细胞工程(5).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,什么是布鲁氏菌病？,自从确诊为布鲁氏菌病后，王永杰一直想要知道答案，“一开始并不了解此种病，就也没把它看得太严重。”,但当查到布鲁氏菌病属于乙类传染病时，王永杰被眼前的文字吓到了：“原来布鲁氏菌病是与甲型H1N1流感、传染性非典型肺炎、艾滋病、人感染高致病性禽流感、炭疽病等20余种大名鼎鼎的传染病并列的乙类传染病！”,王永杰说：“我们在医院打听到，布鲁氏菌病还可引起长期发热、多汗、关节痛、肝脾肿大、早衰及不孕不育等多系统疾病，更让我们惊恐的是，此病有可能久治不愈。”,P4实验室：湖北武汉BSL-4病毒实验室（2005年）,习题2,1.请设计一标准动物（或植物）细胞培养室，并说明主要注意事项（不少于五项），明确必须的主要设备及用途（不少于五件）。,2.细胞培养室常见的消毒方法有哪些？,3.用于细胞培养的纯水如何制备？,二、细胞培养的现实意义,生物技术上：生产各种生技术产品如：狂犬病、小儿麻痹,症等病毒疫苗，表皮生长因子及干扰素、白,细胞介素等生长因子及单克隆抗体等。,科学研究上：在病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学等方面。,临床医学上：胎儿的遗传性疾病分析，药物筛选及某些疾,病的治疗等,三、细胞培养的优点,1.研究的对象是活细胞,在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活力，并可长时间监控、检测，甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命活动等。,2.,研究条件可以人为控制,可以根据需要，控制包括pH、温度、氧气、二氧化碳、张力等物理、化学的条件，同时，可以施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实验观察，这些因素同样可以处于严格控制之下。,3.研究的样本可以达到比较均一性,通过细胞培养一定代数后，所得到的细胞系则可以达到均一性而属于同一类型的细胞，需要时，可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。,4.研究内容便于观察、检测和记录,采用各种研究技术、记录方法：,研究:倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记-,记录:摄影照片、缩时电影、电视-,5.研究的范围比较广泛,学科多,：,细胞学、免疫学、肿瘤学、生物化学、遗传学、分子生物学等,对象广：,各种动物：低等动物-高等动物-人类 一种动物：不同年龄-不同组织-正常或异常（肿瘤-）,6.研究的费用相对较经济,可提供大量、同一时期、重复性好的、生物学性状相似的实验对象。,四、细胞培养的缺点,现人工模拟体内环境的技术已经很高,但,人工所模拟的条件与体内,实际情况 仍,不完全相同,.当细胞被置于,体外培养后,生活在缺乏动态平衡的环境中,久了，必然发生变化,.,因此，对于体外培养的细胞，应该把他们视作一种既能保持动物体内原细胞一定的性状、结构和功能，又具有某些改变的，特定的细胞群体，而不能将之与体内的细胞完全等同。,体外细胞培养物的生长类型,按生长方式,:2,型,粘附型,细胞,:,附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。,悬浮型,细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。,绝大多数,有机体细胞,属粘附型,细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。,体外培养细胞的分型,贴附(粘附)型细胞,粘附,:是大多数有机体,细胞,在体内,生存,和,生长发育,的,基本存在方式,含义,两,方面,结果,基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须,粘附,于一,固相表面,才能,生存,和,生长,。,分类,根据形态大致的不同，主要2类：,上皮细胞型,成纤维细胞型,其它，不定型,上皮细胞型,名称：,仅形态上似体内,，实际上不完全等于-,来源：,来源于外胚层,，内胚层细胞,如：皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性肿瘤,形态：,类似,体内的,上皮细胞,扁平,，,不规则多角形,，中有圆形核,生长特点,易相连,成片,相靠,紧密相连,成薄层-,铺石状,生长,时呈,膜状,移动,很少,脱离细胞群而,单个活动,体外培养细胞类型（1）上皮细胞型,成纤维细胞型,名称：,凡在,培养中形态与成纤维细胞类似,的,来源：,由,中胚层间充质组织起源,的组织,如：真正的成纤维细胞,心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮,形态：,似体内成纤维细胞,的形态,胞体梭形,或不规则三角形,胞质向外伸出,23,个,长短不等的突起,中有卵圆形核,生长特点：,排列成,放射状,，漩涡状,并不紧靠连成片,，细胞细胞接触易断开而,单独行动,游离的,单独的,成纤维样细胞，常有几个,伸长的细胞突起,体外培养细胞类型（2）成纤维细胞型,悬浮生长型,概念,培养时,不贴附于底物而呈悬浮状态生长,或以机械方法使保持悬浮状态下生长,来源,自,血,，脾或骨髓，尤以血中白细胞,癌肿细胞也可能,特点,在,悬浮中生长良好,细胞,圆形,，单个或小细胞团,优点,生存空间大，,提供数量大,传代方便,(不需消化),易于收获,可获得稳定状态,缺点,观察不方便,很多细胞不能,悬浮生长(尤以正常细胞),悬浮型,概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长,来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞,特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团,优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，,易于收获，可获得稳定状态,缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细,胞),HL-60 分化细胞Giemsa染色,1.细胞种类：HL-60；2.培养的天数：ATRA 1微摩尔作用5天；3.放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：1640+8胎牛血清；5.细胞状态与特征简述：,悬浮细胞,，分化的细胞核浆比例减小，核仁减少或,消失，胞核呈杆状或分叶状。,KU812,1.细胞种类：人嗜碱细胞性白血病细胞系；2.培养的天数：5d；3.放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类：RPMI1640+10%新生牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈圆形，悬浮生长。,HeLa细胞1.细胞种类：人HeLa细胞传代培养；2.培养的天数：7d；3.放大倍速：倒置显微镜 X200；4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈多角形，贴壁生长。,K562细胞,1.细胞种类：K562（人慢性红白血病细胞株）；2.培养的天数：传代后2天；3.放大倍数：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清，4mM Glutamine；5.细胞状态与特征简介：悬浮生长，少数贴壁，喜爱成团悬浮。,三、培养细胞的生长特点,（一）贴附,（二）接触抑制,（三）密度抑制,四、培养细胞的生长和增殖过程,（一）组织培养细胞生命期(Life Span of Culture Cells),培养细胞生命期，,是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。包括原代培养期、传代培养期及衰退期。,正常培养的细胞周期,游离期,悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。,吸附期,贴附底物，一般24小时内贴壁。,潜伏期,此时细胞有生长活动，基本无增殖。,细胞株潜伏期一般为624小时。,对数生长期,细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进,行实验研究。,停止期（平台期）,细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂,机制：接触抑制、密度依赖性,原代培养,(Primary Culture),期,也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一,次传代阶段，一般持续1-4周。,特点：细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。与,体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。,传代期,特点：在全生命期中此期的持续时间最长，细胞增殖旺,盛，并能维持二倍体核型。,传代：体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。初代培养的细胞一经传代后便改称做细胞系（Cell Line）。,衰退期,特点：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，,最后衰退凋亡。,（二）体外培养细胞一代生存期,潜伏期,指数增生期,停滞期,所谓细胞的,“一代”,是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。,（三）单个细胞的生长过程,细胞冻存和复苏,细胞深低温保存的基本原理是：,在70以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。,细胞低温保存的关键：,在于通过020阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。,冻存和复苏的原则：,慢冻快融,慢冻程序,4,10 分钟,20 30 分钟,80 16-18 小时(或隔夜),液氮罐长期储存。,冻存管,1.2ml,2ml，,5ml,液氮罐,细胞复苏方法,（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37,38水浴中，使其融化（1分钟左右）；,（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上；,（3）低速离心10分钟；,（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,低温保护剂的应用,在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。,常用的低温保护剂是,DMSO,，它是一种渗透性保护剂。,也有用甘油的,冻存液：,含20%血清培养基,10%DMSO（或10甘油）,DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。,细胞欲冷冻保存时，细胞浓度应该多少？,冷冻管内细胞数目一般为1,10,6,cells/ml,融合瘤细胞则以5,10,6,cells/ml 为宜。,细胞的运输技术,（八）细胞培养的污染和检测,细胞污染的种类,:,细菌、酵母菌、霉菌和病毒,污染源,:,无菌操作技术不当,;,操作室环境不佳,;,污染之血清,;,污染之细胞,.,细菌培养液被洋葱佰克霍尔德菌污染了。,洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单胞菌属，是植物病原菌。,白色念珠菌污染,真菌感染,支原体污染电镜照片,煎蛋状和其他形状,细菌和真菌的污染和检测,肉眼直接观察法,培养检查法,显微镜观察法,.支原体的污染和检测,.支原体的污染和检测,Hayflick培养基直接培养法,DNA荧光染色法,PCR方法,相差显微镜观察法,测出细胞株有支原体污染时，应直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。,病毒的污染和检测,细胞的直接观察,动物接种检查,电子显微镜观察,免疫学检查,PCR技术,第三节 建立细胞系或细胞株,一、体外培养细胞的种类和命名,（一）初代培养(原代培养),初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。,一旦已进行传代培养(subculture)的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。,原代培养,直接从体内取出的细胞进行的第一次培养物。,优点：,组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。,大鼠肝细胞原代培养,1.细胞种类：大鼠原代肝细胞；2.培养的天数：刚分离，未经培养；细胞状态与特征简述：刚分离时球形透亮，贴壁,后呈不规则。,(二）传代培养,将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即称为传代培养,原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养。,HepG2细胞,细胞种类：人肝肿瘤细胞；培养的天数：传代培养2天；细胞状态与特征简述：呈多角型、不规则,贴壁生长，成团聚集。,根据细胞生长的恃点，传代方法有3种：,1悬浮生长细胞传代,离心法传代：离心（,1000转/分,）去上清，沉淀物加新,培养液后再混匀传代。,2半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）,此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用,直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。,3贴壁生长细胞传代,采用酶消化法传代。,常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。,细胞传代方法,首次传代注意事项,细胞生长密度不高时，不能急于传代；,原代培养的贴壁细胞需控制消化时间；,吹打已消化的细胞应减少机械损伤；,首次传代时细胞接种数量要多一些；,首次传代培养的pH应偏低些；,小牛血清浓度可加大至15%20%左右,。,细胞计数,计数结果以每毫升细胞数表示,细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同,血细胞计数器：手工计数细胞,计数仪：人工计数,细胞计数步骤,1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板,上。,2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满,盖片和计数板之间。,3、静置3分钟。,4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数。,细胞数/ml4大格细胞总数/410,4,注意,：压线细胞只计左侧和上方的。,镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。,Cell conc=total cell#,50,000 cells/ml,培养细胞活力测定,细胞活力：,总细胞中活细胞所占的百分比,由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。,复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。,测定方法,台盼蓝法,活细胞不被染色，死细胞染成蓝色。,流式细胞仪,细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等。,四唑盐,（MTT）,比色法,四唑盐,（MTT）,商品名为噻唑蓝；,MTT,比色法的原理：,活细胞中琥珀脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物甲,臢,（formazan),，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。,二甲亚砜,（DMSO）,能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的,formazan,量成正比。,甲臢染料在A570nm处产生吸收值，用酶标仪测定OD值；,传代注意事项,接种数量为510,4,810,5,个/ml,传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。,培养液由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。,如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代。,细胞系（Cell Line）,培养物开始,第一次,传代培养后的细胞,有限细胞系（Finite Cell Line）,连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）,肿瘤细胞系或株我国已建细胞系主要为这类细胞。,肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞,具有不死性和异体接种致瘤性。,细胞株,细胞株:用,单细胞,分离培养增殖形成的具特定生长特性的细胞群。,再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株。,克隆细胞株,从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养,或通过筛选购方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细,胞株。,细胞培养板,6孔，,12孔，,24孔，,48孔,96孔,二倍体细胞,培养细胞染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数,相同或基本相同,(2n,细胞占,75,或,80,以上,),的细胞群，称二倍体细胞培养。二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。,对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称；细胞的命名无严格统一规定，大多采用有一定意义缩写字或代号表示。但不论什么形式，均不宜太长，以便记忆和了解，今列举以下几种代表性的细胞名称供参考；,HeLa,：为供体患者的性名,(,来源于宫颈癌,),CHO,：中国地鼠卵巢细胞,(Chinese Hamster Ovary),宫,743,：宫颈癌上皮细胞，,1974,年,3,月建立,NIH3T3,：美国国立卫生研究所,(National Institute of,Health),建立,每,3,天传代一次，每次接种,310,6,细胞毫升。,细胞系或细胞株的命名,