高二生物选修3DNA重组技术的基本工具.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,基因工程及其应用,这就要用到,定向改造生物,的新技术,基因工程,基因工程,：又叫做,基因拼接技术,或,DNA重组技术,。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，,定向,地改造生物的,遗传性状,。,原理,：,操作水平,：,结 果,：,一、基因工程,基因重组,DNA分子水平,定向,地改造生物的遗传性状，获得人,类所需要的品种。,为什么能把,一种生物,的基因“嫁接”到,另一种生物,上并成功表达？,1、大多数生物的遗传物质都是DNA，且主要为双螺旋结构，,即不同生物的DNA分子基本结构是相同的，都遵循碱基互补配对原则。,所以不同的生物DNA可以嫁接,2、地球上的所有生物共用一套遗传密码，,所以，一种生物的基因可以在另外一种生物体内得以表达,DNA重组技术的基本工具,准确切割DNA的工具（“分子手术刀”）,限制性内切酶,DNA片段的连接工具（“分子缝合针”）,DNA连接酶,基因转移工具（“分子运输车”）,基因进入受体细胞的载体,基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、拼接等操作，没有非常精细的工具是不行的。进行基因操作最少需要以下三种工具：,“分子手术刀”限制性核酸内切酶（简称限制酶）,（二）基因操作的工具,即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。,特 点：,存在原核生物,(,主要是微生物,),体,内。,这类酶存在于原核生物中有什么作用呢？,切割外源DNA，使之失效，达到保护自身的目的。,专一性,什么叫黏性末端？,（二）基因操作的工具,被限制酶切开的DNA两条,单链的切口,，带有几个,伸出的核苷酸,，他们之间正好,互补配对,，这样的切口叫,黏性末端,。,限制性内切酶,1.,特点：,特异性，即识别特定核苷酸序列，在特定的切点切割。,2.分布：,主要在微生物中。,3.结果：,产生黏性末端（碱基互补配对）、平末端。,4.举例：,大肠杆菌的一种限制酶（EcoR,),能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开形成黏性末端，Sma,能识别CCCGGG序列，并在 C 和G之间切割形成平末端,。,GAATTCCGTAGAATTCGGATT,尝试写出下列序列受EcoRI限制酶作用后的黏性末端,CTTCATGAATTCCCTAA,GAAGTACTTAAGGGATT,CTTAAGGCATCTTAAGCCTAA,CTTCATG AATTCCCTAA,GAAGTACTTAA GGGATT,练一练:,GGCATCTTAA,AATTCCGTAG,目的基因,被同一种限制酶切断的几个DNA是否具有相同的黏性末端？,思考:,要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？,要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。,是，会产生相同的黏性末端。,DNA被限制酶切断后有两个反向互补的“黏性末端”。被同一种限制酶切断的几个DNA具有相同的黏性末端，能够通过互补进行配对。,是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成重组的DNA分子了?,基因的针线：DNA连接酶,G,A A,T T,C,C,T T,A A,G,G,A A,T T,C,C,T T,A A,G,G,C,T T,A A,A A,T T,C,G,G,C,T T,A A,A A,T T,C,G,G,C,T T,A A,A A,T T,C,G,用同种限制酶切割,、基因的针线DNA连接酶,连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。,不同点,连接酶,的作用是：将,DNA片段间,互补配对的,两个黏性末端,连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。,DNA聚合酶和DNA连接酶有何相同和不同点？,聚合酶,：,以一条DNA为模板，将一个一个,核苷酸,连接起来,相同点：,都是通过形成,磷酸二酯键,连接起来,DNA连接酶按来源分两种，哪两种？,基因进入受体细胞的载体,要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去！能将外源基因送入细胞的工具就是,运载体,。,（一）作用：,将外源基因送入受体细胞。,运载体,质粒,、噬菌体和动植物病毒,1.假如目的基因导入受体细胞不能复制将怎样？,2.作为载体没有切割位点（即限制酶切点），将会怎样？,3.目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？,4.如果载体对受体细胞有害将会怎样？,（二）.种类：,（三）.,质粒的特点,作为运载体需要什么条件吗？,最常用的运载体质粒,分布：存在于许多,细菌,以及,酵母菌,等生物中。,最常用的质粒是,大肠杆菌的质粒,。,本质：细胞染色体(或拟核)外,能自主复制,的小型,环状DNA分子。,质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内成。,基因的运输工具质粒,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，将来可用含青霉素的培养基鉴别。,作为运载体必须具备哪些条件？,1.能够在宿主细胞中,复制并稳定地保存,。,2.具,多个限制酶切点,，以便与外源基因连接。,3.具有某些,标记基因,，便于进行,筛选,。,如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。,4.对受体细胞无害。,基因工程的基本操作程序主要包括,四个基本步骤：,1）目的基因的获取,2）基因表达载体的构建,3）将目的基因导入受体细胞,4）目的基因的检测与鉴定,步骤一：目的基因的获取,目的基因是人们所需要转移或改造的基因,获取目的基因是实施基因工程的第一步。,如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。,补：原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。,转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。,转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。,不能转录为信使RNA，不能,编码蛋白质。,：,能转录相应的信使RNA，能,编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,有调控遗传信息表达的核,苷酸序列，在该序列中，,最重要的是位于编码区上,游的RNA聚合酶结合位点。,启动子,补：真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,与RNA聚合酶,结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列,内含子：不能编码蛋白质的序列,：,有调控作用的核苷酸序列，,包括位于编码区上游的RNA,聚合酶结合位点。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,一、目的基因的获取,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,请举出三个以上的例子,2、获取目的基因的常用方法有哪些?,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）人工合成,请阅读P9第一和二两段,(一)从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,基因文库,基因组文库,部分基因文库,（如:cDNA文库）,1.基因文库,基因组文库与部分基因文库的关系,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?,目的基因的提取方法,直接分离基因,人工合成基因,反转录法,根据已知的氨基酸序列合成DNA,：,鸟枪法,鸟枪法：,供体细胞中的DNA,许多DNA片段,运载体,限制酶,与载体连接,载入,受体细胞,产生特定性状,导入,外源DNA扩增,目的基因,分离,(直接分离法),1、直接分离基因,1）反转录法：,以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,单链DNA(cDNA),双链DNA,(即目的基因),反转录,合成,2.人工合成基因法,2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：,根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？,操作简便广泛使用,工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因,专一性强,操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高,专一性最强,仅限于合成核苷酸对较少的简单基因,思考:为什么要构建基因文库?直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗?,哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？,1）DNA序列自动测序仪：,2）PCR技术：,对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。,(二)利用PCR技术扩增目的基因,概念：PCR全称为_，是一项,在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、,_、_(做启动子)、_.前提条件：,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循,环的次数）,结果：,选修1 P,60,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,指数,2,n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,(二)利用PCR技术扩增目的基因,过程：,a、DNA变性,（90-96）：双链DNA模板,在热作用下，_断裂，形成_,b、退火,（,复性,25-65）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸,（70-75）：在Taq酶的作用下，从,引物的,5端3端,延伸，合成与模板互补,的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,1.用一定的_切割,质粒，使其出现一个切,口，露出_。,2.用_切断目,的基因，使其产生_,_。,(二)基因表达载体的构建,核心,3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处，,再加入适量_，形成了一个重组,DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个切口,两个黏性末端,两个切口,获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,核心,同一种,(二)基因表达载体的构建,4.过程:,5.基因表达载体的组成：,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,它们有什么作用？,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,步骤三：目的基因导入受体细胞,(三)将目的基因导入受体细胞,转化,方法,将目的基因导入,植物细胞,将目的基因导入,动物细胞,将目的基因导入,微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法,（1）农杆菌介绍,（2）原理及适用范围,(三)将目的基因导入受体细胞,2、将目的基因导入动物细胞,（1）方法：显微注射法,（2）程序：,(三)将目的基因导入受体细胞,3、将目的基因导入微生物细胞,（1）思考：为什么选用微生物作为受体细胞？,（2）方法：,4、目的基因的检测和鉴定,大量的受体细胞接受不多的目的基因。处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。,将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,无表达产物,无表达产物,有表达产物,无表达产物,(四)目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA,上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交,（DNA-RNA杂交）,抗原抗体杂交,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,二、基因工程的应用,一,、植物基因工程硕果累累,一、基因工程与作物育种,转黄瓜抗青枯病基因的甜椒,转鱼抗寒基因的番茄,转基因工程技术主要用于,提高农作物的抗逆能力,以及,改良农作物的品质和利用植物生产药物,等方面.,利用转基因改良植物的品质,1、繁殖具有,抗病能力,、,高产仔率,、,高产奶率,和,高质量的皮毛,等优良品质的,转基因动物,。,二、基因工程在畜牧养殖业上的应用,将人的,生长激素基因,和牛的生长激素基因分别注射到小白鼠受精卵中，得到的“,超级小鼠,”。,生长快、肉质好的转基因鲤鱼(中国),超级羊,乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷),2、利用某些特定的外源基因在哺乳动物体内表达，从这些动物的,乳腺细胞,中生产药物，如激素、抗体及酶类等。,基因工程在畜牧养殖业上的应用,3.用转基因的动物作器官移植的供体,导入人基因具特殊用途的猪,背上长人耳的老鼠,三、基因工程与药物研制,我国生产的部分基因工程疫苗和药物,许多药品的生产是从,生物组织,中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。,微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若,将生物合成相应药物成分的基因,导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。,生产基因工程药品,胰岛素,治疗糖尿病,的,特效药,。,干扰素,抗病毒,的,特效药,。,人造血液及其生产,我国生产的部分基因工程疫苗和药物,白细胞介素、溶血栓剂、凝血因子、人造血液代用品,疫苗：,乙肝、狂犬病、百日咳、霍乱、伤寒、疟疾,基因工程药品,基因诊断：,也称为,DNA诊断,或,基因探针技术,，即在DNA水平分析检测某一基因，从而对特定的疾病进行诊断。,基因治疗曙光初照,是指是把,健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞,中，达到治疗疾病的目的。,基因治疗：,基因工程与环境保护,环境监测：,检测环境中的病毒、细菌等污染。,用,DNA探针,可以检测,饮用水中病毒,的含量。,1t水中有10个病毒也能被检测出来,快速灵敏,利用基因工程培育的“指示生物”能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。,环境污染治理,1）用基因工程产物“,超级细菌,”分解石油，可以大大提高细菌分解石油的效率。,3）通过基因重组构建新的,杀虫剂,，取代生产过程中耗能多、易造成环境污染的农药，并试图通过基因工程,回收和利用工业废物,。,2）用基因工程培养出,“吞噬”汞和降解土壤,中,DDT,的,细菌,，以及能够,净化镉污染,的,植物,。,基因工程与食品业,基因工程为人类开辟,新的食物来源,。,1）,鸡蛋白基因,在大肠杆菌和酵母菌中表达获得成功。这表明，未来能用发酵罐培养的大肠杆菌或酵母菌来生产人类所需要的,卵清蛋白,。,2）用基因工程的方法,从微生物中获得,人们所需要的,糖类,、,脂肪,和,维生素,等产品。,基因工程为食品工业中提供了什么前景？,当人类拥有了只有大自然才拥有的改造生物、创造生物的能力时，我们是否感到很坦然呢？,转基因食品,安全吗,?!,目前，大多数专家认为，已经投入商品化生产的转基因番茄、玉米等农产品都是安全的。迄今为止尚无食用转基因生物产品引起任何严重问题的科学报道。,1、质粒是基因工程中最常用的运载体，它的主要特点是,能自主复制 不能自主复制 结构很小 蛋白质 环状RNA 环状DNA,能“友好”地“借居”,AB,C D,人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因的主要作用是,A.提高受体细胞在自然环境中的耐药性,B.有利于对目的基因是否导入进行检测,C.增加质粒分子的分子量,D便于与外源基因连接,