定量组织化学和组织化学的应用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,掌握内容,常用的定量细胞化学技术,种类,图像分析系统、显微分光光度技术,、,流式细胞仪,技术和,激光扫描共聚焦,技术在定量组织化学中的应用,概 述,组织化学的建立，开始只能对组织细胞内的化学成分进行定性、定位观察。,大量的,组织细胞图像,，限于人眼分辨率和定性描述的局限性，只能用,文字定性的、半定量,的或数据或曲线来,部分地描述,有关信息。,概 述,多学科技术,的综合应用，如计算机、红外线、超声波、放射性核素、光纤、电视、光学和电子显微镜、磁共振、激光等，使组织化学研究上升到,定量分析分子和离子的水平。,4、,X射线微区分析,测定细胞内元素或细胞化学反应产物的元素类型和含量。,5、,用特殊显微镜检术,进行细胞形态、细胞内成分定量测定（显微偏光技术、显微干涉技术、激光扫描共聚焦技术）,一、目测定量术,细胞计数,酶组化、免疫组化及荧光组化的,初步定量描述法,阳性率和阳性强度法,共五级描述，从“”到“”,二、图像分析系统,采用,计算机技术,和,数学形态学方法,客观精确地用,数据表达,细胞图象中的各种信息,按采用的计算机不同，可分为大型、中型、,小型,图像分析仪，医学图象处理大都采用后者。按显示的图象不同又可分为黑白、伪彩色和真彩色图像分析仪。,（显微镜）、图像输入装置、信息专用计算机、输出设备,基本原理,把光学图像成像于摄像管的靶面上，再把摄像管的靶面上的光学图像变换成电荷浓淡表示的图像,光学信号电子信号模拟成像,在显微图像中的细胞或细胞器，一般具有图像的三个要素：,浓度信息,位置信息,色彩信息,浓度信息,作为图像中重要的一种信息，度量它的尺度称为,灰度,，它代表,图像各部分颜色的深强程度,。,灰度共有256级,，,0为黑色，255为白色,人眼判断图象浓淡时，灰度分辨率大约在20灰度级以下,位置信息,是指在一幅图象平面上建立坐标系，用X和Y表示图象中任一象素点的二维平面位置,而函数形式f(x,y)表示位置为(x，y)那一像素点上的灰度。,人眼对,彩色的分辨能力,大大高于对黑白图象灰度级的观察。,因此，在图像分析中常常使用不同的彩色和色调的变化来代替图像黑白灰度级别的变化、以达到突出图像信息空间分布的目的。,真彩色和假彩色,红光R、蓝光B、绿光G,Yx R+y B+z G,(x,y,z分别表示每种光的主观亮度),图像分析系统测定的主要内容,1、形态学参数测定：,对细胞、细胞核、细胞器大小、轮廓的定量描述周长、直径、面积、轴比、圆球度、核质比等。,如：,肿瘤细胞核与正常细胞核的大小，前者比后者显著增高,图像分析系统测定的主要内容,2、灰度参数,：,细胞质、细胞核、平均灰度、最大灰度、最小灰度、灰度范围、灰度变化系数等,3、光密度测量,带有光密度计组件，测定被测物的光密度,是一种绝对值，与图像颜色的深浅有关。,图像分析系统测定的主要内容,4、色度参数：,5、细胞染色体核型的自动分析,三、细胞光度测量,主要定量测定通过,细胞化学反应后的最终反应产物的量,，并以标准物作对照，得出定量结果。,细胞光度测量从原理上可以,诸多光学现象的任何一种作为基础,，如吸收、发光(荧光、磷光)、阻滞(干涉、偏振)、反射(镜面、散射)等。最常用的方法是吸收光度测量、荧光光度测量、干涉测量和反射测量等,吸光光度测量和显微分光光度计,细胞吸收光度测量，取决于有色的或不透光的化学基团从特定波长光线接受能量的能力。,吸收物质或嗜色体，可以是细胞内产生的（如核酸），也可以是细胞化学反应的产物，或染料染色的结果。,显微分光光度计,又称细胞分光光度计,以物质分子对光波的选择性吸收为基础，在显微镜下对生物样品中的化学物质进行定量测定,主要结构,1、光源：,白炽灯（400-700nm）卤钨灯（320-300nm）、氙灯（180-1000nm）、汞灯（一般用于激发荧光）等,2、分光系统：,色散元件、滤光片、棱镜、光栅单色仪等，目的是使进入显微镜的光波亮度充足，波长单一且可调。,主要结构,3、显微系统：,4、自动聚焦系统,5、扫描系统：针对X、Y轴,6、光电接受系统,7、电子控制系统及计算机：控制样品测量条件和数据分析。,样品要求,1、避免使用含高光密度物质的固定液,2、细胞尽量分散，单个测量,3、选择合适的染色方法，,不能双染,。,应用,1、DNA含量测定,2、蛋白质含量测定,3、酶含量测定,4、光密度显微测定,流式细胞仪（FCM）,它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器。又叫流式细胞光度计,流式细胞仪的特点,单个,细胞分析,同时,多参数,分析,速度快,：千、万细胞,/,秒,统计学,意义：提供细胞群体的均值和分布情况,分选,感兴趣的细胞,流式细胞仪的工作原理,光学系统,激光光源,光收集系统,液流系统,流动室,液流驱动系统,电子系统,光电转换,数据处理系统,细胞分选系统,Injector,Tip,Fluorescence,signals,Focused laser,beam,Sheath,fluid,荧光信号,荧光染料被激发而发射的光信号,荧光信号大小,被标记组分含量的定量,多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量,流式细胞仪产生的信号,流式细胞仪产生的信号,非荧光信号,颗粒度,细胞大小,散射光信号区分裂解后的外周血细胞群,由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据,选定的某个参数,由,逻辑电路,判明是否将被分选，而后由,充电电路,对选定,细胞液滴充电,，带电液滴携带细胞通过静电场而发生,偏转,，落入收集器中；其它液体被当作废液抽吸掉。,细胞分选的原理,流式细胞仪分选系统,488 nm laser,+,-,Charged Plates,Single cells sorted,into test tubes,FALS Sensor,Fluorescence detector,细胞分选系统,流式细胞仪的测量对象,对象类型,细胞类型：高等真核细胞；酵母；细菌；,非生命颗粒：细胞核、染色体和其它细胞器以及乳化微球等。,流式细胞仪能够检测的细胞属性和组分举例,1）不需染色,：,大小，胞浆颗粒度，细胞自发荧光，色素，细胞精确计数。,2）需染色或标记,：,细胞组分,：,细胞膜：,流动性，通透性，膜电位,细胞内离子：,H,+,（可检测PH值），Na,+,，K,+,，Ca,2+,（结合的和自由的）。,核酸：,DNA含量，DNA成分，DNA合成，RNA，染色质结构等,总蛋白质、蛋白质分子间相互作用、抗原、细胞骨架成分、受体,流式细胞仪的样品要求,1、单细胞悬液,2、被检细胞或颗粒大小0.2300um,3、样品中至少20000个细胞，浓度10,5,-10,7,个/毫升,注意：不要离心次数太多,固定要求,1、分析活细胞或分选活细胞：不固定,2、常用三种方法：,甲醛4%，吖黄素Feulgen染色,乙醇70%，Hoechst33258、EB、PI、FITC,丙酮85%，免疫荧光,染色应用,1、判断细胞活力：,PI，活细胞拒染,FDA（荧光素乙酸盐）-PI:活细胞绿；死细胞-红,2、DNA显示：,EB、PI（嵌入剂），光辉霉素（MIG-C）；Hoechst33258（A-T）,染色要求,3、DNA-RNA双染,AO：DNA绿，RNA红,Heochst-PY(派洛宁)：蓝-红,4、DNA与蛋白质双染,PI-FITC双染：红-绿,应用,细胞生物学,肿瘤学：,免疫学,血液学,药物学,.,经验之谈：,凡细胞内能进行荧光标记的成分或者某种变化，都可用流式细胞仪进行检测。,激光扫描共焦显微镜技术,共焦显微镜与传统显微镜的,区别,1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像,人眼分辨率：0.2mm,光学显微镜分辨率：0.25,m,m,电子显微镜分辨率：0.2nm,共焦显微镜分辨率：0.18,m,m,激光扫描共焦显微镜技术,共焦显微镜与传统显微镜的,区别,2.具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片,conventional,confocal,激光扫描共焦显微镜技术,共焦显微镜与传统显微镜的,区别,3.灵敏度高,采用光电倍增管来检测荧光信号，极弱的荧光也能检测,激光扫描共焦显微镜技术,共焦显微镜与传统显微镜的,区别,4.由于点对点扫描去除了杂散光的影响,激光扫描共焦显微镜应用,一、定位、定量,免疫荧光标记,（单标、双标或多标）的定位、定量：如：细胞膜受体或抗原的分布，微丝、微管的分布、两种或三种蛋白的,共存,与,共定位,等,细胞凋亡,:AnnexinV-fitc+PI,末端原位杂交-fitc+PI,荧光原位杂交,：染色体基因定位,激光扫描共焦显微镜应用,二、三维重组,三、动态测量,活细胞或组织内游离,Ca,2+,分布和浓度的变化测量,(Mg,2+,、Zn,+,、Na,+,、K,+,),自由基的检测,药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量,蛋白质的转位,激光扫描共焦显微镜应用,二、三维重组,三、动态测量,活细胞或组织内游离,Ca,2+,分布和浓度的变化测量,(Mg,2+,、Zn,+,、Na,+,、K,+,),自由基的检测,药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量,蛋白质的转位,激光扫描共焦显微镜应用,四、贴壁细胞的分选,细胞培养在特制的培养皿上,1、用高能量的激光在预选细胞四周切割，达到分离的目的，然后可继续培养。细胞数较少,2、用高能量激光杀灭不需要的细胞，留下需要的活细胞继续培养细胞较多,五、细胞内激光显微外科,光子刀，细胞膜瞬间穿孔，细胞特定部位切除、染色体切割等,