反相高效液相色谱法测定刺五加叶中绿原酸和金丝桃苷含量.pdf

86BRAND&STANDARDIZATION品牌与标准化2023年第6 期反相高效液相色谱法测定刺五加叶中绿原酸和金丝桃苷含量田国贺，赵艳,孙海涛，韩松涛，韩晓红，逢焕欢（吉林省药品检验研究院，吉林长春130 0 33）【摘要】目的：建立HPLC法定量分析东北地区不同产地刺五加叶中绿原酸和金丝桃苷的含量。方法：采用三种不同品牌C18色谱柱，流动相A为0.3%磷酸溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱：0 3min，9 5%A；3 10 m i n，9 5%8 0%A；10 40 m i n，8 0%A；4050min，8 0%10%A；流速1.0 mL/min；柱温35C；进样量5L；检测波长为354nm。结果：绿原酸和金丝桃苷分别在0.39 5.9ug、0.0 8 1.2 u g 范围内呈良好的线性关系；精密度、稳定性、重复性试验RSD1.1%，绿原酸和金丝桃苷的加样回收率分别为102.3%98.4%。不同产地样品绿原酸含量范围为1.0 1mg/g10.71mg/g；金丝桃苷含量范围为0.2 5mg/g1.49mg/g。结论：建立的HPLC法可有效考察刺五加叶中多成分含量，不同地区间刺五加叶中绿原酸和金丝桃苷含量有差异【关键词】刺五加叶；绿原酸；金丝桃苷；反相高效液相色谱法【D O I编码】10.39 6 9/j.issn.1674-4977.2023.06.027Determination of Chlorogenic Acid and Hyperin in Acanthopanax SenticosusLeaves by Reversed Phase High-performance Liquid ChromatographyTIAN Guohe,ZHAO Yan,SUN Haitao,HAN Songtao,HAN Xiaohong,PANG Huanhuan(Jilin Provincial Institute for Drug Control and Research,Changchun 130000,China)Abstract:Objective:To establish a HPLC method for quantitative analysis of chlorogenic acid and hyperoside in the leaves ofacanthopanax senticosus from different areas in northeast of China.Method:Three different brands of C18 chromatographic columnswere used,with mobile phase A being 0.3%phosphoric acid solution and mobile phase B being acetonitrile.Gradient elution:03minutes,95%A;310 minutes,95%80%A;1040 minutes,80%A;4050 minutes,80%10%A;Flow rate 1.0 mL/min;Columntemperature 35 C;Injection volume 5 L;Detection wavelength is 354 nm.Results:Chlorogenic acid and hyperoside showed a goodlinear relationship in the range of 0.395.9 g and 0.081.2 g;The RSD of precision,stability and repeatability test is less than 1.1%,and the recovery of chlorogenic acid and hyperoside are 102.3%and 98.4%respectively.The content of chlorogenic acid in samplesfrom different areas ranges from 1.01 mg/g to 10.71 mg/g;The content range of hyperoside is 0.25 mg/g to 1.49 mg/g.Conclusion:Theestablished HPLC method can effectively investigate the content of multi-component in the leaves of acanthopanax senticosus,and thecontent of chlorogenic acid and hyperoside is different in different regions.Key words:acanthopanax senticosus leaves;chlorogenic acid;hyperoside;reversed phase high-performance liquid chromatography刺五加是我国东北地区道地药材，东北三省的产量占全国总产量的9 0%以上。各版中华人民共和国药典中刺五加药用部位为根、根茎及茎，同时近年文献也多集中在根及根茎的研究报道，刺五加作为药食同源的植物，史料中记载刺五【基金项目】2 0 2 3年吉林省中医药科技项目：中药材（中药饮片）刺五加叶质量评价的研究(2 0 2 30 7 5)。87田国贺等：反相高效液相色谱法测定刺五加叶中绿原酸和金丝桃苷含量|药品检验加叶也可人药。由于具有广泛的药用价值，导致野生刺五加资源遭受了严重的破坏，已被国家列为三级保护渐危品种。刺五加叶具有可再生性，但受药品标准规定限定，刺五加叶加工的产品多应用于保健品和功能性食品，因此有必要开展对刺五加叶活性成分的研究。目前，我国对于刺五加的人工栽培主要集中在东北长白山，松花江等地区。刺五加叶主要成分为黄酮类、木脂素类、苯丙素类和多糖 3-4,本文通过对东北地区不同产地刺五加叶的质量研究考察中发现，其中绿原酸和金丝桃苷含量较高。为进一步了解不同产地的刺五加叶质量，本文建立HPLC法同时测定其中绿原酸及金丝桃苷含量。1仪器与试药岛津LC-20AT型高效液相色谱仪，SPD-M20A型DAD检测器；MettlerMS105型精密天平。绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号110 7 53-202119)；金丝桃苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号111521-202310）。乙腈为色谱纯（德国MERCK公司），水为屈臣氏蒸馏水，其他试剂均为分析纯。刺五加叶来源于吉林省长白山十五道沟、靖宇县泉阳镇和辉南县小城子村、黑龙江省松江河老松江村和尚志市亚布力镇，共收集10 批样品，经我院中药室专家鉴定为五加科植物刺五加的干燥叶。2方法与结果2.1色谱条件本试验考察了 Sepax Amethyst C18-H（2 50 4.6 mm,5m)柱;Waters SunFire C18(4.6250 mm,5 m)柱;AgilentZorbaxSB-C18(2504.6mm,5+m)柱，三种色谱柱在正文色谱条件下，测定同一供试品溶液（长白山十五道沟）；流速：1.0mL/min；检测波长：354nm；柱温：35C；流动相A：0.3%磷酸溶液，流动相B：乙腈，梯度程序如表1所示。2.2系统适应性考察在“2.1色谱条件”下，各色谱柱刺五加叶中绿原酸和金丝桃苷的理论塔板数分别为18 317 0、1348 6 8、1548 7 9,绿原酸与相邻峰的分离度分别为13.2 6 3、14.459、15.2 9 7,金丝桃苷与相邻峰的分离度分别为1.50 1、1.6 2 3、1.6 0 9,且色谱图峰形对称。2.3对照品溶液的制备分别精密称取绿原酸和金丝桃苷对照品适量，加甲醇制成绿原酸和金丝桃苷的浓度分别约为0.4mg/mL和0.0 8 mg/mL的混合对照溶液，即得。表1梯度程序时间/minA/%B/%09553955104080204050109050609552.4供试品溶液的制备取刺五加叶粗粉（过10 0 目）1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人7 0%乙醇2 0 mL，称重，超声处理30 min，放冷，再称重，用7 5%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。2.5线性关系考察精密吸取对照品溶液1L、2 L、5L、8 L、10 L、15L，分别注人液相色谱仪，记录峰面积。以对照品溶液浓度（g）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，绿原酸标准曲线回归方程为：Y=928163X+76471,r=0.9990，进样量范围为0.39 5.9 g；金丝桃苷标准曲线回归方程为：Y=2131967X1022，r=0.9 9 9 9,进样量范围为0.0 8 1.2 g。2.6稳定性试验取刺五加叶（长白山十五道沟村)粗粉1.0 g，精密称定，按照“2.4 项下方法制备供试品溶液，室温下放置，分别于0、2、4、8、12、16、2 0、2 4h 进样5L，依法测定绿原酸和金丝桃苷的峰面积值。结果绿原酸和金丝桃苷峰面积2 4小时内RSD分别为0.14%和0.2 2%，表明样品在制备供试品溶液后2 4h内稳定。2.7重复性试验取刺五加叶（长白山十五道沟村)粗粉1.0 g，精密称取6份，每份约1.0 g，照“2.4 项下方法制备供试品溶液，依法进行测定。结果绿原酸含量为9.52 mg/g,RSD=1.05%；金丝桃苷含量为1.47 mg/g,RSD=1.1%，表明本测定方法的重复性良好。2.8回收率试验称取刺五加叶（长白山十五道沟村）粗粉0.5g，精密称取6份，置具塞锥形瓶中，精密加人高中低浓度的各组分标准溶88（编辑：侯睿琪）BRAND&STANDARDIZATION品牌与标准化2023年第6 期液，照“2.4 项下方法制备供试品溶液，依法进行测定，计算。结果绿原酸和金丝桃苷的平均加样回收率分别为10 2.3%和98.4%,RSD分别为0.5%和1.1%。2.9实际样品测定分别精密称取5个产地两批次的刺五加叶粗粉各约1.0g，照“2.4 项下方法制备供试品溶液，具体数据见表2。不同产地样品绿原酸含量范围为1.0 1mg/g10.71mg/g;金丝桃苷含量范围为0.2 5mg/g1.49mg/g。吉林省长白山区域基地所产样品含绿原酸及金丝桃苷均较高。表2各批次刺五加叶样品绿原酸及金丝桃苷含量结果地区产地采集日期绿原酸/(mg/g)金丝桃苷/(mg/g)长白山十五道沟2023.5.39.541.47长白山十五道沟2023.6.89.611.49靖宇县泉阳镇2023.5.1210.631.49吉林省靖宇县泉阳镇2023.6.1310.711.48辉南县小城子村2023.4.309.691.48辉南县小城子村2023.5.269.471.46松江河老松江村2023.5.309.781.25松江河老松江村2023.6.2810.091.27黑龙江省尚志市亚布力镇2023.5.251.150.29尚志市亚布力镇2023.6.271.010.253讨论3.1波长本文采用二极管阵列检测器，其中紫外光谱图显示绿原酸在2 18 nm和32 7 nm波长处是最大吸收波长，金丝桃苷在255nm和354nm波长处是最大吸收波长。考虑绿原酸在354nm波长处响应值仍较高，故选择354nm波长处为测定波长。3.2供试品制备方法本文采用了7 5%乙醇、9 5%乙醇及7 5%甲醇和10 0%甲醇作为供试品提取溶剂，分别超声处理，结果以7 5%乙醇超声时绿原酸和金丝桃苷的样品含量最高，分别为9.54mg/g和1.47mg/g。同时采用浸泡2 4小时后超声30 分钟、超声30 分钟、超声60分钟三种处理方式，结果绿原酸和金丝桃苷的样品含量基本无差距，确定处理方式为操作简便的超声处理30 分钟。品【参考文献】1 引张顺捷，李晓琳.刺五加资源的开发利用.中国食品药品监管，2 0 2 1（5）：10 8-111.2】徐春玲.刺五加叶活性成分研究及其产品开发 D.长春：吉林农业大学，2 0 12.3王晶瑶.刺五加和短梗五加叶及果镇静催眠活性对比研究 D.长春：吉林农业大学，2 0 2 0.4】关欣，秦雯，谢百波，等.一测多评法测定刺五加叶中5个酚类成分含量的研究 J.北京城市学院学报，2 0 2 1(1)：69-73.【作者简介】田国贺，女，19 8 2 年出生，副主任药师，研究方向为药品检验与研究。通讯作者：逢焕欢，女，19 7 7 年出生，副主任药师，研究方向为药品检验与研究，邮箱：148 0 32 50 14 。