和分裂后的集合状态而给予各种名称。按形状分为球菌、杆菌、螺旋菌等。球菌又有单球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌、链球菌、葡萄球菌等。,23,微生物发酵产酶医学讲座,常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production,球菌,链球菌,24,微生物发酵产酶医学讲座,常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production,四联球菌,葡萄球菌,25,微生物发酵产酶医学讲座,常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production,杆菌,螺旋菌,26,微生物发酵产酶医学讲座,(1)大肠埃希氏杆菌，简称为大肠杆菌，是最为著名的原核生物。,形态：短杆或长杆状，0.51.01.03.0 um，革兰氏阴性，运动(周毛)或不运动，无芽孢，一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色，扩展，光滑，闪光。,Escherich,属菌株和大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。,大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要求低。,应用：,大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖,大肠杆菌也是最早用作,基因工程的宿主菌,工业上生产,谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶,和,制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等,27,微生物发酵产酶医学讲座,(2)醋酸杆菌,（,Acetobacter,）,菌体从椭圆至杆状，单个、成对或成链，革兰氏阴性，运动（周毛）或不运动，不生芽孢。好气。含糖、乙醇和酵母膏的培养基上生长良好。,应用：有机酸(食醋等）、,葡萄糖异构酶(高果糖浆)、,山梨糖(维C中间体）,28,微生物发酵产酶医学讲座,(3),枯草,芽孢杆菌,（,Bacillus subtilis,）,直状、近直状的杆菌，周生或侧生鞭毛，,革兰氏阳性，无荚膜，芽孢0.51.51.8m，中生或近中生。,枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、5-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。,29,微生物发酵产酶医学讲座,常用的产酶微生物,放线菌(actinomycetes),放线菌是具有分支状菌丝的单细胞原核微生物。常用于酶发酵生产的放线菌主要是链霉菌(,Streptomyces,)。,链霉菌菌落呈放射状，具有分枝的菌丝体，菌丝直径0.21.2m。革兰氏染色阳性。菌丝有气生菌丝和基内菌丝之分，基内菌丝不断裂，只有气生菌丝形成孢子链。,链霉菌是生产,葡萄糖异构酶,的主要微生物。还可以用于生产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。此外，链霉菌还含有丰富的16羟化酶，可用于甾体转化。,30,微生物发酵产酶医学讲座,常用的产酶微生物,放线菌,链霉菌属,诺卡氏菌属,31,微生物发酵产酶医学讲座,常用的产酶微生物,放线菌,诺卡氏菌属,多为需氧型腐生菌，少数厌氧型寄生菌。已报道有100余种，主要分布于土壤。许多种能产生抗生素，如利福霉素（rifomycin）等，有的用于石油脱蜡，烃类发酵及污水处理等。,32,微生物发酵产酶医学讲座,常用的产酶微生物,放线菌,链霉菌属,主要分布于含水量较低，有机质丰富的中性或微碱性土壤中，多数为腐生，好氧菌。已知放线菌所产抗生素的90由本属产生。,33,微生物发酵产酶医学讲座,常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production,2、霉菌,霉菌是一类丝状真菌。用于酶的发酵生产的霉菌主要有黑曲霉、米曲霉、红曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉等。,34,微生物发酵产酶医学讲座,曲霉(,Aspergillus,),分类：多数属于子囊菌亚门，少数属于半知菌亚门。,分布：广泛分布于土壤、空气和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐变质，有的可产生致癌性的黄曲霉毒素。,代表种：,黑曲霉Asp.Niger、黄曲霉Asp.flavus,应用：,是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生产糖化饲料的菌种。,回本节,35,微生物发酵产酶医学讲座,常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production,黑曲霉,黑曲霉是曲霉属黑曲霉群霉菌。菌丝体由具有横隔的分支菌丝构成，菌丛黑褐色，顶囊大球形，小梗双层，分生孢子球形，平滑或粗糙。,黑曲酶可用于生产多种酶，有胞外酶也有胞内酶。例如，糖化酶，-淀粉酶,酸性蛋白酶，果胶酶，葡萄糖氧化酶，过氧化氢酶，核糖核酸酶，脂肪酶，纤维素酶，橙皮苷酶，核苷酶等。,36,微生物发酵产酶医学讲座,常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production,37,微生物发酵产酶医学讲座,常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production,米曲霉(,Aspergillus oryzae,),米曲霉是曲霉属黄曲霉群霉菌。菌丛一般为黄绿色，后变为黄褐色，,分生孢子头呈放射形，,顶囊球形或瓶形，小梗一般为单层，分生孢子球形，平滑，少数有刺，分生孢子梗长达2 mm 左右，粗糙。,米曲霉中糖化酶和蛋白酶的活力较强，这使米曲霉在我国传统的酒曲和酱油曲的制造中广泛应用。此外，米曲霉还可以用于生产氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶、核酸酶P等。,38,微生物发酵产酶医学讲座,39,微生物发酵产酶医学讲座,常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production,红曲霉（,Monascus,）,红曲霉菌落初期白色，老熟后变为淡粉色、紫红色或灰黑色。通常形成红色色素。菌丝具有隔膜，多核，分枝甚繁。分生孢子着生在菌丝及其分枝的顶端，单生或成链，闭囊壳球形，有柄，其内散生十多个子囊，子囊球形，内含8个子囊孢子，成熟后子囊壁解体，孢子则留在闭囊壳内。,红曲霉可用于生产-淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。,40,微生物发酵产酶医学讲座,41,微生物发酵产酶医学讲座,常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production,青霉(,Penicillium,),青霉属半知菌纲。其营养菌丝体无色、淡色或具有鲜明的颜色，有横隔，分生孢子梗亦有横隔，光滑或粗糙，顶端形成帚状分枝，小梗顶端串生分生孢子，分生孢子球形、椭圆形或短柱形，光滑或粗糙，大部分在生长时呈蓝绿色。有少数种会产生闭囊壳，其内形成子囊和子囊孢子，亦有少数菌种产生菌核。,青霉菌种类很多，其中产黄青霉（,Penicillium chrysogenum,）用于生产葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶（主要作用于青霉素）果胶酶、纤维素酶等。桔青霉（,Penicillium cityrinum,）用于生产5-磷酸二酯酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶、核酸酶S1、核酸酶P1等。,42,微生物发酵产酶医学讲座,43,微生物发酵产酶医学讲座,常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production,木霉(,Trichoderma,),木霉属于半知菌纲。生长时菌落生长迅速，呈棉絮状或致密丛束状，菌落表面呈不同程度的绿色，菌丝透明，有分隔，分枝繁复，分枝上可继续分枝，形成二级分枝、三级分枝，分支末端为小梗，瓶状，束生、对生、互生或单生，分生孢子由小梗相继生出，靠粘液把它们聚成球形或近球形的孢子头。分生孢子近球形、椭圆形、圆筒形或倒卵形。光滑或粗糙，透明或亮黄绿色。,木霉是生产纤维素酶的重要菌株。木霉生产的纤维素酶中包含有C1酶、Cx酶和纤维二糖酶等。此外，木霉中含有较强的17-羟化酶，常用于甾体转化。,44,微生物发酵产酶医学讲座,45,微生物发酵产酶医学讲座,常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production,根霉(,Rhizopus,),根霉生长时,由营养菌丝产生匍匐枝，匍匐枝的末端生出假根，在有假根的匍匐枝上生出成群的孢子囊梗，梗的顶端膨大形成孢子囊，囊内产生孢子囊包子。孢子呈球形、卵形或不规则形状。根霉可用于生产糖化酶、-淀粉酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等。根霉有强的11-羟化酶，是用于甾体转化的重要菌株。,46,微生物发酵产酶医学讲座,47,微生物发酵产酶医学讲座,常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production,毛霉(,Mucor,),毛霉的菌丝体在基质上或基质内广泛蔓延，无假根。菌丝体上直接生出孢子囊梗，一般单生，分枝较少或不分枝。孢子囊梗顶端都有膨大成球形的孢子囊，囊壁上常有针状的草酸钙结晶。,毛霉常用于生产蛋白酶、糖化酶、-淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。,48,微生物发酵产酶医学讲座,49,微生物发酵产酶医学讲座,常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production,酵母,酵母是一群属于真菌的单细,胞微生物。它分为两大类:,一类能产生子囊孢子，称为,真酵母；另一类不能生成子,囊孢子，称为类酵母。通常,以出芽方式进行无性繁殖，,也有少数酵母进行有性繁殖。,细胞形状因菌株而异，有球,形、卵园形、柠檬形、梨形、,腊肠形、也有丝状。大小一,般为130m。,50,微生物发酵产酶医学讲座,常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production,酵母,啤酒酵母(,Saccharomyces cerevisiae,),啤酒酵母是啤酒工业上广泛应用的酵母。细胞由圆形、卵形、椭圆形到腊肠形。在麦芽汁培养基上，菌落为白色，有光泽，平滑，边缘整齐。营养细胞可以直接变为子囊，每个子囊含有14个圆形光亮的子囊孢子。,啤酒酵母除了主要用于啤酒、酒类的生产外，还可以用于转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等的生产。,51,微生物发酵产酶医学讲座,52,微生物发酵产酶医学讲座,常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production,酵母,假丝酵母(,Candida,),假丝酵母的细胞圆形，卵形或长形。无性繁殖为多边芽殖，形成假菌丝，也有真菌丝，可生成无节孢子、子囊孢子、冬孢子或掷孢子。不产生色素。在麦芽汁琼脂培养基上，菌落呈乳白色或奶油色。,假丝酵母可以用于生产脂肪酶、尿酸酶、尿囊素酶、转化酶、醇脱氢酶等。具有较强的17-羟基化酶，可以用于甾体转化。,53,微生物发酵产酶医学讲座,54,微生物发酵产酶医学讲座,发酵工艺条件及其控制,微生物发酵产酶的一般工艺流程,细胞扩大培养养,保藏细胞,细胞活化,发酵,分离纯化,酶,固定化细胞,原生质体,固定化原生质体,培养基,预培养,无菌空气,55,微生物发酵产酶医学讲座,2.3 酶的发酵工艺条件与控制 The fermentation principles and its control of enzyme production,1、培养基,2、发酵条件及控制,3、提高产酶的措施,Go,Go,Go,下一节,本章,目录,56,微生物发酵产酶医学讲座,五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水,培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础,培养基（medium）是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。,任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素,57,微生物发酵产酶医学讲座,构成细胞物质或代谢产物中碳架,碳源可作能源，为生命活动提供能量,常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白质及其降解物,水是微生物最基本的组成分（）,水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）,水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动,调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）,水,碳源,选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制,58,微生物发酵产酶医学讲座,构成细胞物质和代谢产物中氮素（不能用作能源）,氮源,有机氮源,蛋白胨、酵母膏、牛肉膏,无机氮源,铵盐、硝酸盐,参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性,维持细胞结构的稳定性,调节细胞渗透压,控制细胞的氧化还原电位,有时可作某些微生物生长的能源物质,常用：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钾、钠、钙、镁、铁等元素的化合物。,氮源,无机盐,需要注意合适的碳氮比,59,微生物发酵产酶医学讲座,生长因子,生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。,分类：,化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和类脂成分 等四类,功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应,实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因子的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子,60,微生物发酵产酶医学讲座,培养基,各种生物对营养的需求,61,微生物发酵产酶医学讲座,1、选择适宜的营养物质,2、营养物的浓度及配比合适,3、物理、化学条件适宜,4、经济节约,5、精心设计、试验比较,培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；,培养目的不同，原料的选择和配比不同；,不同阶段，培养条件也有所差异。,培养基的设计原则,62,微生物发酵产酶医学讲座,实验室的常用培养基：,细菌：牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；,放线菌：高氏1号合成培养基培养；,酵母菌：麦芽汁培养基；,霉菌：查氏合成培养基；,例如枯草芽孢杆菌：,一般培养：肉汤培养基或LB培养基；,自然转化：基础培养基；,观察芽孢：生孢子培养基；,产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；,63,微生物发酵产酶医学讲座,枯草杆菌BF7658-淀粉酶发酵培养基,：玉米粉8%，豆饼粉4%，磷酸氢二钠,0.8%，硫酸铵0.4%，氯化钙0.2%，氯化按0.15%（自然pH）。,枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基,：玉米粉4%，豆饼粉3%，麸皮3.2%,糠1%,磷酸氢二钠0.4%,磷酸二氢钾0.03%（自然pH）。,黑曲霉糖化酶发酵培养基,：玉米粉10%，豆饼粉4%，麸皮1%（pH4.45.0）。,地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶发酵培养基,：玉米粉5.5%,豆饼4%,磷酸氢二钠0.4%,磷酸二氢钾0.03%(pH 8.5)。,黑曲霉AS 3.350酸性蛋白酶发酵培养基,:玉米粉6%,豆饼粉4%,玉米浆0.6%,氯化钙0.5%,氯化铵1%,磷酸氢二钠0.2%(pH 5.5)。,游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基,：糖蜜2%，豆饼粉2%，磷酸氢二钠0。1%，硫酸镁0。05%(pH 7.2)。,桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基,：淀粉水解糖5%，蛋白胨0.5%,硫酸镁0.05%,氯化钙0.04%,磷酸氢二钠0.05%,磷酸二氢钾0.05%(自然pH)。,黑曲霉AS3.396果胶酶发酵培养基,:麸皮5%,果胶0.3%,硫酸铵2%,磷酸二氢钾0.25%,硫酸镁0.05%,硝酸钠0.02%,硫酸亚铁0.001%(自然pH)。,枯草杆菌AS1.398碱性磷酸酶发酵培养基,:葡萄糖0.4%,乳蛋白水解物0.1%,硫酸铵1%,氯化钾0.1%,氯化钙0.1mmol/L,氯化镁1.0mmol/L,磷酸氢二钠20mol/L(用pH7.4的Tris-HCl缓冲液配制),回本节,64,微生物发酵产酶医学讲座,2、发酵条件及控制,pH值的调节控制,温度的调节控制,溶解氧的调节控制,65,微生物发酵产酶医学讲座,发酵条件及控制,pH值的调节控制,不同的细胞，其生长繁殖的最适pH值有所不同。一般细菌和放线菌的生长最适pH值在中性或碱性范围（pH6.58.0）；霉菌和酵母的最适生长pH值为偏酸性(pH46)；植物细胞生长的最适pH值为56。,66,微生物发酵产酶医学讲座,发酵条件及控制,pH值的调节控制,细胞发酵产酶的最适pH值与生长最适pH值往往有所不同。细胞生产某种酶的最适pH值通常接近于该酶催化反应的最适pH值。,有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的pH值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。例如，采用米曲霉发酵生产蛋白酶时，当培养基的pH值为碱性时，主要生产碱性蛋白酶；培养基的pH值为中性时，主要生产中性蛋白酶；而在酸性的条件下，则以生产酸性蛋白酶为主。,67,微生物发酵产酶医学讲座,发酵条件及控制,pH值的调节控制,培养基的pH值与培养基的组成成分以及发酵工艺条件密切相关。,含糖量高的培养基，由于糖代谢产生有机酸，会使pH值向酸性方向移动；,含蛋白质、氨基酸较多的培养基，经过代谢产生较多的胺类物质，使pH值向碱性方向移动；,以硫酸铵为氮源时，随着铵离子被利用，培养基中积累的硫酸根会使pH值降低；,以尿素为氮源的，随着尿素被水解生成氨，而使培养基的pH值上升，然后又随着氨被细胞同化而使pH值下降；,68,微生物发酵产酶医学讲座,发酵条件及控制,pH值的调节控制,磷酸盐的存在，对培养基的pH值变化有一定的缓冲作用。,在氧气供应不足时，由于代谢积累有机酸，可使培养基的pH值向酸性方向移动。,69,微生物发酵产酶医学讲座,发酵条件及控制,发酵过程中，对培养基pH值进行适当的控制和调节方法:,调节pH值的方法可以通过改变培养基的组分或其比例；,也可以使用缓冲液来稳定pH值；,或者在必要时通过流加适宜的酸、碱溶液的方法，调节培养基的pH值，以满足细胞生长和产酶的要求。,70,微生物发酵产酶医学讲座,71,微生物发酵产酶医学讲座,发酵条件及控制,温度的调节控制,不同的细胞有不同的最适生长温度。例如，枯草杆菌的最适生长温度为3437,，黑曲霉的最适生长温度为2832,等。,72,微生物发酵产酶医学讲座,通常在生物学范围内每升高10，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。,温度的控制,有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。这是由于在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的mRNA的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。,73,微生物发酵产酶医学讲座,发酵条件及控制,温度的调节控制,温度的调节一般采用热水升温、冷水降温的方法。为了及时地进行温度的调节控制，在发酵罐或其他生物反应器中，均应设计有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等，并且随时备有冷水和热水，以满足温度调控的需要。,74,微生物发酵产酶医学讲座,发酵条件及控制,溶解氧的调节控制,细胞必须获得充足的氧气，使从培养基中获得的能源物质（一般是指各种碳源）经过有氧降解而生成大量的细胞的生长繁殖和酶的生物合成过程需要大量的能量ATP。,75,微生物发酵产酶医学讲座,溶解氧的控制,在酶的发酵生产过程中，处于不同生长阶段的细胞，其细胞浓度和细胞呼吸强度各不相同，致使耗氧速率有很大的差别。因此必须根据耗氧量的不同，不断供给适量的溶解氧。,培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶解速度。溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。一般说来，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大。培养液的性质，主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有明显影响。,回本节,76,微生物发酵产酶医学讲座,发酵条件及控制,溶解氧的调节控制,调节通气量,调节氧的分压,调节气液接触时间,调节气液接触面积,改变培养液的性质,控制溶解氧方法,77,微生物发酵产酶医学讲座,发酵条件及控制,溶解氧的调节控制,调节气液接触面积的措施:,为了增大气液两相接触面积，应是通过培养液的空气尽量分散成小气泡。,在发酵容器的底部安装空气分配管，使气体分散成小气泡进入培养液中，是增加气液接触面积的主要方法。,装设搅拌装置或增设挡板等可以使气泡进一步打碎和分散，也可以有效地增加气液接触面积，从而提高溶氧速率。,78,微生物发酵产酶医学讲座,发酵条件及控制,溶解氧的调节控制,改变培养液的性质：,可以通过改变培养液的组分或浓度等方法，有效地降低培养液的黏度；设置消泡装置或添加适当的消泡剂，可以减少或消除泡沫的影响，以提高溶氧速率。,79,微生物发酵产酶医学讲座,发酵条件及控制,提高酶产量的措施,添加诱导物,控制阻遏物的浓度,添加表面活性剂,添加产酶促进剂,80,微生物发酵产酶医学讲座,提高酶产量的措施,添加诱导物,对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。例如，乳糖诱导-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。,诱导物一般可以分为3类,酶的作用底物,酶的催化反应产物,作用底物的类似物,81,微生物发酵产酶医学讲座,发酵条件及控制,提高酶产量的措施,添加诱导物,1.酶的作用底物,许多诱导酶都可以由其作用底物诱导产生。例如，乳糖诱导大肠杆菌-半乳糖苷酶。L-苯丙氨酸诱导苯丙氨酸解氨酶的合成等,82,微生物发酵产酶医学讲座,发酵条件及控制,提高酶产量的措施,添加诱导物,2.酶的反应产物,有些酶可以由其催化反应产物诱导产生。例如，半乳糖醛酸是果胶酶催化果胶水解的产物，它可以作为诱导物，诱导果胶酶的生物合成；纤维二糖诱导纤维素酶的生物合成；没食子酸诱导单宁酶的产生等。,83,微生物发酵产酶医学讲座,发酵条件及控制,提高酶产量的措施,添加诱导物,84,微生物发酵产酶医学讲座,发酵条件及控制,提高酶产量的措施,添加诱导物,酶作用底物的类似物,有些酶的最有效的诱导物是可以与酶结合，但不能被酶催化的底物类似物。例如，异丙基-硫代半乳糖苷（IPTG）对-半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百倍；,86,微生物发酵产酶医学讲座,控制阻遏物的浓度,阻遏作用根据机理不同，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。,1.产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。,2.分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用,。,控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。,为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当,控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度,。,采用其他较难利用的碳源，如淀粉等,采用补料、分次流加碳源,添加一定量的环腺苷酸（cAMP）,对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过,控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除,。,87,微生物发酵产酶医学讲座,添加表面活性剂,表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。,将适量的,非离子型表面活性剂,，如,吐温（Tween）,、,曲通(Triton),等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。,由于,离子型表面活性剂对细胞有毒害作用,，尤其是季胺型表面活性剂（如新洁而灭等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。,回本节,88,微生物发酵产酶医学讲座,89,微生物发酵产酶医学讲座,添加表面活性剂,90,微生物发酵产酶医学讲座,发酵条件及控制,提高酶产量的措施,添加产酶促进剂,产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。在酶的发酵生产过程中，添加适宜的产酶促进剂，往往可以显著提高酶的产量。例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高120倍,添加聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol）可以提高糖化酶的产量。产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，,要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度,。,91,微生物发酵产酶医学讲座,酶生产过程的动力学,1、酶生物合成的模式,2、酶生产过程中细胞生长动力学,3、酶生产过程中产酶动力学,Go,Go,Go,本章,目录,92,微生物发酵产酶医学讲座,酶生产过程的动力学,酶发酵动力学,发酵动力学主要研究发酵过程中细胞生长速度、产物生成速度、基质消耗速度以及环境因素对这些速度的影响等。,93,微生物发酵产酶医学讲座,1、酶生物合成的模式,细胞在一定条件下培养生长，其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期等4个阶段,通过分析比较细胞生长与酶产生的关系,可以把酶生物合成的模式分为4种类型。即,同步合成型,，,延续合成型,，,中期合成型,和,滞后合成型。,94,微生物发酵产酶医学讲座,同步合成型,酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的生物合成速度与细胞生长速度紧密联系，又称为,生长偶联型,。,属于该合成型的酶，其生物合成伴随着细胞的生长而开始；在细胞进入旺盛生长期时，酶大量生成；当细胞生长进入平衡期后，酶的合成随着停止。,大部分组成酶的生物合成属于同步合成型，有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成。,例如米曲霉在含有单宁或者没食子酸的培养基中生长，在单宁或没食子酸的诱导作用下，合成单宁酶（tanase EC3.1.1.20）。,95,微生物发酵产酶医学讲座,延续合成型,酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。,属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。例如，在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源的培养基中培养，可以诱导聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，EC3.2.1.15）的生物合成。,96,微生物发酵产酶医学讲座,中期合成型,该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止,。,例如，枯草杆菌碱性磷酸酶（Alkaline phophatase，EC 3.1.3.1)的生物合成模式属于中期合成型。这是由于该酶的合成受到其反应产物无机磷酸的反馈阻遏，而磷又是细胞生长所必不可缺的营养物质，培养基中必须有磷的存在。这样，在细胞生长的开始阶段,培养基中的磷阻遏碱性磷酸酶的合成，只有当细胞生长一段时间，培养基中的磷几乎被细胞用完（低于0.01mmol/L）以后，该酶才开始大量生成。又由于碱性磷酸酶所对应的mRNA不稳定，其寿命只有30 min左右，所以当细胞进入平衡期后，酶的生物合成随着停止。,97,微生物发酵产酶医学讲座,滞后合成型,此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累。又称为,非生长偶联型,。,许多水解酶的生物合成都属于这一类型。,属于滞后合成型的酶，之所以要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成，主要原因是,由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合成。,若培养基中不存在阻遏物，该酶的合成可以转为延续合成型。该类型酶所对应的mRNA稳定性很好，可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。,98,微生物发酵产酶医学讲座,理想的酶合成模式,酶所对应的mRNA的稳定性以及培养基中阻遏物的存在是影响酶生物合成模式的主要因素。,其中，mRNA稳定性好的，可以在细胞生长进入平衡期以后，继续合成其所对应的酶；mRNA稳定性差的，就随着细胞生长进入平衡期而停止酶的生物合成；不受培养基中存在的某些物质阻遏的，可以伴随着细胞生长而开始酶的合成；受到培养基中某些物质阻遏的，则要在细胞生长一段时间甚至在平衡期后，酶才开始合成并大量积累。,在酶的发酵生产中，为了提高产酶率和缩短发酵周期，,最理想的合成模式应是延续合成型,。因为属于延续合成型的酶，在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期以后，酶还可以继续合成一段较长的时间。,对于,其他合成模式的酶，可以通过基因工程细胞工程等先进技术,选育得到优良的菌株,并通过工艺条件的优化控制,使他们的生物合成模式更加接近于延续合成型,。,回本节,99,微生物发酵产酶医学讲座,2、,酶生产过程中细胞生长动力学,细胞在控制一定条件的培养基中生长的过程中,其生长速度受到细胞内外各种因素的影响,变化比较复杂，情况各不相同。,细胞生长动力学主要研究细胞生长速度以及外界环境因素对细胞生长速度影响的规律。1950年，,法国的莫诺德(Monod)首先提出了表述微生物细胞生长的动力学方程,。,在培养过程中，细胞生长速率与细胞浓度成正比,假设培养基中只有一种限制性基质，而不存在其他生长限制因素时，为这种限制性基质浓度的函数。,K,S,为莫诺德常数，是指比生长速率达到最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。,100,微生物发酵产酶医学讲座,回本节,莫诺德方程是基本的细胞生长动力学方程。在发酵过程优化以及发酵过程控制方面具有重要的应用价值。不少学者从不同的情况出发或运用不同的方法，对莫诺德方程进行了修正，得出了适用于不同情况的各种动力学模型。,连续培养时的方程变化形式,101,微生物发酵产酶医学讲座,3、产酶动力学,产酶动力学主要研究