发酵桔皮对酿酒酵母生长性能的影响研究.pdf

试验研究2023年第44卷第21期 总第690期发 酵 桔 皮 对 酿 酒 酵 母 生 长 性 能 的 影 响 研 究 马吉喆1 吴雨来2 张林梅2 叶倩颖2 陆筑凤2 李加友2*徐 涛1(1.浙江理工大学生命科学与医药学院，浙江杭州 310018；2.嘉兴学院生物与化学工程学院，浙江嘉兴 314001)摘 要：研究旨在通过添加新型生长刺激剂促进酵母生长，提升酵母的生长效率。通过向酵母培养基中添加发酵桔皮，探究发酵桔皮对酵母生长的影响，利用单因素试验、正交试验、响应面分析等方法对添加发酵桔皮的酵母培养基进行优化。结果表明：添加发酵桔皮后的优化培养基为：葡萄糖100.756 g/L、蛋白胨8 g/L、酵母浸膏11.906 g/L、发酵桔皮（干物质含量）1.906 g/L、无水硫酸镁2 g/L、尿素2 g/L、磷酸二氢钾5 g/L。培养基优化后酵母生物量达到最大，比未添加发酵桔皮的培养基提高了1.3倍。发酵桔皮可以作为酵母生长刺激剂提高酵母活菌浓度，缩短酵母进入对数生长期的时间，从而促进酵母饲料工业降本增效。关键词：桔皮；发酵；酵母；生长刺激剂；酵母饲料doi:10.13302/ki.fi.2023.21.015中图分类号：S816.6 文献标识码：A 文章编号：1001-991X（2023）21-0094-07Study on Effect of Fermented Orange Peel on Yeast Growth PerformanceMA Jizhe1 WU Yulai2 ZHANG Linmei2 YE Qianying2 LU Zhufeng2 LI Jiayou2*XU Tao1(1.College of Life Science and Medicine,Zhejiang Sci-Tech University,Zhejiang Hangzhou 310018,China;2.School of Biological and Chemical Engineering,Jiaxing University,Zhejiang Jiaxing314001,China)Abstract：The research aims to promote yeast growth and improve yeast growth efficiency by adding new growth stimulants.By adding fermented orange peel to explore the effect of fermented orange peel on yeast growth in yeast medium.Next,single-factor experiments,orthogonal experiments,response surface analysis and other methods were used to optimize the yeast medium with fermented orange peel.The results showed that the optimized medium after adding fermented orange peel was:C6H12O6 100.756 g/L,peptone 9 g/L,yeast extract 11.906 g/L,fermented orange peel(dry matter content)1.906 g/L,MgSO4 2 g/L,urea 2 g/L,KH2SO4 5 g/L.After medium optimization,yeast biomass was maximized,which was 1.3 times higher than medium without fermented orange peel.Fermented orange peel can be used as yeast growth stimulants to increase yeast live bacteria concentration,shorten the time for yeast to enter the logarithmic growth period,thereby reducing costs and increasing efficiency for yeast feed industry.Key words：orange peel;ferment;yeast;growth stimulants;yeast feed随着生物工程技术、畜牧业和饲料工业的发展以及中国居民对高蛋白类食品需求量的增加1，酵母类产品的开发利用已成为饲料工业的重中之重。中国饲料工业协会明确指出：我国的高蛋白饲料在配方结构、产品创新中更加趋向于酵母培养物类的饲料添加剂2-3。酵母饲料是利用酵母的新陈代谢，通过微生物发酵技术制成含有活菌、适口性良好、安全、无污染、无残留的酵母培养物4-5。研究报道酵母饲料6-7不仅具有原料来源广泛、生产速度快、蛋白质含量高的优点，而且可以调节动物肠道微生物菌群结构、提高饲料利用率、增强动物机体免疫力8-12，在畜牧养殖业生产中具有广阔的应用前景。但酵母存在的培养产量低、效率差等问题，使得酵母铬、酵母葡聚糖、生作者简介：马吉喆，硕士，研究方向为发酵技术。*通讯作者：李加友，教授。收稿日期：2023-08-11基金项目：浙江省自然科学基金公益项目LGN22C200009；嘉兴市科技计划项目2021AD1001094SILIAO GONGYE2023年第44卷第21期 总第690期物多肽等相关酵母饲料成本过高13-15。研究表明，提高酵母的生长性能主要采用添加辅助因子16和培养基优化改良17等方法。其中，通过添加海藻糖等辅助因子可以增强酵母免疫力，使酵母具有高生物活性，但价格昂贵不便于投入到工业生产应用中。因此有必要进一步研究酵母菌在发酵过程中营养成分之间的相互作用，通过添加发酵桔皮和酵母培养基优化相结合，观测酵母的生长趋势变化，从而在酵母饲料工业中做到降本增效、改善生产工艺、提高产品的市场竞争力。1 材料与仪器1.1 试验材料桔皮，宁波市象山华宇罐头厂；葡枝根霉（Rhizopus stolonifer）1118，嘉兴学院发酵食品开发与分析检测实验室保藏菌种；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），安琪酵母股份有限公司；葡萄糖（食品级），浙江一诺生物科技有限公司；酵母浸膏，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；尿素（纯度99.5%）、无水硫酸镁（纯度99.5%）、磷酸二氢钾（纯度99%）、蛋白胨，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。初始发酵培养基（g/L）：葡萄糖100、酵母浸膏10、尿素2、无水硫酸镁2、磷酸二氢钾5。1.2 仪器与设备ZHWY-200B型全温摇床，上海智城分析仪器制造有限公司产品；CT14RD11台式离心机，上海天美生化仪器设备有限公司产品；FR124CN型分析天平，奥豪斯仪器有限公司产品；紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司产品。2 试验方法2.1 发酵桔皮的制备称取适量干燥桔皮，研磨过筛（10目筛网）置于发酵桶中，加入桔皮粉干重1.5倍质量的水，混合均匀，用直径1 cm打孔器从匍枝根霉1118的PDA固体培养基上取2个菌苔，加入培养基中，使菌种与桔皮粉充分接触。于28 恒温培养15 d。对发酵物进行过滤除渣，制成浸膏状水溶性发酵桔皮（干物质含量21%），4 下冷藏保存，备用。2.2 酵母培养菌种活化：将1 g酿酒酵母活性干酵母加入100 mL葡萄糖含量为2%的培养基中，38、220 r/min摇床振荡培养30 min，对菌种进行活化，制得种子菌液。酿酒酵母发酵培养：取 1 mL 种子菌液接种至100 mL发酵培养基中，28 恒温培养。2.3 酵母浓度测定2.3.1 标准曲线绘制取酵母发酵培养基中1 mL的样液于显微镜下计数，将样液分别梯度稀释10、20、30、40、50倍，并测定OD600，绘制OD600与对应酵母活菌数的标准曲线。2.3.2 检测方法参照参考文献18，采用吸光光度法对发酵液的生物量进行测定。并将发酵液进行梯度稀释至1/20，利用分光光度计于600 nm处测定吸光度，结果记为OD600，并以此读数作为培养基中的酵母浓度。2.4 培养基优化试验2.4.1 单因素试验以酿酒酵母初始发酵培养基为基础，分别考察发酵桔皮、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏等不同添加量对酿酒酵母生长的影响，每次处理只改变初始发酵培养基的一个因子。按1%（W/V）接入活化酿酒酵母，28 下恒温培养24 h检测OD600，确定各单因素的最佳水平。2.4.2 正交试验在单因素试验的基础上，以发酵桔皮（A）、葡萄糖（B）、蛋白胨（C）及酵母浸膏（D）为考察对象，采用L8(2)7正交试验设计，对酿酒酵母发酵培养基进一步优化。各因素与水平见表1。表1 正交试验因素水平（g/L）水平12A1.82.2B90110AB12C79AC12BC12D11132.4.3 Box-Benhnken响应面分析在正交试验基础上，采用 Box-Benhnken 设计结合响应面分析对发酵桔皮（E）、葡萄糖（F）、酵母浸膏（G）等三个主要影响因子进行优化。各因素 Box-Benhnken设计方法与水平见表2。表2 响应面分析各因素与水平(g/L）水平-101E1.522.5F90100110G1112132.4.4 桔皮发酵物成分检测用常规方法检测桔皮发酵物中橙皮苷19、黄酮20等药效成分含量以及多糖21、蛋白质22、脂肪23等营养成分。95试验研究2023年第44卷第21期 总第690期2.5 数据处理每组试验进行 5 次平行测定，借助 Minitab 16、Design-Expert 13.0和Origin 2021对数据进行统计分析。P0.05为差异不显著，0.05P葡萄糖（B）葡萄糖与发酵桔皮的交互作用AB酵母浸膏（D）蛋白胨（C）；另一方面，葡萄糖和发酵桔皮具有交互作用，可能是发酵桔皮有利于促进葡萄糖的代谢，具体机理有待深入研究。从表4可以看出，培养基各因子的最优组合为A2B2C2D1。但蛋白胨浓度的影响水平只有0.02，相对较小，因此进行单因素最佳水平的响应面分析试验时不作为主要考虑因素。理论最优培养基为（g/L）：葡萄糖110、蛋白胨9、酵母浸膏11、发酵桔皮2.2、无水硫酸镁2、尿素2、磷酸二氢钾5。3.4 Box-Benhnken响应面结果及分析3.4.1 Box-Benhnken响应面优化试验及结果分析设 OD600读数（Z）为响应值，采用 Box-Benhnken响应面优化设计原理，考察发酵桔皮（E）、葡萄糖（F）、酵母浸膏（G）三个因素对 OD600读数（Z）的影响。OD600读数响应面试验设计及结果见表5。由表5可以看出，不同添加量的E、F、G对OD600读数（Z）的影响各不相同。表4 正交试验结果编号12345678K1K2R因素A111122220.6430.6730.030B112211220.6470.6690.022AB112222110.6630.6540.009C121212120.6570.6590.002AC12122121BC12211221D122112210.6610.6550.006OD6000.6360.6380.6570.6420.6620.6530.6730.704注：K1代表“1”水平下试验数据平均值；K2代表“2”水平下试验数据平均值。表5 Box-Benhnken响应面优化试验及结果分析编号1234567891011121314151617E-11-11-11-11000000000F-1-1110000-11-1100000G0000-1-111-1-11100000Z0.6270.6240.6530.6110.6610.6190.6360.6270.6270.6420.6190.6270.7110.7030.7030.7090.7113.4.2 OD600读数响应面优化试验回归模型及方差分析将OD600读数（Z）响应面结果进行二次响应面回归分析，结果见表6。97试验研究2023年第44卷第21期 总第690期表6 各因素影响的主效应分析组分模型E-发酵桔皮浓度F-葡萄糖浓度G-酵母膏浓度EFEGFGEFG残差失拟项纯误差总计决定系数R2可调节系数R2预测系数R2准确性平方和0.022 90.001 20.000 20.000 20.000 40.000 30.000 00.005 40.007 70.054 00.000 10.000 10.000 10.023 00.996 10.991 20.980 435.126 1自由度911111111173416方差0.002 50.001 20.000 20.000 20.000 40.000 30.000 00.005 40.007 70.054 00.000 17.1610-60F值200.590.9112.7815.7830.0121.490.966 7426.46609.40426.460.426 6P值0.000 10.000 10.009 00.005 40.000 90.002 40.358 20.000 10.000 14，表示该单因素响应面模型信号充足，可以用于模型预测设计。其决定系数R2为0.996 1，表明99.61%以上的响应值均可由该模型解释。因此可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。通过Design-Expert 13软件进行二次响应面回归分析，得到多元二次响应面回归模型：Z=0.707 40.012 0E+0.004 5F0.005 0G0.009 7EF+0.008 3EG0.001 7FG0.035 8E20.042 8F20.035 8G2式中：ZOD600读数；E发酵桔皮浓度（g/L）；F葡萄糖浓度（g/L）；G酵母浸膏浓度（g/L）。3.4.3 三维响应面分析根据二次多项回归方程绘制出响应面，发酵桔皮浓度与葡萄糖浓度的响应曲面如图6，发酵桔皮浓度与酵母浸膏浓度的响应曲面如图7，葡萄糖浓度与酵母浸膏浓度的响应曲面如图8。根据发酵桔皮浓度、葡萄糖浓度与酵母浸膏浓度两两之间的响应曲面表明，在发酵桔皮浓度E坐标轴上，OD600读数变化最快，而在酵母浸膏浓度G的坐标轴方向，OD600读数变化较慢，说明发酵桔皮浓度的影响水平较大。其中图6的响应面扭曲最大，说明发酵桔皮浓度与葡萄糖浓度之间是具有明显交互作用；图 7的响应面扭曲程度也是显著的，说明发酵桔皮浓度与酵母浸膏浓度之间是具有交互作用。其中EF的P值小于0.05，证实正交试验中发酵桔皮浓度和葡萄糖浓度之间的交互影响作用，说明发酵桔皮的添加对OD600读数的影响并不是简单的线性关系，其中二次项EF、EG的P值小于一次项E、F的P值，且P值均小于0.05；说明该发酵桔皮对培养基中主要成分的交互影响作用大于其自身，表明发酵桔皮的添加可以刺激酿酒酵母的生长与代谢。3.5 酵母发酵培养基优化结果3.5.1 优化前后酵母数量的对比通过Design-Expert 13软件优化结果见图9，在此预测条件下酵母浓度为0.709，具有97.9%的可信度。98SILIAO GONGYE2023年第44卷第21期 总第690期通过对酿酒酵母进行培养后酵母浓度为0.695，达到了响应面分析预测值的98.3%；相对于不添加发酵桔皮的优化培养基，酵母浓度提高了37.4%；与不添加发酵桔皮的初始培养基相比，酵母浓度提高了130%（见图10）。1050.7Z1.50.720.680.660.640.620.61.71.92.12.32.5 9010095110E(g/L)F(g/L)图6 E与F响应面3D建模12.50.7Z1.50.720.680.660.640.620.61.71.92.12.32.5 111211.513E(g/L)G(g/L)图7 E与G响应面3D建模12.50.7Z900.720.680.660.640.620.695100105110 111211.513F(g/L)G(g/L)图8 F与G响应面3D建模3.5.2 酵母生长曲线绘制通过Design-Expert 13软件优化结果，表明酵母发酵最佳培养基为葡萄糖100.756 g/L、蛋白胨8 g/L、酵母浸膏11.906 g/L、发酵桔皮浓度1.906 g/L、无水硫酸镁 2 g/L、尿素 2 g/L、磷酸二氢钾 5 g/L。基于响应面分析得到的最优培养基培养酿酒酵母，以添加发酵桔皮的培养基为试验组，不添加发酵桔皮的培养基为对照组，绘制出酿酒酵母生长曲线，如图11所示。发现发酵桔皮添加能够在各个时间段明显提高酵母活菌数量，并且缩短酵母进入对数生长期的时间。3.6 桔皮发酵物成分检测结果发酵桔皮与未发酵桔皮中营养成分比较见表7。通过对桔皮进行发酵处理后，发酵桔皮中的脂肪含量下降51.99%，总黄酮含量、橙皮苷含量、多糖、蛋白质含量得到了明显的提高，使得发酵桔皮中含有更多可供酵母吸收和利用的相关物质。图9 响应面模型优化结果4 讨论黄酮是一类具有促生长、免疫调节、抗菌的天然植物化合物，其来源广泛并且应用前景广阔。通过对发酵桔皮和未发酵桔皮的成分进行测定，发现经过发99试验研究2023年第44卷第21期 总第690期酵后桔皮中相关营养物质的含量大幅度提高，其中发酵桔皮中的总黄酮含量是未发酵桔皮的3.24倍，橙皮苷的含量为之前的 1.86 倍，蛋白质含量为之前的4.71倍。说明通过对桔皮进行发酵处理后，不但桔皮中有效的中药成分总黄酮含量得到了提高，而且降低了其中的脂肪含量，提高了多糖以及蛋白质等可供酵母菌生长的小分子营养物质的含量。其中橙皮苷是由橙皮素和芸香糖构成的一种重要的二氢黄酮类物质，具有较高的抗氧化功能。使得酵母细胞的衰老速度下降，更具有生物活力，使得酵母的生长速度提高。左瑞华等27研究发现蕨菜黄酮可以提高肉鸡的平均日增重量。杨汝才等28在饲料中添加辣木黄酮显著降低了雏鸭血清中丙二醛（MDA）含量。王咏梅等29在饲料中添加桑叶黄酮使得虾的抗氧化性能得到提高。因此，桔皮经过发酵后可以凭借其自身无污染、高蛋白、高抗氧化的特性作为酵母的生长刺激因子用于酵母高蛋白饲料的生产中。表7 发酵桔皮与未发酵桔皮营养成分成分未发酵桔皮发酵桔皮总黄酮(mg/g)5.9219.21橙皮苷(%)2.254.18多糖(%)8.9912.03蛋白质(%)3.9118.40脂肪(%)10.565.075 结论在单因素试验基础上，经过正交试验选出关键影响因子，结合响应面优化分析获得了酿酒酵母培养基的相关数学模型，推测出最佳培养条件为：葡萄糖100.756 g/L、蛋白胨8 g/L、酵母浸膏11.906 g/L、发酵桔皮浓度1.906 g/L、无水硫酸镁2 g/L、尿素2 g/L、磷酸二氢钾5 g/L。在此条件下酵母浓度为0.695，是初始发酵培养基的1.3倍。与不添加发酵桔皮的检测结果对比，发酵桔皮可以提高酿酒酵母增殖速率，促进酿酒酵母生长，加快酵母进入对数生长期，是一种高效的生长刺激剂。本试验丰富了酵母的繁殖环境，提高了酵母的发酵能力，为酵母饲料工业生产高蛋白饲料、提高相关酵母培养物产量以及降低生产成本提供一种新的途径。参考文献1 宋志锋,方欣,扣泽华,等.酵母蛋白营养价值及其在仔猪饲粮中应用的研究进展J.饲料工业,2023,44(10):45-51.2 戴维,薛俊敬,班博,等.复合微生态制剂对蛋鸡生产性能、蛋品质及抗氧化性能的影响J.饲料工业,2020,41(5):23-29.3 张萌慧,于阿男,陈黎,等.复合微生态制剂对樱桃谷鸭生长性能、屠宰性能、肉品质和血清指标的影响J.中国畜牧杂志,2023,59(4):268-273.4 郑博予,王永志,祁宏伟.微生态制剂对肉牛生长性能、养分消化率、抗氧化性能和肝功能的影响J.饲料工业,2022,43(18):40-44.5 杨晓东,李清.酵母饲料在动物生产中的应用J.饲料博览,2019(4):19-22,26.6 VALLI C,ANURADHA P,BEAUCHEMIN K,et al.Effect of a yeast based feed additive(ADDON-Rumen Support)to counteract heat stress related productivity loss in dairy cattleJ.Indian Journal of Animal Research,2022,56(10):1235-1240.7 LYSIANE D,DAMIEN E,YACINE L,et al.Changes in digestive microbiota,rumen fermentations and oxidative stress around parturition are alleviated by live yeast feed supplementation to gestating ewesJ.Journal of Fungi,2021,7(6):447.8 王丽娟,韩业东,胡国清,等.复合酶和益生菌复合添加剂对仔猪生长性能的影响J.畜牧与饲料科学,2019,40(1):53-55.9 郭婷,宋利文,高民,等.酵母培养物对奶牛的营养生理作用及其机制J.饲料工业,2021,42(23):25-30.10 管晓轩,胡红莲,高民,等.复合微生态制剂在犊牛抗腹泻中应用的研究进展J.现代畜牧兽医,2022(8):74-78.11 温家姝,胡彩虹,崔世豪,等.微生态制剂对家禽肠道健康影响的研究进展J.动物营养学报,2021,33(4):1851-1858.12 贺峰,孙会,金雪莹,等.酿酒酵母对断奶仔猪肠道功能与健康及生长性能影响的研究进展J.饲料工业,2022,43(4):25-29.13 王芬.酵母发酵技术助推反刍动物健康养殖J.畜牧产业,2021(5):55-57.14 袁书林,王岩,冯占雨.酵母葡聚糖在家禽生产中的应用研究进展J.中国畜牧杂志,2022,58(11):58-64.酵母活菌检测值(OD600)原始发酵培养基0.80.70.60.50.40.30.20.100.3020.5410.4520.642正交优化培养基 响应面优化培养基0.5060.695不加发酵桔皮加发酵桔皮发酵培养基种类图10 优化前后酿酒酵母活菌对比酵母活菌OD6000.80.70.60.50.40.30.20.10260.5310.715实验组对照组0246810 12 14 16 18 20 22 24酵母培养时间（h）图11 酿酒酵母生长曲线100SILIAO GONGYE2023年第44卷第21期 总第690期QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定配合饲料中阿奇霉素含量 朱万燕1 徐文远1*张鸿伟2 伦才智1 鲍春晓1 徐 豪1 徐久飞1 王正国1（1.临沂海关综合技术服务中心，山东临沂 276034；2.青岛海关技术中心，山东青岛 266000）摘 要：试验旨在建立配合饲料中阿奇霉素含量的超高效液相色谱-串联质谱检测法。样品经水和乙腈提取，以氯化钠为盐析剂，提取液经乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）和氨丙基硅胶键合相吸附剂萃取净化，采用0.1%甲酸水溶液（内含5 mmol/L乙酸铵）-乙腈为流动相，在电喷雾离子源正离子多反应监测模式下进行测定，基质外标法定量。结果表明：阿奇霉素在1.050.0 g/L范围内线性关系良好，相关系数大于0.999，方法定量限为2.0 g/kg，在2.0、4.0、8.0 g/kg加标水平下（n=6）回收率为75%90%，相对标准偏差不高于8.7%。说明该法简单、快速、准确，适用于饲料中阿奇霉素的测定。关键词：阿奇霉素；QuEChERS；配合饲料；超高效液相色谱-串联质谱法；检测doi:10.13302/ki.fi.2023.21.016中图分类号：S816.17 文献标识码：A 文章编号：1001-991X（2023）21-0101-06Determination of Azithromycin in Compound Feed by QuEchERS Purification Coupled with Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass SpectrometryZHU Wanyan1 XU Wenyuan1*ZHANG Hongwei2 LUN Caizhi1 BAO Chunxiao1 XU Hao1XU Jiufei1 WANG Zhengguo1(1.Comprehensive Technology Center of Linyi Customs,Shandong Linyi 276034,China;2.Technology Center of Qingdao Customs,Shandong Qingdao 266000,China)Abstract：An analytical method was established for the determination of azithromycin in compound feed by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS).The samples were extracted by H2O and acetonitrile,作者简介：朱万燕，硕士，研究方向为商品分析检测。*通讯作者：徐文远，高级工程师。收稿日期：2023-08-2515 CASTRO E D M,CALDER P C,ROCHE H M.-1,3/1,6-glucans and immunity:state of the art and future directionsJ.Molecular Nutrition&Food Research,2021,65(1):1901071.16 何迎粉,何荣荣,刘敦华,等.海藻糖与酿酒酵母乙醇耐受性相关性的研究进展J.中国酿造,2020,39(11):1-4.17 张蕾,黄荣凯,胡喜贵,等.酿酒酵母培养基的优化J.河南科技学院学报:自然科学版,2015,43(4):18-23.18 张裕民.可见分光光度法对3种细菌计数的研究J.中国药事,2015,29(10):1066-1068.19 王建安,江海,陈文强,等.柑橘组织中橙皮苷的分析J.湖北农业科学,2013,52(7):1659-1662.20 赵凯丽,王秋亚,王慧,等.黄花菜总黄酮的提取、测定方法和生物活性研究进展J.山东化工,2022,51(11):110-112.21 王彦平,娄芳慧,陈月英,等.苯酚-硫酸法测定紫山药多糖含量的条件优化J.食品研究与开发,2021,42(4):170-174.22 朱连连,窦德强.阿胶、鹿皮胶中蛋白质及氨基酸含量测定J.亚太传统医药,2018,14(6):48-50.23 龚正波.索氏测粗脂肪的两种改进方法J.畜牧产业,2017(19):59-60.24 马吉喆,李镕涛,陆筑凤,等.提高酿酒酵母耐受性能的研究进展J.食品工业,2023,44(1):178-182.25 王润超,陈佳瑞,王国梁.葡萄糖添加对不同演替阶段森林土壤微生物及酶化学计量特征的影响J.水土保持研究,2022,29(2):154-162.26 侯阳阳.氮源对酿酒酵母酒精发酵的影响D.硕士学位论文.杨凌:西北农林科技大学,2022.27 左瑞华,王莉.蕨菜黄酮饲喂肉鸡的试验研究J.皖西学院学报,2012,28(2):10-12.28 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