选修3专题1之1.2基因工程的基本操作程序wg.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程的基本操作程序,目的,基因,的获取,基因表达运载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测和与鉴定,程序步骤,补：原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,与,RNA,聚合酶结合位点,启动子,RNA,聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。,转录开始后，,RNA,聚合酶沿,DNA,分子移动，并以,DNA,分子的一条链为模板合成,RNA,。,转录完毕后，,RNA,链释放出来，紧接着,RNA,聚合酶也从,DNA,模板链上脱落下来。,终止子,补：真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,与,RNA,聚合酶,结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,内含子：,外显子：,终止子,目的基因的获取,一.目的基因的获取,目的基因,编码蛋白质的结构基因（主要）,一些具有调控作用的因子,获取的方法基因库提取,从基因文库中获取,2.获取的方法,部分基因文库,（,cDNA,文库）,基因组文库,（一种生物的全部基因）,（,获取依据,:,目的基因的信息,）,人工合成,DNA,合成仪,人工合成目的基因,mRNA,杂交双链,单链,DNA,双链,DNA,逆转录酶,核酸酶,H,DNA,聚合酶,AA,序列,mRNA,序列,DNA,序列 目的基因,直接合成法,反转录法,PCR,技术 在生物,体外复制特定,DNA,片段,的核酸合成技术,利用,PCR,技术扩增,原理,前提,结果,过程,DNA,复制,一段已知目的基因的核苷酸序列,目的基因指数式增加,PCR,扩增仪,变性,退火,(,复性）,延伸,思考,:PCR,反应体系组成,?,模板,引物,DNA,聚合酶,dNTP,PCR,反应原理图,PCR,反,应,原,理,变性,退火,(,复性）,延伸,PCR,扩增过程 练习,DNA,变性,(90-95),：双链,DNA,模板在热作用下，,断裂，形成,。,复性,(,55-60),：系统温度降低，引物与,DNA,模板结合，形成局部,。,延伸,(70-75),：在,Taq,酶的作用下，从引物的,5,端,3,端延伸，合成与模板链互补的,_,。,氢键,单链,DNA,双链,DNA,DNA,链,DNA,复制与,PCR,的条件区别,条件,DNA,复制,PCR,扩增,模板,原料,酶,DNA,目的基因,四种脱氧核苷酸,解旋酶,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,能量,引物,需要,需要,需要,需要,1,、下列有关基因工程操作的正确顺序是,目的基因的检测和表达,目的基因与运载体结合,将目的基因导入受体细胞,提取目的基因,A,B,C,D,2,、从一个,DNA,分子用限制酶切割获得一个目的基因有几个磷酸二酯键被水解？,A,1 B,2 C,3 D,4,基因表达载体的构建,二.基因表达运载体的构建,（核心）,目的,使目的基因在受体细胞中,稳定,存在、,遗传,、能,表达,和,发挥,作用,用,_,切割目的基因，使其产生,。,用一定的,切割质粒，使其出现一个切口，产生,_,。,(,基因工程的核心,),将切下的目的基因片段插入质粒的,_,处，再加入适量,_,，形成了一个重组,DNA,分子,(,重组质粒,),。,限制酶,黏性末端,同种限制酶,同种,黏性末端,切口,DNA,连接酶,基因表达载体的构建,2.基因表达载体的组成,目的基因,启动子,终止子,标记基因,载体的组成,复制原点,注意：,1,、终止子和终止密码的区别？,2,、目的基因可以与质粒整合的原因是什么？,基因化学组成和结构是相同的,终止密码在,mRNA,上,人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因的主要作用是（）,A,提高受体细胞在自然环境中的耐药,B,有利于对目的基因是否导入进行检测,C,增加质粒分子的分子量,D,便于与外源基因连接,常用的受体细胞：,动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。,将目的基因导入受体细胞的原理：,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,转化,目的基因进入,_,内，并且在受体细胞内维持,_,和,_,的过程。,受体细胞,稳定,表达,三.将目的基因导入受体细胞,导入植物细胞,（,1,）农杆菌的特点：,（,2,）过程：,(P12,图,),思考,:,单子叶植物不易被感染原因,?,（,P15 2）,农杆菌转化法,酚类物质在双子叶植物细胞壁中合成，不存在于单子叶植物,具有趋化性,植物体受伤 伤口处的细胞分泌大量的,酚类物质,农杆菌,被吸引,移动,Ti,质粒上,T-DNA,转移,到受体细胞,整合,到受体细胞染色体的,DNA,上,方法：,Ca,2+,处理,细胞,细胞通透性增大（感受,态细胞）与载体混合 重组,DNA,进入,细胞,导入动物细胞、微生物细胞,2.导入动物细胞,3.导入微生物细胞,（常用大肠杆菌）,-Ca,2+,处理法,(,感受态细胞法,),显微注射技术,(P13,图,),方法,导入植物细胞,导入动物细胞,导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞吸收,DNA,分子,将目的基因导入受体细胞 小结,1,、个体水平鉴定：,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,四.目的基因的检测和与鉴定,（检查是否成功）,2,、分子水平检测,1,、个体水平鉴定：,检测转基因生物染色体的,DNA,上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了,mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,DNA,分子杂交,DNA,分子杂交,抗原,-,抗体杂交,四.目的基因的检测和与鉴定,（检查是否成功）,该方法是根据碱基互补配对原则，把,已知的双链,DNA,解开,，把单链的,DNA,小片段用同位素、荧光分子或化学发光剂等进行,标记,，之后,同被检测的,DNA,中的同源互补序列杂交,，从而检出所要查明的,DNA,或基因。,分子杂交技术,1.,检测转基因生物的,DNA,上是否插入了目的基因,提取受体生,物全部,DNA,适当限制,酶切割,DNA,片段,用同位素标记的,目的基因片段杂交,（表明目的基因已插入）,分子杂交技术,显出杂交带,2.,检测目的基因是否转录出了,mRNA,用同位素标记的,目的基因探针杂交,显出杂交带,（表明目的基因已转录出了,mRNA,）,注意：,检测,DNA,利用的是,DNA,与,DNA,杂交，检测,mRNA,利用的是,DNA,与,mRNA,杂交。,提取受体生物的,mRNA,检测目的基因是否翻译出蛋白质,抗原,抗体杂交,提取受体生物的蛋白质,与相应抗体杂交,显出杂交带,（表明目的基因已形成蛋白质产品）,不同生物间的基因移植成功，说明生物共有一套,_,遗传密码,