花生黑腐病菌分子检测技术和杀菌剂筛选课件.ppt

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周日,2,County,Location,Lat,Long,USA,Terry,102.19,33.18,Terrell,-96.28,32.7,Castle Hayne,-77.89,34.39,Martin,-77.93,34.21,Bladen,-78.56,34.68,Florence,-79.71,34.18,Charleston,-80.01,32.77,Midville,-82.23,32.81,Tifton,83.51,31.45,Raleigh,-78.64,35.74,Clayton,-78.46,35.65,Bertie,-76.96,36.02,Japan,Tsukuba,140.06,36.02,Chiba,140.1,35.59,Iwate,141.09,39.63,Ibaraki,140.06,36.19,Gumma,138.64,36.38,Saitama,139.25,35.94,Nagano,137.98,36.13,Kyoto,135.74,34.94,Tokushima,134.54,34.04,Australia,Kingaroy,151.8,-26.62,Tolga,145.48,-17.23,Vietnam,mid-lands,105.77,20.81,表,1,花生黑腐病菌世界分布范围,注：花生黑腐病菌主要分布于美国、日本、韩国、印度尼西亚、斯里兰卡、巴西、澳大利亚、喀麦隆和洪都拉斯等,20,多个国家和地区。该表仅显示文献明确记载的地区。,2025/10/5 周日,3,图,1,花生黑腐病菌主要分布国家,2025/10/5 周日,4,项目简介,本项目以我国新发现的花生黑腐病为研究对象，融合植物病理学、分子生物学和杀菌剂学的研究技术，开展花生黑腐病,检测技术,与,防治方法,的研究。设计检测花生黑腐病菌的,特异引物,，建立常规,PCR,技术，快速准确地检测潜在花生黑腐病菌的分子检测方法。测量,20,多种杀菌剂对花生黑腐病菌的抑菌作用，得出不同杀菌剂的,EC50,。,筛选,出对花生黑腐病菌有较好抑制作用的,杀菌剂,，并试验性进行温室药效试验。建立嘧菌酯对花生黑腐病菌,敏感性基线,等均属国内首创。因此，本研究将为中国华南地区花生黑腐病防治等提供理论与实践基础。可以设想，如能取得预期效果，经过良好设计的基础研究后，可进一步了解花生黑腐病入侵为害等核心科学问题，及时遏制花生黑腐病的蔓延，保护我国花生和大豆产业。,项目研究目标,2025/10/5 周日,5,1965,花生黑腐病由病原真菌,Cylindrocladium parasiticum(Bell Crous et al.,1993),引起，属于半知菌亚门的柱枝双孢霉属，病原菌最早由,Bell,和,Sobers,于,1965,年在美国,Georgia,州发现和报道，该病菌侵染花生的茎基部、荚果和根系，受侵染部位常常变黑腐烂，最终导致全株萎焉和死亡,12,。该病害短时间内在美国迅速蔓延扩展和流行，造成的产量损失超过,50%,3,。,现状分析,2025/10/5 周日,6,1968,花生黑腐病菌的寄主十分广泛，可以侵染花生、大豆、红三叶、美丽鹧鸪豆、紫花苜蓿和猪屎豆等十几种豆科植物。,花生黑腐病菌在大豆上引起的病害通常称为大豆红冠腐病,（,Soybean red crown rot,）。,1968,年在日本千叶县首次发现该病，这是世界上最早的关于花生黑腐病菌为害大豆的报道,5,。该病害在全日本各地区广泛发生，且为害严重，成为日本大豆的重要病害,6,。,在中国江苏、云南和广东等地区曾报道发现大豆红冠腐病,8910,。花生黑腐病菌可侵染镰果灯心草，这种豆科杂草是危害美国东南部大豆产业的恶性杂草,11,。花生黑腐病菌还可侵染蓝莓、番木瓜、猕猴桃和花烛等非豆科植物,12131415,。,现状分析,2025/10/5 周日,7,2009,2009,年，潘汝谦等在广东省多个花生产区报道发现花生黑腐病，部分地区危害严重，根据花生黑腐病在世界主要分布现状，我国华南地区正是适宜花生黑腐病发生的地区，所以，应该警惕花生黑腐病的入侵,19,。,现状分析,2025/10/5 周日,8,项目研究,目标,利,用特异引物，建立常规,PCR,体系，快速准确地检测潜在花生黑腐病菌的分子检测方法。试验性开展多重,PCR,和实时,PCR,技术检测花生黑腐病菌。,测,量,30,多种杀菌剂对花生黑腐病菌的,EC50,。,建,立嘧菌酯对花生黑腐病菌敏感性基线。,在,核心期刊上发,表较高,水平论文,12,篇。,2025/10/5 周日,9,项目研究内容,设,计检测花生黑腐病菌的特异引物，建立常规,PCR,技术，快速准确地检测潜在花生,黑腐,病,菌的,分子检测方,法。,测,量,30,多种杀菌剂制剂和,10,种杀菌剂原药对花生黑腐病菌的抑菌作用，得出不同杀菌剂的,EC50,。筛选出对花生黑腐病菌有较好抑制作用的杀菌剂，并试验性进行温室药效试验,。,建,立嘧菌酯对花生黑腐病菌敏感性基线。,2025/10/5 周日,10,1.,供试的,40,个菌株，其中花生根腐病类,12,个，由华南农业大学杀菌剂与抗菌化合物研究室提供。其编号、种名、采集地点及寄主详见表,2-1,。,Code no.,Species,Origin,Host,1,Diplodia gossypina,Guangdong,Peanut,2,Rhizoctonia solani,Guangdong,Peanut,3,Sclerotium rolfsii,Jiangxi,Peanut,4,Aspergillus niger,Guangdong,Peanut,5,Pythium myriotylum,Guangdong,Peanut,6,Fusarium solani,Guangdong,Peanut,7,Fusarium oxysporum,Guangdong,Peanut,8,Rhizopus arrhizus,Guangdong,Peanut,9,Selerotinia miyabeana,Guangdong,Peanut,10,Sphaceloma arachidis,Guangdong,Peanut,11,Verticillium dahliae,Guangdong,Peanut,12,Macrophomina phaseolina,Guangdong,Peanut,13,Neocosmospora vasinfecta,Jiangxi,Peanut,14,Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Guangdong,Banana,15,Thielaviopsis paradoxa,Guangdong,Pineapple,16,Colletotrichum musae,Guangdong,Banana,17,Colletotrichum gloesporioides,Guangdong,Mango,18,Penicillium italicum,Guangdong,Orange,19,Penicillium digitatum,Guangdong,Orange,20,Fusarium oxyporum f.sp.niveum,Guangdong,Watermelon,21,Curvularia lunata,Guangdong,Corn,22,Peronophythora litchii,Guangdong,Lichi,23,Rhizoctonia solani,Guangdong,Rice,24,Pestalotiopsis mangiferae,Guangdong,Mango,25,Bipolaris maydis,Guangdong,Corn,表,2,供试菌株编号及采集地点,Note:,Neocosmospora vasinfecta,is a new plant pathogen we found in Guangdong and Jiangxi provice,including two kinds of varieties:,Neocosmospora vasinfecta,var.Africana,and,Neocosmospora vasinfecta,var.,vasinfecta,2025/10/5 周日,11,特异引物见下表。,2025/10/5 周日,12,2025/10/5 周日,13,2025/10/5 周日,14,2025/10/5 周日,15,2.,采用药皿抑菌法测定杀菌剂的,EC50,。测定,18,种杀菌剂对花生脚腐病菌的抑制作用。将花生黑腐病菌于,PDA,培养基上,25,预培养,7,天,用直径,6mm,的打孔器在靠近菌落边缘的同一圆周上打取菌饼,接种到含有不同药剂浓度的培养基平板上,每皿一片,置于,25,恒温箱内黑暗培养,7,天,用十字交叉法测定各处理的菌落生长直径,以清水为对照。每浓度处理重复,4,次。按照公式求出各个药剂浓度对菌丝生长抑制率,(%),。所得数据经,Finney,概率分析后用,DPS,统计软件求出毒力回归方程式及,EC50,。,菌丝生长抑制率,(%)=1-(,处理菌落直径,-,菌饼直径,)/(,对照菌落直径,-,菌饼直径,),100,2025/10/5 周日,16,原药,规格,类型,溶解度,溶解性,氰菌胺,95%,酰胺类,30.7mg/L,无,百菌清,96%,腈类杀菌剂,0.81mg/L,丙酮,20；二甲苯80；二甲基亚砜20g/L,咯菌腈,97%,吡咯类,1.8mg/L,丙酮,190；甲醇44；甲苯2.7；正辛醇20,嘧菌酯,97%,甲氧基丙烯酸酯类,6mg/L,溶于甲醇，甲苯，丙酮；易溶于乙酸乙酯和二氯甲烷,氟环唑,96%,三唑类,6.63mg/L,丙酮,14.4；二氯甲烷29.1mg/L,粉唑醇,95%,三唑类,130mg/L,丙酮,190；二氯甲烷150；甲醇69；二甲苯12g/L,福美双,94%,18mg/L,二氯甲烷,170；甲苯18；异丙醇0.7g/L,多菌灵,97%,苯并咪唑类,29mg/L（pH4）,丙酮,0.3；二甲基甲酰胺5；,嘧霉胺,96%,嘧啶胺类,0.121g/L,丙酮,389；乙酸乙酯617；,咪鲜胺,97%,34.4mg/L,丙酮,3500g/L；氯仿、乙醚、甲苯、二甲苯2500g/L,苯醚甲环唑,96%,三唑类,15mg/L,乙醇,330；丙酮610；甲苯490g/L；,丙环唑,95%,三唑类,100mg/L,与丙酮、乙醇、甲苯和正丁醇互溶,表,3,拟采用的杀菌剂原药名录,2025/10/5 周日,17,名称,制剂,规格,厂家,霉克定,可湿性粉剂,2亿个/克,山东嘉禾化工有限公司,噻菌铜,悬浮剂,20%,浙江龙湾化工有限公司,枯草芽孢杆菌,可湿性粉剂,1000亿芽孢/克,黑龙江强而生化技术开发有限公司,蜡质芽孢杆菌,可湿性粉剂,300亿个/克,香港帅克化学国际有限公司,儿茶素,可湿性粉剂,1%,黑龙江平山林业制药厂,咪唑喹啉铜,可湿性粉剂,50%,上海绿油油化工有限公司,吗孤乙酸铜,可湿性粉剂,20%,齐齐哈尔华丰化工有限公司,嘧菌酯,悬浮剂,25%,英国先正达作物保护公司,腈苯唑,悬浮剂,24%,英国陶氏益农公司,烯唑醇,可湿性粉剂,12%,安阳市国丰农药有限公司,苯醚甲环唑,水分散粒剂,10%,深证诺普信农化工有限公司,咪鲜胺锰盐,可湿性粉剂,50%,德国拜耳作物科学公司,代森锰锌,WP,80%,江苏新中兴化工有限公司,代森联,水分散粒剂,70%,德国巴斯夫欧洲公司,甲基硫菌灵,可湿性粉剂,70%,河北石家庄市伊诺生化有限公司,福美双,水分散粒剂,80%,新加坡立农,溴菌腈,可湿性粉剂,25%,江苏托球农化工有限公司,嘧霉胺,可湿性粉剂,25%,浙江禾本农药化学有限公司,腐雷利,可湿性粉剂,50%,英国汉特生物科技（北京）发展有限公司,丙森锌,可湿性粉剂,70%,德国拜耳作物科学公司,中生菌素,可湿性粉剂,3%,福州凯立生物制品有限公司,三唑酮,可湿性粉剂,15%,江苏剑牌农药化工有限公司,多菌灵,可湿性粉剂,80%,太仑市农药厂,噁霉灵,内吸性土壤杀菌剂,99%,延边西爱斯开化学农药厂,氟硅唑,乳油,40%,深证诺普信农化工有限公司,戊唑醇,悬浮剂,43%,拜耳作物科学（中国）有限公司,氢氧化铜,可杀得,46%,上海杜邦农化有限公司,异菌脲,悬浮剂,25%,深证诺普信农化工有限公司,丙环唑,乳油,25%,深证诺普信农化工有限公司,百菌清,悬浮剂,40%,深证诺普信农化工有限公司,乙唑醇,微乳剂,5%,广东省惠州市中讯化工有限公司,腈菌唑,乳油,12%,深证诺普信农化工有限公司,表,4,拟采用的杀菌剂制剂名录,2025/10/5 周日,18,3.,通过花生黑腐病菌对嘧菌酯的敏感性检测及抗药性风险的研究，有助于明确花生黑腐病菌是否对该杀菌剂产生抗药性及抗药性风险大小。供试花生黑腐病菌株来自华南农业大学植物病理系杀菌剂与抗菌化合物实验室。不同地理分布菌株,65,株。菌株编号及地理分布（略）。,2025/10/5 周日,19,拟解决问题,建立快速检测花生黑腐病菌的常规,PCR,技术。,筛选出对花生黑腐病防治效果好的杀菌剂，应用于生产实践。,2025/10/5 周日,20,技术路线,花生黑腐病分离鉴定,典型菌株检测,广东省花生病害样品采集,普通,PCR,菌体直接,PCR,花生种子,PCR,土壤样品,PCR,实时,PCR,引物浓度影响,退火温度影响,灵敏度检验,多重,PCR,退火温度影响,不同引物组合,灵敏度检验,杀菌剂筛选,敏感性基线,2025/10/5 周日,21,预期成果,建,立一种在花生繁殖材料等植物材料中，在花生种子中，设计检测花生黑腐病菌的特异引物，建立常规,PCR,技术，快速准确地检测潜在花生黑腐病菌的分子检测方法。,测,量,20,多种杀菌剂对花生黑腐病菌的抑菌作用，得出不同杀菌剂的,EC50,。筛选出对花生黑腐病菌有较好抑制作用的杀菌剂，并试验性进行温室药效试验。建立一种杀菌剂（拟定为嘧菌酯）对花生黑腐病菌敏感性基线。,在,核心期刊上发表高水平论文,12,篇。,2025/10/5 周日,22,项目特色与创新之处,花生黑腐病菌,Cylindrocladium parasiticum(Bell Crous et al.,1993),列为国家进境植物检疫性病原菌。国内对该病害的报道很少，我们以国家检疫性病原菌为材料，开展花生黑腐病检测技术及防治策略的研究，在国内为首次进行。现在检疫部门对花生黑腐病菌检测主要靠选择性培养基，灵敏度差，特异引物将推动快速检测花生黑腐病菌技术的发展。建立嘧菌酯对花生黑腐病菌敏感性基线也为首次进行。,2025/10/5 周日,23,参考文献,1 Bell D.K.,Sobers.E.K.1966.A peg,pod,and root necrosis of peanuts caused by a species of,Calonectria,J.,Phytopathology 56:1361-1364.,2 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