DB21∕T 2734.2-2017 病菌PCR 分型诊断方法 第2部分：产气荚膜梭菌PCR 分型检测方法.pdf

ICS 11.220 B 41 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 2734.22017 病菌 PCR 分型诊断方法 第 2 部分： 产气荚膜梭菌 PCR 分型检测方法 Method of PCR typing diagnosis for bacterial Part2：Method of PCR typing detection for Clostridium perfringens 2017 - 02 - 23 发布 2017 - 03 - 23 实施 辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 2734.22017 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 缩略语 . 1 4 原理 . 1 5 仪器和器材 . 1 6 试剂和引物 . 1 6.1 试剂 . 2 6.2 引物 . 2 7 操作步骤 . 2 7.1 样品的采集、前处理、存放与运输 . 2 7.1.1 采样注意事项 . 2 7.1.2 采样工具 . 2 7.1.3 肠内容物的采集与前处理 . 2 7.1.4 粪便的采集与前处理 . 3 7.1.5 产气荚膜梭菌纯培养物 . 3 7.1.6 存放与运送 . 3 7.2 PCR 检测. 3 7.2.1 DNA 提取. 3 7.2.2 PCR . 3 7.2.2.2 电泳 PCR 反应条件 . 4 7.2.2.3 电泳 . 4 8 试验成立的条件 . 4 9 结果判定 . 4 附录 A（规范性附录） 试剂配制. 5 A.1 电泳缓冲液（50 倍）. 5 A.1.1 0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（Ph 8.0） . 5 A.1.2 TAE(三羟甲基氨基甲烷一乙酸)电泳缓冲液(50 倍). 5 A.2 1%琼脂糖凝胶 . 5 DB21/T 2734.22017 II 前 言 标准病菌 PCR 分型诊断方法按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 标准病菌 PCR 分型诊断方法分为两个部分： 第 1 部分：大肠杆菌 PCR 检测方法； 第 2 部分：产气荚膜梭菌 PCR 分型检测方法。 本部分为病菌 PCR 分型诊断方法的第 2 部分。 本分由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。 本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。 本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。 本标准主要起草人： 赵凤菊、顾贵波、关淼、杨本勇、于长泳、李井春、马建山、魏园园、梁乔、张雷、郑付华、王欣、邓文超、王竹 DB21/T 2734.22017 1 病菌 PCR 分型诊断方法 第 2 部分： 产气荚膜梭菌 PCR 分型检测方法 1 范围 本标准规定了产气荚膜梭菌A、B、C、D、E 五型PCR检测方法的技术要求。 本标准适用于产气荚膜梭菌病的诊断、监测及流行病学调查，适用于动物粪便、肠内容物及纯培养物中产气荚膜梭菌-毒素、-毒素、-毒素和-毒素基因的PCR检测。 本标准中的试验操作应在生物安全级（BSL-2）以上的实验室进行。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 中华人民共和国农业部公告第302号 兽医实验室生物安全技术管理规范 GB/T 4789.13 食品卫生微生物学检验 产气荚膜梭菌检验 SN 0177 出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌检验方法 GB 16548-2006 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 SN/T2025-2007 动物检疫实验室生物安全操作规范 SN/T 2709-2010 国境口岸产气荚膜梭菌毒素检测方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 DNA：脱氧核糖核酸（Diethylpyrocarbonate） bp：碱基对（base pair） PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleoside triphosphate） Taq 酶： Taq DNA 聚合酶（Taq DNA polymerase） TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液（Tris acetate-EDTA buffer） 4 原理 根据产气荚膜梭菌产生的四种主要毒素即-毒素、-毒素、-毒素和-毒素基因序列设计五对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。 5 仪器和器材 DB21/T 2734.22017 2 本技术规范中需应用下列仪器和器材：高速台式冷冻离心机（最大离心力12 000 g以上）、冰箱、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、微波炉、分析天平、15 mL离心管、1.5 mL离心管和0.2 mL离心管、微量移液器和吸头等。 6 试剂和引物 6.1 DNA 抽提试剂：DNAzol Reagent，外观为淡绿色，于 48 保存。 6.2 无水乙醇：-20 预冷。 6.3 75%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，-20 预冷。 6.4 Taq 酶：Ex Taq DNA 聚合酶（5 U/L）。 6.5 dNTP(2.5 mmol/L)。 6.6 阳性对照：羊梭菌病多联干粉灭活疫苗、针对-毒素的阳性质粒。 6.7 阴性对照：灭菌双蒸水。 6.8 无菌生理盐水。 6.9 TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液。 6.10 溴化乙锭。 6.11 DL2000 DNA Marker。 6.12 引物 用于 PCR 反应的引物浓度为 20mol/L，其序列及扩增产物大小见表 1。 表1 产气荚膜梭菌引物序列表 基因 引物序列 扩增产物大小 bp F5- TTACTGCCGTTGATAGCG -3 -毒素 R5- TCATTTCCTGGGTTGTCC -3 475 F5- TTTCCGGTTAGATACTCGAT -3 -毒素 R5- ACAGTTTCTTTCACGCTCCA -3 513 F5- CTCATAATGTCCCTTCAC -3 -毒素 R5- CTCATCTCCCATAACTGC T-3 272 F5- AATGGCGATGAAAAGCCTACAC -3 -毒素 A R5-GCATAACCTGGAATGGCTGATA-3 692 F5- TAGAATCAAATACCGCTGGTGA-3 -毒素 B R5-CTGGATATGCTGCAACTAAAGG-3 111 注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所用实验使用的试剂等级均为不含DNA或DNase的分析纯或生化试剂；所有试剂均用无菌的容器分装。 7 操作步骤 7.1 样品的采集、前处理、存放与运输 7.1.1 采样注意事项 采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。 7.1.2 采样工具 DB21/T 2734.22017 3 药匙、15 mL离心管和1.5 mL离心管经1212高压灭菌20 min；剪刀、镊子经160 干热灭菌2 h。 7.1.3 肠内容物的采集与前处理 无菌采取病死或剖杀动物的小肠内容物，装入 15 mL 灭菌离心管中，按 110 倍体积加入无菌生理盐水，充分搅拌，室温放置 30 min，12 000 rpm 离心 20 min，取上清液转入 1.5 mL离心管中编号备用。 7.1.4 粪便的采集与前处理 用药匙无菌采取发病动物的新鲜粪便，装入 15 mL 灭菌离心管中，按 110 倍体积加入无菌生理盐水，充分搅拌，室温放置 30 min，12 000 rpm 离心 20 min，取上清液转入 1.5 mL 离心管中编号备用。 7.1.5 产气荚膜梭菌纯培养物 依据 GB/T 4789.13 和 SN 0177 进行产气荚膜梭菌的分离培养。挑取产气荚膜梭菌菌落，用1 mL 无菌生理盐水制备成一定浓度的菌悬液。然后转入 1.5 mL 灭菌离心管中编号备用。 7.1.6 存放与运送 采集或处理的样品应避免反复冻融(冻融不超过3次)。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在4 h之内运送到实验室检测；无冷藏条件的，于采样后2 h内送达实验室。按照兽医实验室生物安全技术管理规范进行样品的生物安全标识。 7.2 PCR 检测 7.2.1 DNA 提取 7.2.1.1 取 n 个灭菌的 1.5 mL 离心管，其中 n 为待检样品数+阳性对照管数+阴性对照管数，对每个离心管进行编号。 7.2.1.2 每管加入 800 L DNAzol，分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各 200 L，颠倒混匀后，4 12 000 g 离心 10 min。 7.2.1.3 取与 7.2.1.1 中相同数量灭菌的 1.5 mL 离心管，吸取 900 L 上清液转移至相应的管中，加入 500L 无水乙醇混匀。 7.2.1.4 4 12 000 g 离心 5min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入 1 mL 75 %乙醇，洗涤。 7.2.1.5 4 12 000 g 离心 5 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。如此洗 2 次。 7.2.1.6 4000 g 离心 10 s，用微量加样器小心将残余液体吸干，室温干燥 310 min。 7.2.1.7 加入20 L经高压处理的水，轻柔混匀，溶解管壁上的DNA，冰上保存备用；若需长期保存应放置-70 冰箱。 7.2.2 PCR 7.2.2.1 PCR 反应体系 建立25 L反应体系，按下列组分加入PCR专用离心管中： 灭菌蒸馏水 17.375L 10PCR Buffer 2.5L 2.5mmol/L dNTP 2L DB21/T 2734.22017 4 Ex Taq DNA 聚合酶 0.125L 上游特异性 PCR 引物 0.5L 下游特异性 PCR 引物 0.5L DNA 模板 2L 7.2.2.2 PCR 反应条件 94 预变性5 min；94 变性45 s，53 退火45 s，72 延伸45 s，35个循环；72 终延伸10 min。 7.2.2.3 电泳 将PCR扩增产物6 L与1 L上样缓冲液混合，点样于1 %琼脂糖凝胶（含0.5 g/mL溴化乙锭）板点样孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入DL2000 DNA Marker（分子质量标准物），缓冲液为1TAE，以5 V/cm电压电泳25 min。 8 试验成立的条件 当试验结果同时符合以下条件时试验成立，否则实验结果无效： 阴性对照未出现特异性条带； A型产气荚膜梭菌阳性对照出现475 bp的-毒素扩增条带； B型产气荚膜梭菌阳性对照出现475 bp的-毒素、513 bp的-毒素和272 bp的-毒素扩增条带； C型产气荚膜梭菌阳性对照出现475 bp的-毒素和513 bp的-毒素扩增条带； D型产气荚膜梭菌阳性对照出现475 bp的-毒素和272 bp的-毒素扩增条带； E型产气荚膜梭菌阳性对照出现475 bp的-毒素、 692 bp的-毒素A和111 bp的-毒素B 扩增条带。 9 结果判定 紫外凝胶成像仪下观察结果，试验条件成立时，实验结果可作为判定依据。 如被检样品中出现预期大小的扩增条带，则可初步判断被检样品中含有对应的产气荚膜梭菌毒素基因，初步判断为阳性结果的样品可通过复检和核酸序列测定进行确认。如被检样品中未出现预期大小的扩增条带，则可判断被检样品中不含有对应的产气荚膜梭菌毒素基因。 DB21/T 2734.22017 5 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂配制 A.1 电泳缓冲液（50 倍） A.1.1 0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（Ph 8.0） 二水乙二铵四乙酸二钠（分析纯） 18.61 g 灭菌双蒸水 80 mL 氢氧化钠 调pH至8.0 灭菌双蒸水 加至100 mL A.1.2 TAE(三羟甲基氨基甲烷一乙酸)电泳缓冲液(50倍) 羟基甲基氨基甲烷(Tris)（分析纯） 242 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH 8. 0) 100 mL 灭菌双蒸水 加至1000 mL 用时用灭菌双蒸水稀释使用。 A.2 1 %琼脂糖凝胶 琼脂糖(电泳级) 1 g TAE电泳缓冲液(50倍) 2 mL 灭菌双蒸水 98 mL 微波炉中完全融化，加0.5 g/mL溴化乙锭(EB)溶液10 L。 _