选修三专题一1.2基因工程的基本操作程序.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1,提取目的基因,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测和鉴定,基因工程操作的基本程序,基因的结构（补充知识）,非编码区,非编码区,编码区,与,RNA,聚合酶结合位点,启动子,终止子,RNA,聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。,转录开始后，,RNA,聚合酶沿,DNA,分子移动，并以,DNA,分子的一条链为模板合成,RNA,。,转录完毕后，,RNA,链释放出来，紧接着,RNA,聚合酶也从,DNA,模板链上脱落下来。,1,、编码区：能转录相应的信使,RNA,，能,编码蛋白质的序列,。,2,、非编码区：,调控遗传信息表达,的核苷酸序列,(,启动子、终止子），不编码蛋白质。,一、原核细胞的基因结构,二、真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,内含子,外显子,启动子,终止子,基因的结构（补充知识）,与,RNA,聚合酶结合位点,1,、编码区,2,、非编码区：,调控遗传信息表达,的核苷酸序列,(,启动子、终止子），不编码蛋白质。,外显子：能,编码蛋白质的序列,内含子：不能编码蛋白质的序列,限制酶,基因组,DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,1),基因组文库,(Genomic library),是指将某种生物体的,全部基因组,DNA,用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的,DNA,片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存,某种生物的全部基因,。,（一）从基因文库中直接获取,1.,基因文库,（一）从基因文库中直接获取,1.,基因文库,是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的,mRNA,经体外反转录后形成的互补,DNA,片段,，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的,cDNA,文库，只包含一种生物的,一部分,基因。,2)cDNA,文库,(cDNA library,),基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA,cDNA,文库与基因组文库的区别,文库类型,cDNA,文库,基因组文库,文库大小,小,大,基因中启动子（具有启动作用的,DNA,片段）,无,有,基因中内含子（位于编码蛋白质序列内的非编码,DNA,片段）,无,有,基因多少,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,物种间的基因交流,可以,部分基因可以,8,2.,基因文库的构建方法,：,直接分离法,供体细胞中的,DNA,许多,DNA,片段,运载体,限制酶,受体细胞,产生特定性状,导入,外源,DNA,扩增,目的基因,分离,(,鸟枪法,),（一）从基因文库中直接获取,多用于原核生物,逆转录法,目的基因的信使,RNA,目的基因,化学合成法,肽链氨基酸序列,信使,RNA,序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,逆转录,2.,基因文库的构建方法,（一）从基因文库中直接获取,人工合成法（,真核生物,）,推测,推测,单链,DNA,合成,11,（,二,）,利用,PCR,技术扩增目的基因,PCR,多聚酶链式反应,1988,年 穆里斯等人,在生物体外,复制特定,DNA,片断,的核酸合成技术，由此可,获得大量目的基因,。,12,PCR,技术原理,在了解,DNA,一级结构基础上设计引物，,DNA,多聚酶可识别并结合引物，以单链,DNA,为模板,dNTP,为底物，合成其互补链，通过反复变性，反复合成互补链的过程，达到,DNA,扩增的目的。,（二）利用,PCR,扩增目的基因,1,、过程,高温变性（,解旋为单链,）,低温退火（,引物与单链互补结合,）,适温延伸,（,在,Taq,酶的作用下合成,与模板互补的,DNA,双链,）,重复循环,PCR,循环,-,变性,PCR,循环,-,变性,PCR,循环,-,变性,17,PCR,循环,退火,18,PCR,循环,延伸,19,PCR,循环,延伸,20,PCR,循环,延伸,21,PCR,循环,延伸,22,1,、过程,（二）利用,PCR,扩增目的基因,（二）利用,PCR,扩增目的基因,2,、条件,已知基因的核苷酸序列、,四种,dNTP,、,引物,Taq,DNA,聚合酶,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,4,、结果,耐高温,3,、方式：,以,指数,方式扩增，即,_,（,n,为扩增循环的次数）,2,n,适宜的温度和,PH,值,25,作业：,必修二 课时作业（十六）,P,99,26,请你描述,1、,鸟枪法,构建基因文库的过程,2、,化学合成法,获得目的基因的过程,3、,逆转录法,获得目的基因的过程,4、,PCR,技术,过程,27,二、基因表达载体的构建,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。,基因表达载体,目的基因,启动子,终止子,标记基因,复制原点,28,目的基因启动子终止子标记基因,启动子,基因（目的）的首端，有特殊结构的,DNA,片断，,RNA,聚合酶识别和结合的部位,启动子决定了双链的,模板链,终止子,基因（目的）的尾端，转录终止信号,标记基因,为了鉴别受体细胞中是否含目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来,29,由,RNA,聚合酶所催化的转录,RNA,聚合酶,识别,启动子,RNA,聚合酶与启动子,结合,RNA,合成开始,RNA,转录,到终止子,RNA,聚合酶从模板链上,脱落,2006/5/16,30,31,三、将目的基因导入受体细胞,转化,目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程,方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,32,将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法,基因枪法（单子叶植物）,花粉管通道法,33,农杆菌的特点,双子叶植物和裸子植物受伤时，伤口分泌,酚类,吸引农杆菌,农杆菌移向植物细胞伤口处,农杆菌的,Ti,质粒上的,T-DNA,整合到植物细胞染色体的,DNA,上,2006/5/16,34,农杆菌转化法,转入,农杆菌,35,双子叶植物和裸子植物受伤时，伤口分泌酚类吸引农杆菌,带有目的基因的农杆菌,Ti,质粒转移至受体细胞,目的基因得以稳定维持和表达,目的基因插入到植物细胞染色体的,DNA,上,36,基因枪法（微弹轰击法）,利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体,DNA,打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,单子叶植物，成本高,37,花粉管通道法,在植物授粉后，花粉形成的花粉管还没愈合前，剪去柱头，滴加,DNA,（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,转基因抗虫棉,简便经济,38,将目的基因导入动物细胞,-,显微注射法,显微注射法：将基因表达载体提纯，用显微仪注,射到受精卵中,39,将目的基因导入动物细胞,-,显微注射法,将含有目的基因的表达载体提纯，,DNA 13g,mL,从雌性动物取出卵（体内或体外受精）,显微注射,含目的基因的受精卵，移植到雌性动物的输卵管或子宫内，使其发育,40,将目的基因导入微生物细胞,原核生物（大肠杆菌）,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少,41,将目的基因导入微生物细胞,用,Ca,2,处理细菌,感受态细胞：增大细胞壁的通透性，吸收周围环境中,DNA,分子,重组表达载体,DNA,溶于缓冲液与感受态细胞混合,在一定温度下促进感受态细胞吸收,DNA,分子,42,本堂课作业：,下发资料,1.11.2,核心考点、双基考题部分,国庆作业：,下发资料：高考题,43,四、目的基因的检测与鉴定,检测转基因生物染色体的,DNA,上是否插入了目的基因,DNA,分子杂交技术,检测目的基因是否转录出了,mRNA,分子杂交技术,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗原抗体杂交,分子水平的检测,44,检测转基因生物染色体的,DNA,上是否插入了目的基因,DNA,分子杂交技术,探针,含有目的基因的,DNA,片段用放射性同位素作标记,转基因生物的基因组,DNA,待测,若出现杂交带，表明目的基因已插入染色体的,DNA,中,45,2.,检测目的基因是否转录出了,mRNA,分子杂交技术,探针,含有目的基因的,DNA,片段用放射性同位素作标记,从转基因生物中提取,mRNA,待测,若出现杂交带，表明目的基因已转录出,mRNA,46,3.,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗原,-,抗体杂交,若出现杂交带，表明目的基因已形成蛋白质产品,47,4.,个体生物学水平的鉴定,抗虫或抗病的接种实验，以确定是否具有抗性以及抗性的程度,有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能活性是否与天然产品相同,2006/5/16,48,DNA,探针,将双链,DNA,解开,用同位素、荧光分子或化学发光剂等对,DNA,单链进行标记,抽取病人的组织或体液，将,DNA,分离出来,使,DNA,解旋,查出疾病,将,DNA,探针引入到化验样品中,分析遗留在样品中的,DNA,探针,49,利用基因的特性破案,50,生物材料,DNA,mRNA,限制酶切割,一定大小范围,DNA,基因组文库,PCR,反转录,cDNA,cDNA,文库,获取目的基因,人工合成,51,P15,1.,作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：,生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；,通过,cDNA,文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；,目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；,为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；,有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,52,P15,思考与探究,2,提示：农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因工程中以根瘤农杆菌的,Ti,质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中。据不完全统计，约有,93,属,643,种双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。裸子植物对该菌也敏感。当这些植物被该菌侵染后会诱发肿瘤。近年来，也有报道该菌对单子叶植物也有侵染能力。,根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来还发现一些中性糖，如,53,P15,思考与探究,2,L-,阿拉伯糖、,D-,木糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中,Ti,质粒上,Vir,区（毒性区）基因的诱导物，使,Vir,区基因活化，导致,T-DNA,的加工和转移，从而侵染植物细胞。,需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力有差别，在基因工程中需要加以选择使用。利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。,如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的,Vir,区（诱导）的基因，使,T-DNA,转移并插入到染色体,DNA,上。,54,P15,思考与探究,3.,利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,提示：有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。,55,P15,思考与探究,4,基本操作如下：,（,1,）从小鼠中克隆出,-,珠蛋白基因的编码序列（,cDNA,）。,（,2,）将,cDNA,前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。,（,3,）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明,-,珠蛋白基因已进入其中。,（,4,）培养进入了,-,珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取,-,珠蛋白。,56,P8,求异思维,你能推测出由,mRNA,反转录形成,cDNA,的过程大致分为哪些步骤吗？,提示：,1970,年，特明（,H.M.Temin,）和巴尔的摩（,D.Baltimore,）证实了,RNA,病毒中含有一种能将,RNA,转录成,DNA,的酶，这种酶被称为依赖,RNA,的,DNA,聚合酶，由于与中心法则中的从,DNA,到,RNA,的转录是反向的，所以称为反转录酶。,反转录酶既可以利用,DNA,又可以利用,RNA,作为模板合成与之互补的,DNA,链。像其他,DNA,聚合酶一样，反转录酶也以,53,方向合成,DNA,。,57,58,P8,求异思维,由,mRNA,反转录形成,cDNA,的过程,cDNA,合成过程是：第一步，反转录酶以,RNA,为模板合成一条与,RNA,互补的,DNA,单链，形成,RNA-DNA,杂交分子。第二步，核酸酶,H,使,RNA-DNA,杂交分子中的,RNA,链降解，使之变成单链的,DNA,。第三步，以单链,DNA,为模板，在,DNA,聚合酶的作用下合成另一条互补的,DNA,链，形成双链,DNA,分子。,59,P9,寻根问底,1.,为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？,提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过,PCR,方式从含有该基因的生物的,DNA,中，直接获得，也可以通过反转录，用,PCR,方式从,mRNA,中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。,60,P11,寻根问底,2.,将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？,提示：有人采用总,DNA,注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总,DNA,提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。,