实验三ELISA.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,免 疫 系,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验三ELISA,酶联免疫吸附测定,(,E,nzyme-,l,inked,i,mmuno,s,orbent,a,ssay,简称,ELISA),是以免疫学反应为基础，将,抗原、抗体的特异性反应,与,酶对底物的高效催化作用,相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。,实验原理,实验原理,实验原理,1.,已知的,抗原或抗体结合到,特定的,固相载体,表面（聚苯乙烯微量反应板，利用,蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附），并保持其,免疫学活性,2.,抗原抗体的特异性结合,以已知抗原检测未知抗体,以已知抗体检测未知抗原,3.,抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其,免疫学,和,酶学活性,结合在固相载体上的,酶量,与,标本中待测,抗原或抗体的量成正比,实验原理,实验原理,4.,酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且,颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的,，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果,还可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将,酶化学反应的敏感性,和,抗原抗体反应的特异性,结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。,常用于,ELISA,法的酶有,辣根过氧化物酶,(HRP),，,碱性磷酸酯酶,等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶催化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定（,30min,内），否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。,ELISA,法中所用的酶要求纯度高，催化反应的转化率高，转一性强，性质稳定，继续保留它的活性部位和催化能力。,OPD,（邻苯二胺）,被认为是,HRP,最为敏感的,色原底物,之一，其在,HRP,的作用下，由过氧化氢,(H202),氧化而聚合成,2,，,2,二氨基偶氮苯,(DAB,）。,实际工作中，用强酸尤其是盐酸终止反应后，显色并不稳定，常随时间增长而颜色加深，这是由于反应后剩余的过氧化氢继续氧化,OPD,而产生非酶催化的,DAB,的结果。有人在强酸反应终止液中加入还原剂如亚硫酸钠，因还原剂可迅速完全地将剩余的过氧化氢还原而阻止了,OPD,的非酶氧化，结果显色稳定，数十小时内不变，而且无需避光。,TMB,（四甲基联苯胺）,是一种优于,OPD,的,新型,HRP,色原底物,。其氧化产物联苯醌在波长,450nm,处有最大消光系数，如果,HRP,量少，过氧化氢溶液和,TMB,过量时，则形成蓝色的阳离子根。降低,pH,，即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌。使用硫酸作为终止剂可使产物稳定,90min,，但随后本底显色就不断加深。,过氧化氢,(H2O2),作为,HRP,底物之一,.,TMB,的显色反应虽与,OPD,一样同属氧化还原反应，但前者的反应是可逆的，如终止液中存在还原剂,(,维生素,C,及亚硫酸钠、,SDS,等,),，则可反应显色迅速消退。,TMB,虽然溶解度相对较低，但由于其高检测敏感性及无致突变作用，现已基本上取代了,OPD,而成为,HRP,最为常用的色原底物。,HRP,的色原底物,450nm,TMB,（四甲基联苯胺）,终止前,OPD,（邻苯二胺）,492nm,ELISA,的类型,双抗体夹心法,竞争,ELISA,间接,ELISA,BAS-ELISA,法,直接法（一步法）,间接法,结合抗原,洗涤,结合酶标抗体,显色（读数）,双抗体夹心,ELISA,基本过程,抗体包被,封闭结合位点,洗涤,洗涤，,加底物反应,思考：,抗体是如何包被在固相载体上的？,封闭的作用？,抗原结合的特点？,为何要有洗涤步骤？,颜色反应为何能反映出抗原的量？,无需,洗涤,CEA,（癌胚抗原）,CEA,最初发现于结肠癌和胎儿肠组织中，故名癌胚抗原。,CEA,升高常见于大肠癌、胰腺癌、胃癌、小细胞肺癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌等。但吸烟、妊娠期和心血管疾病、糖尿病、非特异性结肠炎等疾病，,15%,53%,的病人血清,CEA,也会升高，所以,CEA,不是恶性肿瘤的特异性标志,，在诊断上只有辅助价值。此外，血清,CEA,水平与大肠癌的分期有明确关系，越晚期的病变，,CEA,浓度越高。,良性肿瘤、炎症和退行性疾病，如结肠息肉、溃疡性结肠炎、胰腺炎和酒精性肝硬化变病人,CEA,也有部分升高，但远远低于恶性肿瘤，一般小于,20g/L,，,CEA,超过,20 ng/ml,时往往提示有消化道肿瘤。所以测定,CEA,可以作为良性与恶性肿瘤的鉴别诊断依据。,实验材料,1.,酶标反应板（包被有抗,CEA,抗体）,2.CEA,标准品（,0ng/ml,，,5ng/ml,，,10ng/ml,，,20ng/ml,，,40ng/ml,，,80ng/ml,）,3.,样品,1,和样品,2,4.,酶标抗体,（酶结合物）,5.,底物液,A,和底物液,B,（显色剂,A,和,B,）,6.,终止液,7.,洗涤液,实验材料,底物,A,和,B,为何要分开,每组,8,个孔，其中,6,个孔做标准品,2,个孔做样品,1,和样品,2,0ng,5ng,10ng,20ng,40ng,80ng,S1,S2,分别加,100,l,于每孔，,37,湿盒，,30min,加入酶结合物,100,l,于每孔，,37,湿盒，,30min,分别加显色剂,A,和,B,各,1,滴混匀，,37,湿盒，,15min,（避光）,加终止液,1,滴,肉眼观察结果并读取,OD450,值,注意：,洗涤液的,量,结果观察：,肉眼观察,（,定性,或,半定量,试验,）,酶标仪检测（定量,试验,）,洗涤,4,次,洗涤,4,次,为何要做标准曲线进行定量？,数据分析举例,以,16,孔的标准品,OD,值制备标准曲线，获得回归方程,将待测样品,1,和,2,的,OD,值带入公式，,如样品,1,，,OD,为,0.164,，求得含量,7.4ng/mL,（肉眼观察接近第,23,管）,;,样品,2,，,OD,为,0.802,，求得含量,37.8ng/mL,（肉眼观察接近第,5,管）,注意事项,注意事项,包被,：样品若在几天内检测，可放在,2-8,冰箱中，若要贮存，则置于,-20,的低温冰箱内。,（常规包被,2-8,冰箱,过夜）,试剂盒要注意保质期,孵育,：1)贴封片或加盖,，置湿盒,；2)按说明步骤严格控制操作时间。,洗板：保证洗液注满各孔，洗完板后最好在吸水纸（选择干净、无或少尘的吸水材料）上轻轻拍干,。若用洗板机，请保持,洗板针畅通,。,显色：,显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂,终止：在加终止液时应避免产生气泡。,6.,读板：,若用机器读板，,应保证酶标板,底部,清洁。,本实验中，,抗原：人,IgG,，抗体：羊抗人,IgG,血清，抗原和抗体其实都是免疫球蛋白，为何仍能形成对流出现沉淀线？改变正负极是否依然会出现沉淀线？,琼脂和琼脂糖作为对流免疫电泳的基质，各有何优缺点？,IgG,作为蛋白质在电泳中比较特殊，,4,个亚型有不同的表现，,IgG3,和,IgG4,与一般蛋白质无异，泳向正极，而,IgGl,和,IgG2,则因其带电荷少，受电渗的作用力大于电泳，所以被水分子携裹向负极移动。这就形成了,IgG,的特殊电泳形式：一部分泳向正极，另一部分泳向负极，在抗体孔两侧都有抗体存在，因此所谓对流只是部分,IgG,的电渗作用所致。,琼脂含较多,硫酸根，电渗作用大，但当琼脂质量差时，电渗作用太大，可造成非特异性反应；,琼脂糖,含硫酸根比琼脂少，电泳分离效果较好，可以因电渗作用较弱而不能用于对流免疫电泳。,Ag,Ag,Ag,Ag,Ab,Ab1:4,Ab1:8,Ab1:2,正极,负极,Ag1:2,Ag1:4,Ag1:8,Ag,Ab,Ab,Ab,Ab,正极,负极,稀释抗原或稀释抗体，实验结果会有何不同？,抗体稀释,抗原稀释,抗原 抗体,Thank You!,