转基因克隆动物.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,休无休时，了无了时,人肯当下休，便当下了。若要寻个歇处，则婚嫁虽完，事亦不少。僧道虽好，心亦不了。前人云：“如今休去便休去。若觅了时无了时。”见之卓矣。,1,Call a spade,，,a spade,实事求是,A fall in pit a gain in wit,吃一堑长一智,The man who has made up his mind to win will never say“impossible”,一个决心取胜的人从来都不会说“不可能”,Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowed:a little bit more,成功的秘诀就是四个简单的字：多一点点（凡事比别人多一点点，多一点努力多一点实践多一点疯狂，多一点点就能创造奇迹）,2,你是一个富翁,如果早上醒来，你发现自己还能自由呼吸，你就比在这一周离开人世的,100,万人更有福气。,如果你从未经历过战争的危险、被囚禁的孤寂、受折磨的痛苦和忍饥挨饿的难受、你已经好过世界上,5,亿人。,如果你的冰箱里有食物，身上有足够的衣服，有屋栖身，你已经比世界上,70%,的人更富足。,如果你银行户头有存款，钱包里有现金，你已经身居世界上最富有的,80%,的人之列。,如果你的双亲仍然在世，并且没有分居或离婚，你已属于稀少的一群。,如果你能读到这段文字，那么，你更是拥有双份的福气，你比,20,亿不能阅读的人更幸福。,3,王维,九月九日忆山东兄弟,独在异乡为异客，每逢佳节倍思亲。,遥知兄弟登高处，遍插茱萸少一人。,采桑子 重阳,-,毛泽东,人生易老天难老，岁岁重阳，,今又重阳，战地黄花分外香。,一年一度秋风劲，不似春光，,胜似春光，寥廓江天万里霜。,过故人庄,孟浩然,故人具鸡黍，邀我至田家。绿树村边合，青山郭外斜。,开轩面场圃，把酒话桑麻。待到重阳日，还来就菊花。,4,（,immunodeficient animal),T,淋巴细胞缺陷 裸小鼠、裸大鼠,B,淋巴细胞缺陷 性连锁免疫缺陷,NK,细胞缺陷,Beige,小鼠,联合免疫缺陷,T,、,B,缺陷,SCID,TB,、,NK,联合缺陷鼠,获得性免疫缺陷,小鼠、猴、等,AIDS,模型,免疫缺陷动物,先天免疫缺陷,第七章 免疫缺陷动物,5,一）裸小鼠,(nude mice),BALB/c,裸基因位于,11,号染色体，,主要特征：,无毛（,Hairless,）、,裸体（,Naked）,和无胸腺（,Athymus）。,毛发发育异常，,不能让,T,细胞正常分化,，细胞免疫低下，,B,细胞功能正常,繁殖,：,雄鼠精子尾部呈盘卷状，无活动力，,由于纯合雌裸鼠受孕率低，会食仔因此繁殖：,纯合雄鼠（,nu/nu ),X,杂合雌鼠,(+/nu),-,正常鼠（繁殖）和裸鼠（实验用）,6,3,、裸鼠在生物医学研究中的应用,（,1,）组织移植（人类肿瘤移植）研究,结肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、肾癌、宫颈癌等移植成功，并可传代。,我国：人体结肠癌、直肠癌、食道癌、乳腺癌、宫颈癌、咽癌、骨巨噬细胞癌的移植均获得了成功。,8,（,2,）肿瘤药物治疗和肿瘤免疫研究,移植发囊，视网膜母细胞瘤等,人的,Burkitt,淋巴瘤的裸鼠移植后对环磷酰胺有较高的敏感性，也与临床结果相符。其它肿瘤如乳腺癌和结肠癌裸鼠移植，对前者阿霉素和苯丙氨酸氮芥（,7mg/kg）,均有一定的抑瘤效能，对后者甲基,-CCNO,和丝裂毒素也明显疗效。,有人用胸腺嘧啶核苷等,444,888mg/kg,给肿瘤裸鼠连续灌注,96,140,小时，发现它能明显抑制人体黑色素瘤及畸胎瘤的生长，并导致肿瘤消退而对宿主无明显毒性，这些新结果已引起了临床重视。,9,（,3,）免疫和遗传研究,先天性无胸腺裸鼠的遗传因素，免疫动物原缺陷指标以及剖检所见和组织学观察等特征，均与人类免疫缺陷性疾病中的原发性细胞免疫病相似。各品系裸鼠因遗传背景的不同，所表现的细胞免疫反应和实验室检查指标亦各不相同，这些裸鼠种群是研究人类各种免疫缺陷性疾病的发病机理和遗传规律的动物模型。,我国所应用的自发性免疫缺陷小鼠，主要应用的是,BALB/c,为遗传背景的裸鼠，个别实验室也应用了,NIH,、,ICR,等非近交系裸鼠,10,（,4,）病毒、细菌、寄生虫感染机制的研究,结果说明，乙脑病毒感染后所产生的免疫力，主要属于细胞免疫，如使,T,细胞缺陷的裸鼠体内产生与免疫功能正常小鼠同等水平的免疫力，必须加大,40,倍的免疫剂量，才能达到。也说明裸鼠体内还存在着残余的,T,淋巴细胞。由此推论，在现场人群中产生抗体水平较低者，其,T,细胞功能是否缺陷，应作为因素之一加以探讨。,11,（,5,）生物制品和药品的检定,生物制品（疫苗、菌苗）的安全性的免疫原性是制品必不可少的内容之一。,它涉及制品是否有潜在致癌性、感染因子以及它的毒力是否有返祖的可能性。特别是在应用动物组织培养疫苗或人类二倍体细胞株时，对检出这些细胞潜在的致癌性，某些制品引起的异常发应及其发生机理，对药物致癌性或抗癌药物的研究等诸方面，先天性胸腺机能缺陷的裸鼠是很好的动物模型和实验手段。,12,（,6,）微生物学上的研究,以往麻风杆菌只在背上有九条纹的犰狳（,Armadillo）,身上才能生长，而这种产于南美等地的动物难于寻找，也不易饲养和操作。,1975,年,Colston,等将麻风杆菌接种于裸鼠足掌，发现麻风杆菌可大量繁殖，引起瘤型麻风。,又如淋巴细胞性脉络膜脑膜炎（,LCM）,病毒经脑内接种于无本病毒隐性感染的正常小鼠，可引起脑膜炎，感染细胞被当作靶细胞而受到破坏，在脑、脊髓内发生了明显的细胞免疫反应，但在,T,细胞缺损的裸鼠所见却完全相反，未导致动物的死亡，仅出现持续病毒血症，体内不出现,LCM,抗体，也无任何免疫反应。,13,二）裸大鼠(nude rat),一、生物学特点,1953,年发现，裸大鼠,(nude rat),无胸腺，缺,T,细胞，,B,细胞功能正常（血清更多）,四肢有少量毛,14,三）性连锁免疫缺陷小鼠,(X-linked immuno deficiency mouse XID),B,细胞功能缺陷,。,位于,x,染色体上，,IgM,等抗体少，研究,Bruton,无丙种球蛋白缺乏症。将正常鼠骨髓移到,xid,鼠中，,B,细胞可得到恢复。,四）,Beige,小鼠,纯合小鼠被毛完整，,NK,细胞活性缺陷,，可导致溶酶体功能缺陷，对化脓菌敏感。,15,五）严重联合免疫缺陷小鼠（,severe-combined immuodeficient mice SCID,）,外观正常，,造成,T,细胞不能分化成功能淋巴细胞，无抗体反应,.,胸腺、脾、淋巴结重量不及正常的,30%,组织学上淋巴细胞显著缺乏，,T,、,B,细胞功能阴性，,对外来抗原无细胞免疫和抗体反应，但其巨噬细胞、红细胞、自然杀伤细胞等功能正常。,16,许多人类寄生虫不能感染其它小鼠，而,SCID,小鼠不但可被人类丝虫病所感染，而且所出现的病变也与人类相似，因此是研究人类寄生虫病的新动物模型,SCID,小鼠肿瘤移植存活率高达,36.9,，一般裸鼠为,16.8,少数可恢复免疫功能，称为渗漏现象,繁殖：纯合子兄妹交配,17,裸鼠在肿瘤模型中的应用：,一 组织块法：将标本在,1,小时内接种在腋下，背部皮下,3,6mm3,左右。,3-5,周后就可达到,1-3cm3,如 将人乳腺癌块接种于裸鼠右腋乳垫下,二 悬液移植法：组织块匀浆后，细胞液注射，浓度,1,10,7,/ml,左右，一般注射,0.2 ml,。缺点：不易定位，如在肾包膜下，会流走,三 培养细胞移植法 ：腋下移植更好,计算公式：瘤体积,V=0.5,肿瘤最长径,X,肿瘤最短径,。,45d,后，处死裸鼠，进行解剖，取肿瘤组织称重,瘤重抑制率,=(1,一实验组平均瘤重阴性对照组平均瘤重,)100,抑瘤率,r=(V,对照组一,V,实验组,),V,对照组,】100,。,18,检测方面,1、对人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用,2、免疫组化法检测Casepase-7和PTEN蛋白,19,20,二肿瘤的不同移植途径,1,）皮下移植,（,2,）腹腔注射：,0.2ml,细胞悬液注入腹腔,若注入皮下可形成实体瘤,（,3,）肾包膜下移植（人卵巢癌细胞系双侧移植）,（,4,）原位移植（,orthotopic),：如肝癌、肺癌移植到肝、肺中,乳腺癌细胞，用,1 ml,注射器将肿瘤细胞接种于裸小鼠左侧第二乳头的脂肪垫，接种量每只为,只,0.2ml,含有,2X10,6,个细胞；,1,个月后,(,肿瘤长、短径大于,1mm),开始治疗。,21,举例,结肠癌原位移植：,0.1ml,细胞悬液注入肠壁,肺癌原位移植：,）支气管移植：,0.03ml,细胞悬液注入支气管,）瘤块直接植入：,mm,3,瘤块（块左右）缝入肺,肿瘤保存：细胞悬液保存液氮保存年甚至年,22,23,三影响移植模型成功的因素,一 激素,如乳腺癌细胞在雌鼠可生长，卵巢切除后不生长，但注射雌激素可生长前列腺癌细胞 可在雄鼠中生长,二 鼠年龄有关,小鼠（周龄）更容易生长,三肿瘤自身特征,结肠癌和恶性黑色素瘤最高，乳腺癌低，分化低的也高,四渗漏现象,（少数鼠会恢复免疫功能），通过射线照射解决,24,五移植部位：,腋下好，肾包膜下高于皮下，脑内接种最高（,IgM,不能通过血脑屏障），皮下很少转移，腹腔易转移,六健康,高清洁的环境中的裸鼠更易成功,25,26,第八章 基因工程动物,一）转基因动物,通过基因工程对,DNA,进行体外操作，添加或删除一个特殊的,DNA,序列，然后导入早期胚胎细胞中，产生遗传结构得以修饰的动物，其改变的性状可以遗传给后代。,二）基因敲除动物,三）克隆动物,27,转基因动物和基因敲除,转基因动物(transgenic animal),基因敲除(gene knockout),购买：维通利华公司有部分转基因动物模型。,28,血友病B的治疗,29,基因工程产生的问题：,价格高?,只能生产简单的小分子担保，不能生产有着复杂结构的大分子蛋白?,环境污染？,数量有限？,30,第一节 转基因动物,一、概述,转基因动物（,transgenic animal,):,用人工方法将,外源,DNA,导入或整合到动物基因组内，并能稳定传代的动物。,1982,年,Brinster&Palmiter,大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵,31,supermice,32,各种转基因生物,33,34,35,36,37,38,二、基本原理,外源基因构成,顺式作用元件,+,结构基因,+,报告基因（融合基因）,报告基因常为 荧光素酶、,-,半乳糖苷酶和绿色荧光蛋白（,GFP),39,外源基因的引入,显微注射 注射入受精卵,结合克隆生产转基因动物,胚胎干细胞法,逆转录病毒感染法,精子载体法,发育 植入受体动物的子宫或输卵管,转基因动物中外源基因的检测,Southern,杂交、,Northern,杂交、,Western,印迹,40,三、基本方法,1.,显微注射法,优点,:,导入速度快、操作简单对,DNA,大小无限制,缺点,:,实验设备昂贵,简化流程,目的,DNA,制备,基因工程,准备假孕母鼠（养母）,准备供体母鼠,提供受精卵,显微注射入雄性原核,植入养母子宫、输卵管,外源基因整合及表达检测,通过互交、回交等育种手段获得纯合子,传代纯合子转基因鼠（,若外源基因的整合发生在细胞分裂后则只能得到嵌合体小鼠）,41,注射量仅一微微升,42,2,结合克隆生产转基因动物,43,克隆胚胎发育阶段,44,去核过程,注射过程,45,各种克隆动物,46,47,48,3.,胚胎干细胞法,ES,细胞,特点：,ES,具有全能性。,简化流程,获取,ES,细胞,稳定传代防止分化,转化,ES,细胞（引入新基因、诱导基因突变、基因组改造等）筛选后克隆,注射入囊胚期的胚胎中,植入养母子宫，筛选嵌合体子代,通过回交、互交等育种手段获得纯合子后代,稳定传代,49,50,51,4.,逆转录病毒感染法,主要适合于家禽类，其受精卵在出生时已发展至桑椹胚期,5.,精子载体法,将外源,DNA,吸附到精子中,洗涤精子,电穿孔法、脂质体转染法等,优点：便宜,机制未明：怀疑与,CD4,蛋白有关,52,53,注射过程,去核过程,54,四、转基因动物的可能应用,基因产品的制备,生物制药,使用乳球蛋白的启动子可以使外源基因在乳腺中特异表达,异种器官移植,转基因猪（实验阶段）,建立人类疾病动物模型等,高脂血症（,HLP,）、,AS,、高血压、低血压等心血管疾病的转基因动物模型已成功建立,培育新品种,加速生长,抵抗疾病,扩大生存范围,耐寒能力等,55,56,2009，美国明尼苏达州立大学干细胞科学家桃瑞丝泰勒，最新培育的人造心脏能够像正常老鼠体内的心脏一样跳动，但这种心脏看上去更加与众不同：它覆盖着一层老鼠心脏去细胞组织的“脚手架”，而且新培育的老鼠心脏组织是基于另一只老鼠的干细胞培育而成。,57,58,59,2015-九月，屈雷采用CRISPR技术在 科学报告(Scientific Reports，Nature集团出版)发表了他们的研究成果。早期的山羊胚胎中敲除了两个抑制羊毛和肌肉发育的基因，从而得到了10只肌肉更粗壮、羊毛更长的小山羊，到目前为止，这些定制山羊并没有出现任何异常。,60,2015-,四月，一支中国科研团队在,Protein&Cell,期刊在线发表了论文，他们尝试利用,CRISPR,技术,改造无法存活的人类胚胎,(,这些胚胎是经许可后从一家生育诊所获得的,),，由此而饱受批评和担忧。他们的研究目的是删除,-,地中海贫血相关基因且不造成其他突变，但这一实验在,85,个胚胎上进行尝试后以失败而告终。,61,三、转基因植物安全性探讨,缘起,1998,年，苏格兰免疫学家普兹太声称转基因土豆对老鼠有毒，能破坏其免疫系统（实际上是肠道损害），欧洲舆论因之大哗，导致欧盟限制转基因食物进口。,1999,年,5,月，美国康奈尔大学洛希（,John Losey,）实验室向英国,自然,杂志报告说，他们用沾有抗虫害转基因玉米花粉的草叶喂养大花蝶的幼虫，导致这些毛毛虫死亡,62,热门问题,对人体的毒副作用及引发过敏,外源基因在自然界不受控制的随机转移导致基因污染,抗生素抗性基因 （常用于筛选）,抗除草剂基因,抗虫害基因导致超级害虫以及对生态环境的危害,我国抗虫棉已占棉花种植面积的,35,侵犯宗教信仰,把猪的基因转移到牛中等,63,世界上没有绝对的安全,正确的提问,有没有合理的理由和确凿的证据表明市场上的转基因食品要比相应的“天然”食品更有害健康？,普兹太的实验动物数量太少、缺乏对照、膳食不合理、最后土豆是生的,花粉实验中，花粉浓度远远高于自然界中的情况，而且毛毛虫只有被花粉污染的草叶可吃。,对策,过敏,避开易引起过敏的物种基因（牛奶、干果、蛋类、海产品、小麦、豆类）,基因污染,植物基因在消化道中转移给微生物，仅在结肠全切的情况中偶见。,2001,年,2,月,自然,杂志发表了一项在英国进行的长达十年的研究结果，发现转基因土豆、甜菜、油菜和玉米并没有将基因污染给周围的野草。,64,65,第三节 基因敲除,原理：通过基因同源重组的过程定向地从及基因组上移除特定基因的过程。,DNA,定点同源重组,在同源依赖的重组酶的作用下，配对的同源双链,DNA,分子可以彼此交换,DNA,片断的现象。,分类,基因敲除,常用于个体水平上的基因功能研究,基因敲入,可用于基因治疗,66,67,68,日本科学家最近通过改变老鼠的基因，培育出了一只不怕猫的老鼠,69,一、条件,ES,细胞的制备和培养,打靶载体：,Neo,r,（抗新霉素）阳性筛选标志,位于同源区内，表征重组成功的筛选标志,新霉素（,G418,）,氨基甙类抗生素，具耳毒性,HSV-tk,（具自杀性质）阴性筛选标志,来源于单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶,位于同源区外，表征重组区域精确的筛选标志,GCV,自杀性底物,70,二、基因敲除简化流程,构建打靶载体,制备待敲除基因两端同源片断,目的基因链接到质粒中并切除其中央大部分区域,将,neo,基因链接到同源片断中间,导入,ES,细胞并筛选,注射入胚泡并植入假孕小鼠子宫,嵌合体小鼠杂交育种获得纯系,71,72,73,74,75,普希金,假如生活欺骗了你,不要悲伤,不要心急!忧郁的日子里需要镇静:相信吧！快乐的日子将会来临。心永远向往着未来；现在却常是忧郁：一切都是瞬息，一切都会将过去；而那过去了的，就会成为亲切的怀念。,76,你知道我在等你吗,莫名我就喜欢你深深地爱上你没有理由没有原因莫名我就喜欢你深深地爱上你从见到你的那一天起你知道我在等你吗你如果真的在乎我又怎会让无尽的夜陪我度过你知道我在等你吗你如果真的在乎我又怎会让握花的手在风中颤抖莫名我就喜欢你深深地爱上你在黑夜里倾听你的声音,77,大中国,我们都有一个家，名字叫中国，,兄弟姐妹都很多，景色也不错，家里盘着两条龙是长江与黄河，还有珠穆朗玛峰儿是最高山坡我们都有一个家，名字叫中国,兄弟姐妹都很多，景色也不错，,看那一条长城万里在云中穿梭看那青藏高原比那天空还辽阔，,我们的大中国呀好大的一个家，经过那个多少那个风吹和雨打我们的大中国呀好大的一个家永远那个 永远那个 我要伴随她中国祝福你，你永远在我心里中国祝福你，不用千言和万语,78,国际歌,起来,饥寒交迫的奴隶起来,全世界受苦的人,!,满腔的热血已经沸腾要为真理而斗争,!,旧世界打个落花流水奴隶们起来,起来,!,不要说我们一事所有我们要做天下的主人,!,这是最后的斗争团结起来,到明天，英特那雄纳尔就一定要实现这是最后的斗争，团结起来,到明天英特那雄纳尔就一定要实现，从来就没有什么救世主也不靠神仙皇帝，要创造人类的幸福，全靠我们自己我们要夺回劳动果实，让思想冲破牢笼,79,快把那炉火烧的通红，趁热打铁才能成功,!,这是最后的斗争，团结起来,到明天英特那雄纳尔就一定要实现，这是最后的斗争，团结起来,到明天英特那雄纳尔就一定要实现最可恨那些毒蛇猛兽，吃尽了我们的血肉一旦把它们消灭干净，鲜红的太阳照遍全球这是最后的斗争，团结起来,到明天英特那雄纳尔就一定要实现，这是最后的斗争团结起来,到明天，英特那雄纳尔就一定要实现英特那雄纳尔就一定要实现,80,歌唱祖国,五星红旗迎风飘扬,胜利歌声多么响亮,;,歌唱我们亲爱的祖国,从今走向繁荣富强,.,歌唱我们亲爱的祖国,从今走向繁荣富强,.,越过高山,越过平原,跨过奔腾的黄河长江,;,宽广美丽的土地,是我们亲爱的家乡,英雄的人民站起来了,!,我们团结友爱坚强如钢,.,五星红旗迎风飘扬,胜利歌声多么响亮,;,歌唱我们亲爱的祖国,从今走向繁荣富强,.,歌唱我们亲爱的祖国,从今走向繁荣富强,81,我们勤劳,我们勇敢,独立自由是我们的理想,;,我们战胜了多少苦难,才得到今天的解放,!,我们爱和平,我们爱家乡,谁敢侵犯我们就叫他死亡,!,五星红旗迎风飘扬,胜利歌声多么响亮,歌唱我们亲爱的祖国,从今走向繁荣富强,.,歌唱我们亲爱的祖国,从今走向繁荣富强,.,东方太阳,正在升起,人民共和国正在成长,;,我们领袖毛泽东,指引着前进的方向,.,我们的生活天天向上,我们的前途万丈光芒,.,82,五星红旗迎风飘扬,胜利歌声多么响亮;歌唱我们亲爱的祖国,从今走向繁荣富强.歌唱我们亲爱的祖国,从今走向繁荣富强.,83,84,85,