多巴胺包裹的纳米金粒子介导的光热治疗对黑色素瘤生长的抑制作用.pdf

论著多巴胺包裹的纳米金粒子介导的光热治疗对黑色素瘤生长的抑制作用*饶运佳 严瑾 王文茜 朱冬梅 林涛 王洁 向小聪 陈竹 冯刚(南充市中心医院川北医学院第二临床医学院组织工程与干细胞研究所,四川 南充 6 3 7 0 0 0)【摘要】目的 探索多巴胺包裹的纳米金粒子(A uP D A)介导的光热治疗对黑色素瘤生长的抑制作用。方法 制备用于光热治疗的球形纳米金粒子(A u)和A uP D A;体外分别通过C C K-8、划痕实验、A n n e x i n V/P I双染法检测A u P D A介导的光热治疗对细胞增殖、迁移和凋亡的影响;通过检测光照后HMG B 1分泌情况,验证光热治疗对细胞免疫性的影响;通过动物实验验证A u P D A介导的光热治疗对肿瘤生长、机体免疫的激活情况;最后通过HE染色观察纳米粒子对各主要脏器的影响。结果 成功地制备了形貌均一的球形的A u和A u P D A,A u P D A在8 0 8 n m激光照射后,能显著诱导细胞凋亡,抑制细胞的增殖和迁移,促进细胞分泌HMG B 1;动物实验结果显示A uP D A光照后能显著地导致肿瘤组织坏死、增加肿瘤组织中浸润T淋巴细胞数量,激活机体抗肿瘤免疫,抑制肿瘤生长。结论 A u P D A介导的光热治疗,不仅可以通过直接的热能杀伤肿瘤细胞,还可以激活机体的抗肿瘤免疫反应,从而抑制肿瘤的生长。【关键词】光热治疗;黑色素瘤;多巴胺;纳米金粒子;免疫激活【中图分类号】R 7 3 9.5 【文献标志码】A D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 2-3 5 1 1.2 0 2 3.1 2.0 0 8 基金项目:国家自然科学基金(8 1 9 0 3 0 2 6);大学生创新创业训练计划平台(2 0 2 1 1 0 6 3 4 0 5 5,2 0 2 2 1 0 6 3 4 0 3 0);南充市市校合作项目(2 0 S XQ T 0 1 3 4,2 0 S X Q T 0 1 4 0,2 2 S X Q T 0 3 1 1)通讯作者:陈竹,副研究员,E-m a i l:j e s s i c a c h e n 1 9 8 4n s m c.e d u.c n引用本文:饶运佳,严瑾,王文茜,等.多巴胺包裹的纳米金粒子介导的光热治疗对黑色素瘤生长的抑制作用J.西部医学,2 0 2 3,3 5(1 2):1 7 5 7-1 7 6 5.D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 2-3 5 1 1.2 0 2 3.1 2.0 0 8T h e i n h i b i t i o n o f m e l a n o m a b y p h o t o t h e r m a l t h e r a p y w i t h d o p a m i n e-c o a t e d g o l d n a n o p a r t i c l e sR A O Y u n j i a,Y A N J i n,WA N G W e n x i,Z H U D o n g m e i,L I N G T a o,WA N G J i e,X I A N G X i a o c o n g,C H E N Z h u,F E N G G a n g(I n s t i t u t e o f T i s s u e E n g i n e e r i n g a n d S t e m C e l l s,T h e S e c o n d C l i n i c a l M e d i c a l C o l l e g e o f N o r t h S i c h u a n M e d i c a l C o l l e g e,N a n c h o n g C e n t r a l H o s p i t a l,N a n c h o n g 6 3 7 0 0 0,S i c h u a n,C h i n a)【A b s t r a c t】O b j e c t i v e T o e x p l o r e i n h i b i t i o n o f m e l a n o m a g r o w t h b y p h o t o t h e r m a l t h e r a p y m e d i a t e d w i t h d o p a-m i n e-c o a t e d g o l d n a n o p a r t i c l e s(A uP D A).M e t h o d s F i r s t l y,s p h e r i c a l g o l d n a n o p a r t i c l e s(A u)a n d A uP D A w e r e p r e p a r e d f o r p h o t o t h e r m a l t h e r a p y(P T T).C e l l s u r v i v a l r a t e w a s t e s t b y C C K-8,c e l l m i g r a t i o n w a s m e a s u r e d b y s c r a t c h t e s t,a n d t h e a p o p t o s i s w a s d e t e c t e d b y A n n e x i n V/P I s t a i n i n g i n v i t r o.T h e s e c r e t i o n o f HMG B 1 f r o m c e l l s a f t e r p h o t o-t h e r m a l t h e r a p y w a s m e a s u r e d b y E L I S A t o c o n f i r m t h e i n f l u e n c e o n t u m o r c e l l i mm u n i t y.F u r t h e r,t h e t u m o r i n h i b i t i o n a n d a n t i-t u m o r i mm u n e r e s p o n s e a c t i v a t i o n b y A uP D A m e d i a t e d P T T w e r e o b s e r v e d i n v i v o.F i n a l l y,t h e e f f e c t s o f n a n o p a r t i c l e s o n t h e m a j o r o r g a n s w e r e o b s e r v e d b y HE s t a i n i n g.R e s u l t s T h e A u a n d A u P D A w e r e b o t h s u c c e s s f u l l y p r e p a r e d.A u P D A c o u l d s i g n i f i c a n t l y i n d u c e c e l l a p o p t o s i s,i n h i b i t c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d m i g r a t i o n,i n c r e a s e t h e s e c r e-t i o n o f HMG B 1 a f t e r i r r a d i a t e d w i t h 8 0 8 n m l a s e r.T h e a n i m a l e x p e r i m e n t r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e p h o t o t h e r m a l t h e r a p y m e d i a t e d w i t h A u P D A c o u l d s i g n i f i c a n t l y l e a d t u m o r t i s s u e n e c r o s i s,i n c r e a s e t h e n u m b e r o f i n f i l t r a t i o n T c e l l i n t u m o r t i s s u e,a c t i v e t h e a n t i-t u m o r i mm u n e r e s p o n s e,a n d f i n a l l y i n h i b i t t u m o r g r o w t h.HE s t a i n i n g r e s u l t s s h o w e d t h e n a n o p-a r t i c l e s h a d n o o b v i o u s d a m a g e t o t h e m a i n o r g a n.C o n c l u s i o n P h o t o t h e r m a l t h e r a p y m e d i a t e d b y A u P D A c a n n o t o n l y k i l l t u m o r c e l l s t h r o u g h d i r e c t l y h e a t e n e r g y,b u t a l s o a c t i v a t e t h e a n t i-t u m o r i mm u n e r e s p o n s e t o i n h i b i t t u m o r g r o w t h.【K e y w o r d s】P h o t o t h e r m a l t h e r a p y;M e l a n o m a;D o p a m i n e;G o l d n a n o p a r t i c l e s;I mm u n e a c t i v a t i o n7571西部医学 2 0 2 3年1 2月 第3 5卷第1 2期 M e d J W e s t C h i n a,D e c e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 5,N o.1 2 恶性黑色素瘤(M e t a s t a t i c m e l a n o m a,MM)是一种由皮肤和其他器官的黑色素细胞产生的肿瘤,是一种侵袭性和恶性程度很高的肿瘤1。外科手术治疗仍是恶性黑色素瘤的首选治疗方案2,但手术治疗无法解决黑色素瘤复发和转移的问题3。由于黑色素瘤对放化疗并不敏感,因此放化疗在黑色素瘤的治疗中受到了很大的限制。因此,积极探索黑色素瘤新的治疗方式 是非常必要 的。光 热 治 疗(P h o t o t h e r m a l t h e r a p y,P T T)是近年来新兴的肿瘤疗法。光热治疗主要是通过光敏剂将光能转化成热能,造成肿瘤局部高温从而杀伤肿瘤细胞4。近年来,P T T在浅表肿瘤的治疗中显示出了良好的应用前景。目前,光热治疗的研究方向主要集中在利用人工修饰的纳米光敏剂介导光热治疗。纳米尺寸的光敏剂可以通过粒径依赖的高通透 性和滞留效 应(E n h a n c e d p e r m e a b i l i t y a n d r e t e n t i o n e f f e c t,E P R效应)被动靶向肿瘤组织;也可以通过连接靶向基团主动靶向肿瘤组织,从而富集在肿瘤组织深部,对肿瘤深部组织产生治疗作用,其热疗的效果极大地优于目前临床所采用的传统热疗。纳米金粒子(A u)具有良好的光热转化效率,是一种理想的光热治疗材料。多巴胺可以在温和的条件下包裹修饰纳米金粒子,改善A u的生物相容性。同时,多巴胺本身也具有良好的光热转化效率,可以协同增强A u的光热转化效率。更重要的是多巴胺含有丰富的官能团,可以进一步接枝其他功能基团。因此,本研究中我们尝试利用多巴胺修饰的纳米金粒子(A u P D A)作为光热治疗的光热材料,探索其在体内外对黑色素瘤细胞的抑制作用。1 材料与方法1.1 主要试剂与仪器 氯金酸溶液和柠檬酸钠粉末均购于中国上海源叶生物科技有限公司,盐酸多巴胺购买于美国S i g m a公司,小鼠黑色素瘤细胞(B 1 6 F 0)购于中国科学院上海细胞库,胎牛血清和1 6 4 0培养液均购于美国T h e r m o公司,0.2 5%胰酶购于美国G i b c o公司,C C K-8试剂盒购于中国凯基生物科技发展有限公司,A n n e x i n V/P I凋亡试剂盒购于中国南京诺唯 赞 生 物 科 技 股 份 有 限 公 司,M o u s e HMG B 1 E L I S A K I T购于中国广州睿信生物科技有限公司,C D 4一抗购买于美国A B c a m公司,C D 8一抗购于美国C e l l s i g n a l i n g T e c h n o l o g y公司,二抗购于中国赛维尔生物有限公司,其余化学试剂均为市售分析纯。流式细胞仪(F A C S C a l i b u r,美国B D公司),纳米粒度仪 Z e t a 电 位 分 析 仪(D L S,Z S 9 0,英 国 M a l v e r n 公司),透 射 电 子 显 微 镜(T EM,T e c n a i G 2 F 2 0 S-TW I N,美国 F E I 公司),倒置显微镜(DM i 8,德国L e i-c a公司),光纤激光器(中国西安镭泽电子科技有限公司),I C P-O E S(A R C O S,德国S p e c t r o公司),F L I R ON E红外热像仪(美国F L I R公司)。1.2 方法1.2.1 材料的制备1.2.1.1 A u的制备 氯金酸溶液工作液配制:取3 0.6 L氯金酸溶液于5 m L去离子水中,混匀,避光。柠檬酸钠工作液配制:准确称取柠檬酸钠粉末1 g,溶于1 0 0 m L去离子水中,快速搅拌或超声使柠檬酸钠完全溶解。A u的制备:取1 m L氯金酸工作液和5 m L柠檬酸钠工作液溶解于1 0 0 m L去离子水中,搅拌混匀。1 0 0 加热使之快速沸腾2.5 m i n后,调至8 0,维持沸腾状态5 m i n,溶液由透明变为酒红色,可得A u,室温冷却后,1 3 0 0 0 r p m,离心2 0 m i n,弃去上清液。1.2.1.2 A u P D A的制备 T r i s-HC l溶液配制:取T r i s粉末2.4 2 g于2 L去离子水中,调p H为8.8,充分混匀。将8 0 m g 盐酸多巴胺和1 0 m L A u加入到4 8 0 m L的T r i s-HC l溶液中,再盖上保鲜膜,于4 5 下充分搅拌2 h;先在5 0 0 0 r p m下离心1 0 m i n,再在离心力1 0 0 0 0 g下离心1 52 0 m i n,吸去上清液,去离子水洗去多余的多巴胺,可得多巴胺包裹的纳米金粒子(A u P D A)。1.2.2 纳米粒子的表征 将A u和A uP D A样品分散于乙醇中,并滴在铜网上,干燥喷金后通过T EM表征其形貌;将A u和A uP D A的稀释液体样品置于比色皿中,使用纳米粒度仪测试样品水合粒径和Z e t a电位。1.2.3 体外光热性能考察 将制备好的A u和A uP D A用去离子水配制成溶液,用I C P-O E S对溶液中A u进行定量,使溶液中A u的浓度为0.2 g/L。取4 0 0 L液体置于1.5 m L E P管中,用8 0 8 n m激光(1 W/c m2)照射1 0 m i n,然后关闭激光,恢复至室温。用红外热像仪记录照射后溶液温度的变化。循环照射3次,观察A u和A u P D A粒子温度变化,绘制温度-时间变化曲线。每组实验3个平行样品。1.2.4 细胞培养及分组 B 1 6 F 0用含有1 0%F B S的1 6 4 0培养基,3 7 5%C O2条件进行培养,每日观察细胞生长状态,定期换培养基,当细胞融合度达到8 0%9 0%时,用0.2 5%胰酶消化传代。将B 1 6 F 0细胞加入含有2.5 L的A u(A u为0.2 g/L)、A uP D A(A u为0.2 g/L)、生理盐水的培养基分别记为A u组、A uP D A组、C o n t r o l组。将A u组、A uP D A组细胞培养6 h后,1 W/c m2的8 0 8 n m激光照射2 0 m i n,分别记为A u+N I R组和A uP D A+8571西部医学 2 0 2 3年1 2月 第3 5卷第1 2期 M e d J W e s t C h i n a,D e c e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 5,N o.1 2N I R组。1.2.5 体外对黑色素瘤生长的影响1.2.5.1 细胞相容性实验 5组B 1 6 F 0细胞(每孔8 1 03个细胞)接种于9 6孔板中,分别在0、2 4和4 8 h使用C C K-8法测定细胞存活率。1.2.5.2 细胞迁移检测 5组B 1 6 F 0细胞(每孔21 04个细胞)接种于1 2孔板中,培养3 6 h后,用2 0 L的枪头在孔板上划3条直线,并用生理盐水洗两次后加入相应的细胞培养液,分别于0、1 2、2 4 h于显微镜下拍照,用I m a g e J处理并计算细胞迁移率,细胞迁移率=(0 h划痕宽度-培养后划痕宽度)/0 h划痕宽度1 0 0%。1.2.5.3 细胞凋亡检测 5组B 1 6 F 0细胞(每孔21 04个细胞)接种于1 2孔板中,培养1 2 h后,向孔板中加入相应的细胞培养液,光照4 8 h后,用A n n e x i n V/P I凋亡试剂盒染色后,流式细胞仪分析。1.2.5.4 HMG B 1检测 B 1 6 F 0细胞(每孔11 04个细胞)接种于2 4孔板中,培养1 2 h后,向孔板中加入相应的培养液,4 8 h后再次按照相同方法光照,光照后立即收集上清液用HMG B 1试剂盒进行检测。1.2.6 动物实验1.2.6.1 实验动物 选取3 0只S P F级68周龄的C 5 7 B L/6小鼠,雄性,体重约2 0 g,购于川北医学院动物实验中心。本实验所有实验方案均符合川北医学院动物实验伦理学要求。1.2.6.2 动物模型的构建及实验过程 制备B 1 6 F 0细胞悬液(21 06/1 0 0 L),每只小鼠注射1 0 0 L的细胞悬液于小鼠右侧肩部。待小鼠肿瘤体积增长到1 5 0 mm3时,将小鼠随机分成5组,每组6只,开始进行治疗。实验分组分为C o n t r o l组、A u组、A u+N I R组、A u P D A组和A u P D A+N I R组。整个治疗过程,每个疗程间隔1天,处理方式给药见表1。每组光热治疗均使用同一激光发射器,光线聚于明显的肿瘤病灶处,距离光源的高度约为3.0 c m,治疗时间持续为2 0 m i n;每隔2天测量一次肿瘤的体积,肿瘤体积=长径短径短径/2;在细胞造模处理荷瘤鼠1 8天后,处死小鼠取肿瘤组织拍照并称重,具体治疗流程见图1。称重后,小鼠的肿瘤组织用4%福尔马林固定,石蜡包埋切片后进行免疫组化染色,观察肿瘤组织中的浸润T淋巴细胞。摘取小鼠的主要脏器(心肝脾肺肾),4%福尔马林固定,石蜡包埋切片后进行常规HE染色。1.3 统计学分析 采用S P S S 1 6.0软件进行统计学分析,计量资料采用(xs)表示,多组间数据比较使用单因素方差分析。每组至少进行3次平行实验,免疫 表1 5组小鼠处理方式T a b l e 1 T r e a t m e n t s i n e a c h g r o u p组别注射量(L)瘤内注射(g/L)8 0 8 n m激光照射照射条件C o n t r o l组2 0生理盐水否-A u组2 01 0否-A u+N I R组2 01 0是1 W/c m2A u P D A组2 01 0否-A u P D A+N I R组2 01 0是1 W/c m2图1 5组小鼠治疗过程示意图F i g u r e 1 S c h e m a t i c i l l u s t r a t i o n o f t r e a t m e n t p r o c e s s组化阳性细胞数采取I m a g e J软件进行统计。以P0.0 5为差异具有统计学意义。2 结果2.1 纳米粒子的基本理化性能 本研究成功制备了多巴胺包裹的纳米金粒子,多巴胺能够均匀地包裹纳米金粒子。A u和A u P D A均呈球状(2 A、B);D L S测试A u的水合粒径为(1 0 3)n m,A u P D A的水合粒径为(1 2 0 4 0)n m(图2 C)。Z e t a电位结果显示,多巴胺修饰后并没有显著改变纳米金粒子表面电荷,A u和A uP D A的Z e t a电位均在-2 0 mV左右(图2 D)。2.2 A u和A u P D A光热性能分析 体外的光热性能实验结果显示,经过1 0 m i n的照射,A u温度升至(4 0.80.1),而A uP D A温度则升至(4 9.30.1),A u和A u P D A均具有良好且稳定的光热性能,光照后温度可以显著升高,但A u P D A表现出比A u更好的光热性能,见图3。这表明多巴胺对金粒子的光热性能起到了很好的协同作用,纳米粒子在3个升温降温的周期中均保持了良好的光热性能。2.3 体外对黑色素瘤细胞生长的影响2.3.1 纳米粒子的生物相容性和对黑色素瘤生长的抑制作用 迁移实验结果显示,A u P D A+N I R组细胞迁移率显著低于其他各组(P0.0 5);A u+N I R组在1 2 h和2 4 h的迁移率,均高于A uP D A+N I R组,而低于C o n t r o l组、A u组和A uP D A组(P0.0 5),见图4。C C K-8结果显示,A u和A uP D A在不光照的条件下,细胞存活率均高于8 0%,表现出了9571西部医学 2 0 2 3年1 2月 第3 5卷第1 2期 M e d J W e s t C h i n a,D e c e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 5,N o.1 2 图2 多巴胺包裹的纳米金粒子的基本性能图F i g u r e 2 B a s i c p r o p e r t i e s o f d o p a m i n e-c o a t e d g o l d n a n o p a r t i c l e s注:A.A u的形貌;B.A u P D A的形貌;C.D L S检测A u和A u P D A的水合粒径;D.Z E T A电位。与A u P D A+N I R组比较,P0.0 5。图3 纳米粒子的光热性能(n=3)F i g u r e 3 P h o t o t h e r m a l p r o p e r t i e s o f n a n o p a r t i c l e s注:A.A u和A u P D A的升温曲线图;B.升温降温曲线图;C.近红外热成像图。良好的生物相容性;在光照后,各组的细胞存活率显著下降。其中A uP D A+N I R组细胞存活率最低,光照后2 4 h细胞存活率仅为(3 5.40.4)%,4 8 h的存活率为(3 9.50.5)%,各时间点的存活率均明显低于其他组(P0.0 5);A u+N I R组的细胞存活率则降低到6 0%左右,见图5。细胞凋亡的结果显示,A uP D A+N I R组细胞凋亡率最高;A u+N I R组细胞早期凋亡率和晚期凋亡率均高于C o n t r o l组、A u组和A u P D A组(P0.0 5),见图6。以上结果表明,A uP D A和A u均能够抑制B 1 6 F 0细胞凋亡,但A u0671西部医学 2 0 2 3年1 2月 第3 5卷第1 2期 M e d J W e s t C h i n a,D e c e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 5,N o.1 2 图4 纳米粒子对B 1 6 F 0细胞迁移能力的影响F i g u r e 4 I n f l u e n c e o n B 1 6 F 0 c e l l m i g r a t i o n b y n a n o p a r t i c l e注:与A u P D A+N I R组比较,P0.0 5。图5 纳米粒子对B 1 6 F 0细胞增殖能力的影响F i g u r e 5 E f f e c t o f n a n o p a r t i c l e s o n p r o l i f e r a t i o n o f B 1 6 F 0 c e l l s注:与A u P D A+N I R组比较,P0.0 5。P D A抑制B 1 6 F 0细胞迁移和增殖能力更强。2.3.2 光照对黑色素瘤细胞免疫原性的影响 在本研究中,我们对光照后B 1 6 F 0细胞分泌的HMG B 1进行了检测,结果显示,光热治疗组分泌的HMG B 1明显增加,其中A uP D A+N I R组分泌的HMG B 1最高,其次为A u+N I R组,均显著高于其他各组(P0.0 5),见图7。2.4 体内的抗肿瘤实验2.4.1 肿瘤体积和重量变化 动物实验的结果显示,在整个治疗期间,A uP D A+N I R组小鼠的肿瘤生长较缓慢,光照治疗对该组小鼠的肿瘤生长表现出显著的抑制作用;A u+N I R组小鼠的肿瘤在前两次治图6 细胞凋亡实验的代表性流式图和细胞凋亡实验的统计学结果(n=3)F i g u r e 6 R e p r e s e n t a t i v e i m a g e s o f a p o p t o s i s e x p e r i m e n t a n d t h e s t a t i s t i c a l r e s u l t s注:与A u P D A+N I R组比较,P0.0 5。1671西部医学 2 0 2 3年1 2月 第3 5卷第1 2期 M e d J W e s t C h i n a,D e c e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 5,N o.1 2图7 治疗后B 1 6 F 0细胞分泌HMG B 1的统计结果(n=3)F i g u r e 7 S t a t i s t i c a l r e s u l t s o f HMG B 1 s e c r e t e d f r o m B 1 6 F 0 c e l l s a f t e r t r e a t m e n t注:与A u P D A+N I R组比较,P0.0 5。疗中对肿瘤有较显著的抑制,在第1 4天后,肿瘤迅速生长,A u+N I R已经无法抑制肿瘤生长。在第1 8天处死小鼠后,取各组肿瘤的瘤块进行称重。相对于其余各组,A uP D A+N I R组的肿瘤的重量为(0.5 0.1)g,其余各组的肿瘤体重均大于2 g,见图8。表明A u P D A+N I R组对体内肿瘤的生长起到了显著的抑制作用,且多巴胺的包裹对金粒子的光热作用起到了显著的协同增强作用。2.4.2 体内各组织的组织学染色结果 光热治疗能显著地引起肿瘤组织的坏死,光照组的坏死组织明显增多,见图9。免疫组织化学染色的结果表明,A uP D A+N I R组肿瘤组织浸润的C D 4+T细胞和C D 8+T细胞最多,视野中阳性细胞数分别为(1 81)个和(91)个;A u+N I R组肿瘤组织浸润的C D 4+、C D 8+T细胞在视野中阳性细胞数分别为(91)个和(61)个,均高于非光照组(P0.0 5),见图1 0,这表明光照激活了机体的抗肿瘤免疫反应。小鼠主要脏器的HE染色结果显示实验组小鼠的主要脏器无显著的结构变化和炎症反应(图1 1),提示A uP D A和A u具有良好的生物相容性。3 讨论纳米金粒子主要包括球形纳米金粒子和金纳米棒和金纳米笼等非球形纳米金粒子5,在这些纳米金粒子中,非球形的纳米粒子光热转化效率较高,但其制备过程复杂,所需的试剂毒性较强6-7。而制备球形纳米金粒子仅需要用到柠檬酸钠缓冲液,且制备过程 图8 纳米粒子在体内对小鼠黑色素瘤的生长抑制情况F i g u r e 8 T h e i n v i v o a n t i-t u m o r e f f i c i e n c y a n a l y s e s b y n a n o p a r t i c l e s注:A.小鼠肿瘤大体图;B.肿瘤重量图;C.肿瘤生长曲线。与A u P D A+N I R组比较,P0.0 5。图9 肿瘤H E染色结果(1 0 0,标尺=2 5 0 m)F i g u r e 9 T h e H E s t a i n i n g r e s u l t s o f t u m o r t i s s u e注:箭头所示为典型的坏死肿瘤组织。2671西部医学 2 0 2 3年1 2月 第3 5卷第1 2期 M e d J W e s t C h i n a,D e c e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 5,N o.1 2图1 0 肿瘤组织的C D 4和C D 8细胞情况F i g u r e 1 0 T h e i mm u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g r e s u l t s o f t u m o r t i s s u e注:A.肿瘤组织的C D 4免疫组化染色(4 0 0,标尺=1 0 0 m);B.C D 8免疫组化染色(4 0 0,标尺=1 0 0 m);C.C D 4免疫组化染色结果统计图;D.C D 8免疫组化染色结果统计图。箭头所示为典型的阳性细胞;与A u P D A+N I R组比较,P0.0 5。图1 1 小鼠主要器官的H E染色图像(1 0 0,标尺=5 0 0 m)F i g u r e 1 1 T h e H E s t a i n i n g r e s u l t s o f m a i n o r g a n s o f m i c e简单,安全性大大的优于其他形貌的纳米金粒子。但球形纳米金粒子的不足之处在于光热转换效率不及非球形纳米金粒子高。为了弥补球形纳米金粒子光热转换效率不高的问题,我们选取同样有具有光热转3671西部医学 2 0 2 3年1 2月 第3 5卷第1 2期 M e d J W e s t C h i n a,D e c e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 5,N o.1 2换能力的多巴胺进行修饰。一方面,多巴胺提高了球形纳米金粒子的光热转换效率;另一方面,多巴胺含有丰富的官能团,为进一步接枝其他功能基团,为赋予纳米金粒子更多的生物学功能提供了基础8-9。本研究中,我们采用简单而温和的方法成功地制备了A u P D A和A u,两种粒子形貌呈均匀的球形,P D A对A u的包裹均匀,未显著改变A u的Z e t a电位。光热曲线显示A uP D A相较于A u升温速度快,温度更高,说明多巴胺的包裹对纳米金粒子的光热效应起到了显著的协同作用。C C K-8实验证实A u和A uP D A粒子具有良好的生物相容性,符合G B/T 1 4 2 3 32-2 0 0 5标准中大于8 0%的要求1 0。在体内的抗肿瘤实验中,各脏器的HE染色结果也表明纳米金粒子对各脏器无显著的影响。P T T是利用光热传导剂的光热效应将光能转化为热能,从而提高病灶周围环境的温度,高温使细胞膜发生损伤,导致直接的细胞坏死1 1-1 2,从而影响了细胞的增殖和迁移。同时,热疗也可以通过增加调亡相关基因的表达(如P 5 3基因等)从而诱导细胞调亡1 3。本研究中,我们在体外细胞实验中证实了A u和A u P D A粒子为光敏剂的光热治疗显著的诱导了黑色素瘤细胞的凋亡,抑制了黑色素瘤细胞的增殖和迁移。近年来,文献报道光热治疗还可以诱导肿瘤的免疫原性死亡,从而激活机体的抗肿瘤免疫1 4。大量文献证实,光热治疗后的肿瘤部位抗原递呈细胞和浸润T细胞比例显著增加,血清中抗肿瘤的炎性因子也有所增加1 5-1 6。目前,研究者认为光热治疗主要是通过诱发肿 瘤 细 胞 的 免 疫 原 性 死 亡(I mm u n o g e n i c c e l l d e a t h,I C D),从而激活机体的免疫。I C D是指细胞在发生凋亡的同时,从非免疫原性细胞转化为免疫原性细胞,并由此激发机体内抗肿瘤的免疫杀伤效应1 7。其发生的机理是细胞在凋亡后,释放出损伤相关分子模式标志物,如钙网织蛋白(C a l r e t i c u l i n,C R T)、三磷酸腺苷(A d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e,AT P)、HMG B 1和热休克蛋白7 0(H e a t S h o c k P r o t e i n s 7 0,H S P 7 0)等,向免疫系统发出“e a t m e”的信号,诱导抗原递呈细胞来吞噬这些死亡的肿瘤细胞,进而将这些信号递呈给T细胞,激活T细胞,激发机体的免疫1 8。高迁移率蛋白B 1(H i g h m o b i l i t y g r o u p p r o t e i n B-1,HMG B 1)是肿瘤免疫原性死亡的一种标志性蛋白1 9。在本研究中,我们检测了光照后B 1 6 F 0细胞HMG B 1分泌情况。结 果 显 示,光 照 组 的 黑 色 素 瘤 细 胞 分 泌 的HMG B 1显著升高。这表明,A u P D A和A u经过光热治疗让黑色素瘤细胞发生了免疫性死亡,进而激活了机体的抗肿瘤免疫反应。动物实验结果证实,光照组的肿瘤组织中的浸润C D 8+、C D 4+T淋巴细胞的数量显著增多。C D 8+T淋巴细胞是具有细胞毒性的免疫细胞,其所介导的细胞毒T淋巴细胞反应(C y t o-t o x i c T l y m p h o c y t e,C T L)是经典的抑制肿瘤生长的免疫反应2 0-2 1。C T L即可以分泌I F N-抑制肿瘤生长;又可以在识别肿瘤抗原后,通过分泌穿孔素、颗粒酶发挥直接杀伤肿瘤细胞的作用2 2。C D 4+T淋巴细胞中TH 1型细胞被证实具有抗肿瘤作用2 3-2 4。TH 1型C D 4+T细胞可以通过表达C D 4 0 L等膜分子和分泌I F N-等细胞因子活化巨噬细胞,也可产生I L-2等细胞因子促进TH 1、C T L和NK等细胞的活化,增强抗肿瘤免疫反应2 5。就本次实验的结果来看,肿瘤的生长受到了显著性的抑制。因此,我们更趋向认为肿瘤组织中的浸润C D 4+T细胞属于TH 1型C D 4+T细胞。肿瘤组织中浸润C D 4+T细胞和C D 8+T细胞数量的增加,这表明机体的抗肿瘤免疫反应被显著的激活。4 结论本研究中我们成功地利用多巴胺包裹纳米金粒子作为光敏剂,将其应用到黑色素瘤的光热治疗中。实验结果表明,A uP D A不仅可以通过直接的热能诱导B 1 6 F 0的凋亡,抑制其增殖、迁移,生长;同时,光热治疗还可以通过诱导B 1 6 F 0发生I C D反应,从而激活机体的抗肿瘤免疫反应。A uP D A粒子在黑色素瘤治疗中的具有良好的应用前景,为黑色素瘤的治疗提供了一种新的治疗途径。同时,黑色素瘤作为肿瘤免疫治疗的一种模型肿瘤,也为光热治疗在其他实体瘤中的应