第四章病毒a.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章,病 毒,2016,年的诺贝尔生理学或医学奖，颁发给了日本科学家大隅良典，以奖励他在阐明细胞自噬（,Autophagy,，或称自体吞噬）的分子机制和生理功能上的开拓性研究。,自噬就是细胞降解回收自己零部件的过程,这个过程能快速提供能量和材料用于应急,还能用来对抗病原体、清除受损结构,自噬机制的受损和帕金森病等老年疾病密切相关,20,世纪,50,年代中期，科学家观察到细胞里的一个新的专门“小隔间”（这种隔间的学名是细胞器），包含消化蛋白质，碳水化合物和脂质的酶。这个专门隔间被称作“溶酶体”，相当于降解细胞成分的工作站。比利时科学家克里斯汀,德,迪夫（,Christian de Duve,）在,1974,年因为溶酶体的发现，被授予诺贝尔生理学或医学奖。,我们的细胞有不同的细胞“小隔间”，承担不同的作用。溶酶体就是这样一种隔间，里面有用于消化细胞内容物的消化酶。人们在细胞内又观察到了一种新型的囊泡，叫做自噬体。自噬体形成的时候，逐渐吞没细胞内容物，例如受损的蛋白质和细胞器；然后它与溶酶体相融，其中的内容被降解成更小的物质成分。这一过程为细胞提供了自我更新所需的营养和材料。,本章内容,第一节 概述,第二节 病毒的形态结构与化学组成,第三节 病毒的复制,第四节 噬菌体,第五节 真核细胞病毒,第六节 亚病毒,第七节 病毒与实践,第一节 概述,一、病毒的发现和研究历史,二、病毒的定义与特点,三、病毒的分类,Aristotle,记述,:,早在公元前四 世纪就有了关于疯狗咬人致病，即,狂犬病,的记载并发现它能够传染给其他许多动物。,3000 BC,埃及,孟非思,壁画中长老患小儿麻痹症。,一,、病毒的发现和研究历史,1898,年，荷兰生物学家,贝哲林克,Beijerinck,对烟草花叶病,病原体,的研究结果：,能通过细菌滤器；,可被乙醇沉淀而不失去其感染性，,能在琼脂凝胶中扩散；,用培养细菌的方法不能被培养出来，,推测只能在植物活细胞中生活；,“,病毒,(,Virus,),”,贝杰林克,1900,年前后，包括,口蹄疫,（,foot and mouth disease,）在内的多种动植物疾病,病原体,的滤过性特性被证明。,1915,年,F W Twort,发现细菌（,Shigella dysenteriae,）病毒,-,噬菌体,1935,年，,W M Stanley,首次提纯并结晶了烟草花叶病毒；,与,Bawden,等证明烟草花叶病毒的本质为核蛋白；,1940,年，,Kausche,首先用电镜观察到烟草花叶病毒颗粒,.,1952,年，,Hershey,和,Chase,利用同位素证实噬菌体的遗传物质是,DNA,，将人类带入病毒的分子生物学阶段。,病毒被认为是地球上数量最多的一类生物，总丰度约为,10,31,，仅在海洋里的数量估计超过,10,30,，其中大部分是感染细菌的噬菌体（,Kimura,等,2008,）。,据估计，病毒在环境中每秒可发生高达,10,24,次的寄主侵染，以维持它们在环境中的数量，说明病毒的分布和丰度可直接影响微生物的分布，进而影响的地球化学循环。,目前，人们对土壤病毒的认识和生态学研究还非常薄弱，也远远滞后于细菌和真核生物病毒生态学的研究。,环境中的病毒,凡在有细胞生物生存的地方，都有与其相对应的病毒存在,每个喷嚏的飞沫含,4500-150000,个细菌，,重感冒患者为,8500,万个病毒粒子；,SARS,患者？,极大地丰富了现代生物学,（微生物学、分子生物学、分子遗传学）,的理论与技术,；,病毒学：,研究病毒（,virus,）的,本质及其与宿主,的相互作用的科学，是微生物学的重要分支学科。,有效地,控制和消灭,人及有益生物的病毒病害；,利用病毒对有害生物、特别是害虫进行生物,防治,；,发展以基因工程为中心的生物高新技术,产业,；,非细胞生物,至少含核酸和蛋白质二种组分,亚病毒,真病毒,类病毒,拟病毒,朊病毒,只含不具独立侵染性的,RNA,组分,只含单一蛋白质组分,只含具独立侵染性的,RNA,组分,本章主要介绍真病毒,二、病毒的定义与特点,病毒：是一种结构简单，能够自我复制并具有侵染性的独特非细胞生物体。,现代病毒学家把病毒这类非细胞生物分成,真病毒,(,Euvirus,，简称病毒,),和,亚病毒,(,Subvirus,),两大类：,卫星病毒,卫星,RNA,只含与侵染无关的,RNA,组分,与真病毒伴生的缺陷病毒,病毒是一类既具有化学大分子属性，又具有生物体基本特征；既具有细胞外的感染性颗粒形式，又具有细胞内的繁殖性基因形式的独特生物类群。,病毒分两个阶段（以两种形式）存在：,胞外阶段：“毒粒”形式,存在,（离体条件下）,，具有感染性，,无生命特征但不能独立 活细胞增殖；,胞内阶段：,主要以正在复制的,核酸形式,存在，诱导宿主,细胞合成病毒组分；,病毒的特性,1,）,个体微小,，可通过细菌滤器，在电子显微镜下才能看见；,2,）,不具有细胞结构,，其主要成分为核酸和蛋白质，故称为,“分子生物”；,3,）,一种病毒只含有,DNA,或,RNA,一种类型的核酸；,4,）,绝对的细胞内寄生,，在细胞外不能增殖：既无产能酶系，也无蛋白质和核酸合成酶系，只能利用宿主活细胞内现成的代谢系统合成自身的核酸和蛋白质；,5,）,以核酸,复制,和蛋白质,合成,、然后,装配,的过程实现其大量繁殖；,7,）,对大多数抗生素不敏感，对干扰素敏感,。,6,）,在,离体条件下,，以无生命的生物大分子状态存在，并,保持其侵染性,；,8,）有些病毒的核酸还能整合到,宿主的基因组,中，并诱发,潜,伏性感染,。,一、病毒的形态结构,1,、病毒的形状和大小,个体小（测量单位,nm,），必需在电镜下观察；,不同病毒的毒粒大小差别很大（直径,10300nm,）,（,1,）大小,似菌病毒：直径,200nm,（最大）,猪圆环病毒,：直径,17nm,（最小）,第二节 病毒的形态结构与化学组成,微生物个体直径的比约为：,病毒,:,细菌,:,真菌,1:10:100,天花病毒,脊髓灰质炎病毒,噬菌体,450 nm,300 nm250 nm 100 nm,2 000 nm,1 250 nm10 nm,1 300 nm10 nm,1 300 nm10 nm,21 nm,18 nm,16.5 nm,12,18 nm,16 nm,9,11 nm,5 nm800 nm,似菌病毒,猪圆环病毒：直径,17nm,（,2,）病毒的形态,砖块状,（痘病毒）、,丝状,（大肠杆菌,f1,、,fd,、,M13,噬菌体）等；,多形性,（流感病毒，新分离的毒株呈丝状，在细胞内稳定传代后转变为拟球状）。,基本形态：,球形或拟球形,（大多数动物病毒）；,杆状,（植物病毒和昆虫病毒）；,蝌蚪状,（大肠杆菌,T,偶数噬菌体）,其他形态：,牛痘病毒,埃博拉病毒,天花病毒，好似一幅油画作品，放大倍率,2.85,万倍。照片中，黄色为蛋白质，红色为,DNA,。,好似寿司的天花病毒。这种病毒由遗传物质（红）和,DNA,构成，外面包裹着蛋白外壳（黄）,烟草花叶病毒,噬菌体,M13,噬菌体,T4,大肠杆菌,噬菌体,f2,、,MS2,脊髓灰质炎病毒,牛痘病毒,腺病毒,衣原体,人血红细胞,各种毒粒的大小、形态差异很大,2.,病毒粒子的结构,病毒是一类非细胞生物，故称之为,病毒粒,或,病毒体,（,virion,）。,病毒有时也称,病毒颗粒,或,病毒粒子,（,virus particle,），专指成熟的、结构完整的和有感染性的单个病毒。,基本构造：核衣壳,(nucleocapsid),非基本构造,病毒粒子的结构,核心（,core,）：,DNA,或,RNA,衣壳（,capsid,）：,蛋白质,包膜,(envelope),：,含蛋白质或糖蛋白,的类脂双层膜,刺突,(spike),：糖蛋白,核心,衣壳,包膜,刺突,衣壳粒（,capsomere,或,capsomer,）：是组成衣壳的蛋白质亚单位,对称体制,螺旋对称,二十面体对称,复合对称,无包膜,有包膜,杆状：烟草花叶病毒（,TMV,）等,丝状：大肠杆菌的,f1,、,fd,、,M13,等,卷曲状：正粘病毒（流感病毒）等,弹状：狂犬病毒，水泡性口膜炎病毒等,无包膜,有包膜：,疱疹病毒,大型：腺病毒等,小型：脊髓灰质炎病毒，,X174,噬菌体等,无包膜：,大肠杆菌的,T,偶数噬菌体（蝌蚪状）等,有包膜：,痘病毒（砖块状）,3.,病毒粒的对称体制,螺旋对称：烟草花叶病毒,二十面体对称：腺病毒,复合对称：,T,偶数噬菌体,3,种典型形态的病毒及其代表,壳体外形如中空的蛋白质圆管，呈坚硬或柔韧状。,由,2130,个,相同的蛋白质亚基（,158,个氨基酸）,以,逆时针,方向螺旋状排列，形成一个长,300nm,，内径,4nm,，外径,15nm,的刚直中空柱。,ssRNA,盘绕在壳体内面由亚基形成的沟内，与蛋白质亚基通过弱键结合。,1.,螺旋对称壳体病毒,代表：,TMV,直接影响烤烟的产量和质量,感病植物症状：,花叶，叶片轻度扭曲，,天气干燥和炎热的时候，,下部叶易受到花叶烧伤,。早期感病植株还表现矮化症状。,并非所有螺旋对称衣壳都像,TMV,衣壳一样是刚直的，流感病毒的,RNA,就包围在薄的、柔软易弯曲的螺旋壳体内，其衣壳折叠在一起，外有包膜。,流感病毒,二十面体对称壳体病毒,衣壳有,20,个等边三角形面，,30,条边，,12,个顶角。二十面体衣壳在形成时通常是由五边形衣壳粒（五邻体）和六边形衣壳粒（六邻体）组成的,。,核心为线状双链,DNA(dsDNA),，核酸分子以高度卷曲的状态存在于衣壳内。,代表：腺病毒,五邻体,六邻体,其壳体由头部和尾部组成。通常头部呈二十面体对称，尾部呈螺旋对称。线状,dsDNA,折叠盘绕于头部的核心。,复合对称衣壳病毒,代表：大肠杆菌的,T,偶数噬菌体,头,尾髓,颈环,尾鞘,尾丝,刺突,基板,病毒粒,大量聚集,并使,宿主细胞发生病变时，就,形成了具有一定形态、构,造并能用光镜加以观察和,识别的,特殊“群体,”，称之,为多角体。,4.,病毒的群体形态,（,1,）多角体,多角体,多角体的存在部位,多数位于,细胞质,内，具嗜酸性，,例如，痘病毒和狂犬病毒的包涵体。,少数位于,细胞核,内，具嗜碱性，,例如，疱疹病毒和腺病毒的包涵体。,在,细胞质,细胞核,内，,例如，麻疹病毒的包涵体。,病毒多角体的应用,用于病毒病的诊断,用于生物防治,核型多角体病毒（,NPV,）：在,昆虫细胞内形成,多角形包含体，,是我国自主研究并应用于农业实践的第一个病毒杀虫剂。,（,2,）噬菌斑（,plaque,）,噬菌体在细菌或放线菌,的菌苔上形成的,“负菌落”,即为,噬菌斑,（,plaque,）,。,将少量的噬菌体和大量的,宿主细胞的混合液与,45,左右,的琼脂培养基在培养皿中充分,混匀，铺平后培养,10 h,左右，,肉眼可见一个个透亮不长菌的,小圆斑，是由噬菌体在菌苔上,形成的,“负菌落”，,即,噬菌斑,。,设,0.10mL,稀释度为,10,-6,的病毒悬液可产生,75,个噬菌斑，则样品的噬菌斑形成单位为：,PFU/mL=,（,75 PFU/0.10 mL,）,（,10,6,）,=7.5 10,8,噬菌斑,（,3,）空斑（,plaque,）,由动物病毒在宿主单层细胞培养物,上形成一个与噬菌斑类似的肉眼可见的,局部病损区域，称之为,蚀斑,或称,空斑,（,plaque,）,。,Dulbecco,和,Vogt,于,1953,年发明了单,层动物细胞上的病毒空斑计数法，可进行,有活性的动物病毒粒子的计数。,正常细胞,异常细胞,若标本经过适当稀释进行接种并辅以染色处理，病毒可在培养的细胞单层上形成肉眼可见的局部病损区域，即蚀斑（,plaque,）或称空斑。,正常细胞,异常细胞,由植物病毒在植物,叶片上形成的局部坏死,斑，称之为,枯斑,（,lesion,，病斑）。,（,4,）枯斑（,lesion,）,是,DNA,还是,RNA,；,是单链（,ss,，,single strand,）结构还是双链,（,ds,，,double strand,）结构；,呈线状还是环状；,是闭环还是缺口环；,基因组是单分子、双分子、三分子还是多分子；,核酸的碱基（,b,，,base,）或碱基对（,base pair,，,bp,）数，以及核苷酸序列等。,病毒核酸类型区分的指标：,二、病毒的化学组成,1,、病毒的核酸,病毒基因组大小差别很大,最小的基因组（,MS2,病毒）只有约,3kb,，仅够编码,34,种蛋白质，这些病毒利用重叠基因来节省空间。最大的基因组（,T,偶数噬菌体，疱疹病毒，痘病毒）达,300kb,，可编码,100,多种蛋白质。,单链,DNA,（,ss DNA,）,双链,DNA,（,ds DNA,）,单链,RNA,（,ss RNA,）,双链,RNA,（,ds RNA,）,4,种类型,动物病毒,这,4,种类型都有；,植物病毒,通常含有,ssRNA,；,噬菌体,通常为,ds DNA,，但也有一些噬菌体为,ss DNA,或,ss RNA,。,若干有代表性病毒的核酸类型,(1)DNA,病毒,dsDNA,：大多数,DNA,病毒以,dsDNA,作为遗传物质。许多病毒,dsDNA,经过修饰，呈线性，少数为环状,dsDNA,。,特殊的碱基：除常见核苷酸外，许多病毒具有特殊的碱基，如，大肠杆菌,T,偶数噬菌体以,5-,羟甲基胞嘧啶,代替胞嘧啶。,噬菌体的线性,dsDNA:,有,12,个核苷酸组成的粘性末端，粘性末端配对可使,DNA,环化。,ssDNA,:,少数，如,X174,、,M13,噬菌体等，有线性和单链闭合环状,DNA,两种。,(2)RNA,病毒,多数,RNA,病毒以,ssRNA,作为它们的遗传物质。,正链或阳性链：,RNA,碱基序列与病毒,mRNA,相同，指导蛋白质合成。如：脊髓灰质炎病毒，等,负链或阴性链：病毒,RNA,基因组与病毒,mRNA,互补。如：狂犬病毒，等。,片段基因组：许多,RNA,病毒基因组被分为独立的片段，每个片段编码一种蛋白。有的病毒基因组可以分为,10,到,12,个片段（如呼肠病毒），通常所有的片段都包含在同一个衣壳中。不过，也有些病毒将片段基因分布在不同的病毒粒子中（如：雀麦花叶病毒），但它们能够成功地侵染同一宿主。,许多植物及动物病毒的正链,RNA,基因组,5,端具有,7-,甲基鸟嘌呤核苷帽子结构，,3,末端具有,poly-A,尾巴。,少部分病毒具有,dsRNA,基因组，都是片段式的。,2,、病毒的蛋白质,衣壳蛋白,：占病毒蛋白质成分的绝大部分。保护核酸；当病毒无包膜结构时，衣壳参与病毒对宿主的吸附、侵染；决定病毒对宿主的专一性和病毒的抗原性。,包膜蛋白,：包膜的脂质和碳水化合物是正常的宿主组成成分，但蛋白是由病毒基因编码形成的。,存在于病毒中的酶类,：病毒酶位于衣壳内，其中,许多酶参与核酸的复制,，例如，逆转录酶。也有些病毒的酶位于包,膜或衣壳,上（例如，流感唾液酸苷酶），,协助病毒的侵染,。,包膜糖蛋白,基质蛋白,病毒的主要表面抗原，有些介导病毒的进入,构成亚膜结构，介导核衣壳与包膜糖蛋白之间的识别,3,、病毒的其它化学成分,包膜中含有来源于宿主细胞的,脂类,，其中,50-60%,为磷脂，其余为胆固醇。此外，少数无包膜的病毒也存在脂类；,有些病毒的包膜和衣壳中含有少量,糖类,(,以糖脂,/,糖蛋白形式存在,),；,一些病毒粒子中存在,有机阳离子,（如丁二胺、精胺）和,无机阳离子,。,三、病毒的分类,病毒几乎可以感染所有的细胞生物，并具有宿主特异性。,人们习惯根据其,宿主种类,将病毒分类：,噬菌体（,phage,）,真菌病毒（,fungi viruses,）,植物病毒（,plant viruses,）,动物病毒（,animal viruses,）,国际病毒分类委员会（,International Committee for Taxonomy of Viruses,ICTV,）提出了分类依据和建立了分类系统。,分类依据,主要以,病毒粒子特性,、,抗原性质,以及,生物学特性,等作为依据。,命名规则,1998,年国际病毒分类委员会提出,41,条新的病毒命名规则，病毒分类系统依次用目、科、属、种分类等级。,2012,年，,ICTV,权威发布确定,2284,种病毒与类病毒,病毒粒子特性：,病毒形态,：如大小、形状、包膜有无突起，衣壳结构及其对称性；,病毒生理生化和物理性质,：如分子量，沉降系数，浮力密度，病毒粒子在不同,pH,、温度、,Mg,2+,、,Mn,2+,、变性剂、辐射中的稳定性；,病毒基因组,，如基因组大小、核酸类型、单双链、线状或环状，正负链，,G+C,含量比、核苷酸序列等；,病毒蛋白,，如结构蛋白和非结构蛋白的数量，大小以及功能和活性，氨基酸序列等；,病毒脂类含量和特性,；,碳水化合物含量和特性,；,病毒基因组组成和复制,。,第三节,病毒的复制,一个完整的复制周期包括,吸附、侵入、脱壳、生物合成、装,配,与,释放,等步骤。,病毒增殖所需原料、能量和生物合成的场所均由宿主细胞提供，在病毒核酸的控制下合成病毒的核酸（,RNA,或,DNA,）与蛋白质等成分，然后在宿主细胞的细胞质或细胞核内装配成为病毒粒子（指成熟的或结构完整、有感染性的病毒个体），再以各种方式释放到细胞外，感染其他细胞。这种增殖方式称为,复制,。,病毒是严格细胞内寄生物，只能在活细胞内繁殖。,敏感细胞,随机碰撞而接触（静电引力或氢键）,可逆吸附，无特异性（非细胞颗粒也可吸附）,病毒表面蛋白与细胞受体的结合,特异性，不可逆吸附，启动病毒感染的第一阶段,病毒粒,1,吸附,：感染的起始期，病毒附着于敏感细胞的表面。,病毒表面结构或附着位点识别并结合到易感细胞表面相应的受体上。,特异性吸附决定病毒的组织亲嗜性和感染宿主的范围。,特异性吸附,2,侵入,：以各种方式（取决于宿主细胞的性质）侵入敏感细胞内。,2,）,融合,：在细胞膜表面病毒包膜与细胞膜融合，病毒的核衣壳进入胞浆。,1,）,直接进入,：核酸注入细胞质。,3,）,胞饮,：细胞膜内陷使整个病毒被吞饮入胞内,3,脱壳,：脱去衣壳和包膜，方式因种而异。,4,生物合成,：包括核酸的复制和蛋白质的合成等。,在此期间，用血清学方法和电镜检查，不能从细胞内检出病毒体，称为隐蔽期。病毒生物合成主要包括,mRNA,转录,、,蛋白质合成,及,病毒基因组复制,。,根据病毒所含的核酸的性质和状态分类：,双链,DNA,、,单链,+DNA,、,双链,RNA,、,单链,+RNA,、,单链,-RNA,等。,1),双链,DNAmRNA,蛋白质，如天花病毒、,T-,偶数噬菌体。,2),单链,+DNADNAmRNA,蛋白质。,3),双链,RNAmRNA,蛋白质，如呼肠孤病毒。,4),单链,-RNAmRNA,蛋白质，如流感病毒、副流感病毒、狂犬病毒。,5),单链,+RNA RNA,复制酶,RNAmRNA,蛋白质，脊髓灰质炎病毒。,6),单链,+RNA-DNADNAmRNA,蛋白质，即逆转录病毒又称,RNA,肿瘤病毒。,5,装配与释放,：子代病毒核酸与结构蛋白合成后，可在宿主细胞内一定部位装配成子代病毒的核衣壳。,释放子代病毒体的方式：,DNA,病毒,多数核内装配；,RNA,病毒,多数胞浆内装配。,包膜病毒,出芽释放；,无包膜病毒,破胞释放。,第四节 噬菌体,一、噬菌体的形态结构,1,、组成：,主要由蛋白质和核酸组成。,2,、基本形态：,蝌蚪形、微球形和丝状。,噬菌体的基本形态和大小,凡在短时间内能连续完成吸附、侵入、增殖、,装配和裂解,5,个阶段而实现其繁殖的噬菌体，称为,烈性噬菌体,（,virulent phage,）；,温和噬菌体（,temperate phage,）：,烈性噬菌体（,virulent phage,）：,进入菌体后并不进行增殖或引起溶菌，将自己的,基因组整合到宿主基因组上，并随之复制而进行同步,复制，则称之为,温和噬菌体,（,temperate phage,）。,噬菌体的两个类型,二、烈性噬菌体的复制周期,裂解性生活周期：,DNA,噬菌体在宿主细胞内复制后，宿主细胞裂解并释放新噬菌体。（,E.coli,的,T,偶数噬菌体）,烈性噬菌体的繁殖过程一般分为五个阶段：,即,吸附,、,侵入,、,复制,、,装配和释放,。,（,1,）吸附和侵入,受体（吸附）位点：细胞壁上的脂多糖、蛋白质、磷壁酸，以及鞭毛和菌毛。,附着 固着 尾部收缩 刺入细胞,DNA,注入,T4,噬菌体吸附和侵入宿主细胞过程：,（一）双链,DNA,噬菌体的复制,（,T4,噬菌体的复制周期）,自外裂解是,不能产生子代噬菌体,的裂解方式。,如果大量噬菌体在短时间内吸附于同一细胞上，使细胞壁产生许多,小孔，也可引起细胞立即裂解，但并未进行噬菌体的增殖，这种现,象称为,自外裂解,（,lysis from without,）。,（,2,）噬菌体大分子的合成,噬菌体,DNA,注入宿主细胞后，宿主细胞自身的,DNA,、,RNA,和蛋白质的合成便会中止，转而合成病毒复制所需的成分。,通过,3,个转录阶段增殖,病毒的复制周期示意图,（,2,）噬菌体大分子的合成,早期,mRNA,：,宿主,RNA,聚合酶开始合成的病毒,mRNA,，即噬菌体,DNA,复制前转录的,mRNA,。,早期蛋白,：早期,mRNA,翻译成的蛋白，这些蛋白将接管宿主细胞并合成病毒核酸。其中,一些酶将宿主,DNA,降解成核苷酸,，为病毒,DNA,的合成提供原料；一些蛋白,对宿主细胞,RNA,聚合酶进行修饰,，使其识别病毒的,DNA,启动子，开始转录合成中期,mRNA,。,中期,mRNA,：即复制病毒,DNA,所需的酶的,mRNA,。,中期蛋白,：,中期,mRNA,翻译成的蛋白,(,DNA,复制所需的酶、羟甲基胞嘧啶合成酶以及晚期,mRNA,聚合酶等,),，,病毒,DNA,开始复制,(,某些碱基的修饰是抵制宿主的限制,),。,晚期,mRNA,：,DNA,复制完成后合成的,mRNA(,指导结构蛋白、装配蛋白、溶菌酶等,),。,晚期蛋白,：噬菌体的,结构蛋白、装配蛋白、溶菌酶,等这些细胞裂解期间合成的蛋白质,。,（,3,）噬菌体的装配,T4,噬菌体的装配是一个极为复杂的自我装配的过程。,大致分为,4,个独立的途径：,1,）头部壳体装入,DNA,形成成熟的头部,2,）由基板、尾管、尾鞘组装成无尾丝的尾部；,3,）头部与尾部自发结合；,4,）装上尾丝,头部,衣壳粒,DNA,衣壳,尾部,尾鞘,噬菌体,尾丝,（,4,）噬菌体的释放,37,培养时，侵染约,22,分钟后，,E.coli,发生裂解并释放约,300,个,T4,噬菌体。这一过程需要一些,T4,基因的支持：,一种基因,指导溶菌酶的合成,，溶菌酶可以攻击细胞壁的肽聚糖；,另一种噬菌体蛋白称为,holin,，它可,破坏细胞膜,，使溶菌酶到达并破坏细胞壁，同时阻止细胞膜上的能量代谢反应。,一步生长曲线,1,）,用噬菌体的稀释液感染高浓度的宿主细胞；,2,）,数分钟后，加入抗噬菌体的抗血清（中和未吸附的噬菌体）；,3,）,将上述混合物大量稀释，终止抗血清的作用和防止新释放的噬菌体感染其它细胞；,实验设计依据：,1,个菌体被,1,个噬菌体感染,避免二次吸附；细菌群体被噬菌体,同步感染,。,5,）,以感染时间为横坐标，病毒的效价为纵坐标，绘制出的病毒特征曲线，即为一步生长曲线。,4,）,保温培养并定期检测培养物中的噬菌体效价（对噬菌体含量进行计数）,；,噬菌体效价,-,指噬菌体的浓度，即,每毫升样品含噬菌体的个数。,通常是在含敏感菌的,平板,上,形成噬菌斑,进行噬菌体的计数，以每毫升中含有的噬菌斑形成单位（,plaque forming unit/ml,或,pfu/ml),表示其效价。,噬菌体的效价测定,CFU:colony forming unit/ml,菌落形成单位,以感染时间为横坐标，病毒效价为纵坐标，绘制定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线，称为,一步生长曲线,。,潜伏期：是从噬菌体吸附于宿主细胞表面到第一个子代噬菌体释放前的一段时间时间,。,包括：隐晦期和胞内积累期。,裂解量：是每个受侵染的细胞所产生的子代噬菌体的数目。,两个重要参数,裂解期,平均每一个宿主细胞裂解后所产生的子代噬菌体数称作,裂解量（,burst size,）。,裂解期噬菌斑数（,噬菌体的释放数,）,潜伏期噬菌斑数（,感染噬菌体的细菌数,）,裂解量,=,（二）单链,DNA,噬菌体的复制,(1)X174,噬菌体,DNA,进入宿主细胞后，利用宿主,DNA,聚合酶以单链,DNA,为模板合成双链模式,(,复制型,DNA);,(2),随后复制型,DNA,将指导合成更多的,mRNA,和,+DNA,基因组，,mRNA,翻译成病毒蛋白；,(3),此类噬菌体的裂解和释放机制和,T4,噬菌体基本相同。,E.coli,噬菌体,X174,的遗传物质是单链,DNA,。,其,DNA,序列与病毒,mRNA,相同，即为正链,，其基因组中有重叠基因（,overlapping genes,）。,复制过程,X174,（三）,RNA,噬菌体的复制,MS2,是,E.coli,的单链,RNA,噬菌体。吸附宿主的性菌毛，,RNA,进入宿主。其,RNA,只有,3,4,个基因，分别编码与吸附有关的蛋白、衣壳蛋白、,RNA,复制酶和细胞裂解蛋白。,+RNA,翻译,RNA,复制酶,RNA(ds),+RNA,可作为,mRNA,噬菌体蛋白,其单链,RNA,为正链，可作为,mRNA,指导噬菌体蛋白合成,组装成噬菌体,CRISPR,系统能够将各种外源的病毒或质粒,DNA,短片段,“,集中,”,到细胞基因组里某个特定的重复片段区域上，将这些,外源,DNA,当作细胞曾经经受过外源,DNA,入侵的一种记忆给储存起来。,然后这段,DNA,会转录生成,CRISPR,前体,RNA,（,precursor CRISPR RNA,），前体,RNA,生成之后会被专一性核酶切割成一段一段的重复,RNA,片段，这些小,RNA,分子就是,成熟的,CRISPR RNA,（,crRNA,）,。,然后,crRNA,会招募,CRISPR,相关蛋白,（,CRISPR-associated proteins,Cas,）与各种被细胞记住的外源的入侵,DNA,或,mRNA,片段结合，将它们彻底摧毁。,crRNA,与,tracrRNA,（称作反式激活的,crRNA,）互补，经过,RNase III,的切割之后，这一对互补的,RNA,（其中包括一条,42bp,的,crRNA,和一条,75bp,的,tracrRNA,）就可以充当,Cas9,因子的向导，帮助它,“,打鬼子,”,了。,瑞士军刀样的多功能蛋白,细菌（,bacteria,）和古细菌（,archaea,）都有一套防御机制抵御这种外来的侵入性因子，这种防御机制就是在成簇的、有规律间隔的多次重复短片段,（,clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR,）,的基础上建立起来的,适应性免疫系统（,adaptive immune system,）,HNH,核酶结构域负责切割与,crRNA,互补配对的那一条,DNA,链,RuvC,核酶结构域负责切割另外一条,DNA,链。,（,A,）,Cas9,蛋白需要,crRNA,和,tracrRNA,的共同帮助才能识别入侵的外来,DNA,分子，与之结合并将其降解。因为,crRNA,中的向导链部分可以与外源,DNA,的一条链互补并结合形成,R,环结构。在被识别区域两端的,DNA,基序也起到了非常重要的作用，它们可以帮助,DNA,链结旋打开双链，有利于,crRNA,链侵入。然后靶标,DNA,会在,Cas9,蛋白两个核酶结构域的作用下被切断。（,B,）级联反应复合体里含有一个,crRNA,，可是却最多携带了,5,种不同的,Cas,蛋白。所以它能够持续不断地招募核酶和解旋酶,Cas3,蛋白，不停歇地将入侵的外源,DNA,打开并切断。,