基因工程-克隆基因的表达.ppt

*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第七章 克隆基因的表达,9/30/2025,1,遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程中心法则（central dogma）。,一、基因表达：,9/30/2025,2,二、克隆基因的表达：,外源基因在宿主细胞中表达。,外源基因,表达载体,重组载体,导入宿主细胞,在宿主细胞中,表达出蛋白质,提取蛋白,宿主细胞：,原核细胞或真核细胞。,9/30/2025,3,第一节 外源基因在原核细胞中的表达,一、原核生物基因表达的特点,二、原核生物基因表达的调控,三、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,四、几种类型的原核表达载体,五、影响外源基因表达效率的因素,9/30/2025,6,六、提高表达水平常用的方法,七、细菌表达载体举例,八、外源蛋白质表达后的正确修饰,九、原核细胞表达的缺陷,9/30/2025,7,用原核生物作宿主。,A dividing,E.coli,第一节 外源基因在原核细胞中的表达,原核或噬菌体启动子,MCS,SD序列,终止子,9/30/2025,8,识别原核细胞的,启动子,，催化所有的RNA合成。,数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位。,一、原核生物基因表达的特点,2.以操纵子为单位,1.只有一种RNA多聚酶,9/30/2025,9,有意义链,5,反意义链,3,转录,mRNA,5,3,翻译,蛋白质,N,C,5,3,3.转录和翻译偶联、连续进行。,9/30/2025,10,9/30/2025,11,4.不含内含子，缺乏转录后的加工系统。,5.调控主要在转录水平上。,含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3末端碱基互补的序列，叫,Shine-Dalgarno（S-D）序列,。,6.mRNA的核糖体结合位点,Shine-Dalgarno（S-D）sequence:,9/30/2025,12,是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。,大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensus sequence）,。,二、原核生物基因表达的调控,1.启动子,-35 Box 和-10 Box,（1）启动子序列,9/30/2025,13,consensus sequences,9/30/2025,14,5,-TTGACA-3,5,-TATAAT-3,-10box,（Pribnow Box）,TTGACA,TATAAT,转录起始位点,17bp,5,核糖体结合位点,RNA聚合酶,亚基的识别位点。,-35box,9/30/2025,15,（2）翻译的起始位点,1）Shine-Dalgarno（SD）sequence：,mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。,SD,mRNA 5,AGGAGGU,AUG,16S rRNA3,UCCUCCA,S-D序列距离AUG的距离也影响翻译,9/30/2025,16,全酶是一个5聚体，含有两个,小亚基,，和2两个大亚基（,和,），一个,亚基。,2.RNA多聚酶,大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录tRNA，rRNA和mRNA。,（1）结构,9/30/2025,17,3.转录终止子,内终止子,intrinsic terminator：,E.coli,中促使转录终止的DNA位置有一段,反向回文顺序,，其后紧接一串A，称为内终止子，形成终止信号。,在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。,启动子,操纵子,S-D序列,目的基因,终止子,9/30/2025,18,由于茎环3段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。,原因：,反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了RNA与DNA的互补。,茎环结构,多聚A/U,9/30/2025,19,5-CCCACA,GCCGCCAG,TTCCG,CTGGCGGC,ATTTTAA CT TCT TTCT-3,3-GGGTGT,CGGCGGTC,AAGGC,GACCGCCG,TAAAATTGAAGAAAGA-5(模板),转录,5-CCCACA,GCCGCCAG,UUCCG,CUGGCGGC,AUUUU-OH-3(RNA),RNA折叠,mRNA折叠,U C,C,U G,GC,AU,CG,CG,GC,CG,CG,GC,A A,CCCAC UUUU3,DNA,RNA聚合酶,脱落,9/30/2025,20,9/30/2025,21,大肠杆菌偏爱UAA。一般安置上,全部的三个终止密码,防止核糖体跳跃（skipping）。,4.翻译终止密码,5.翻译增强子,Translation enhancer,能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。,T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）;,大肠杆菌,atpE,基因mRNA5-UTR中富含U的区段。,9/30/2025,22,必须是一种强启动子,能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的,10%-30%,以上。,应呈现低水平的基础转录,便于表达毒性蛋白等。,应是可诱导型的,用温度或化学试剂诱导。,（1）最佳启动子必须具备的条件,6.基因工程常用的原核启动子,9/30/2025,23,来自大肠杆菌的乳糖操纵子。,用乳糖或其类似物,IPTG,充当诱导物，与阻遏蛋白结合，解除抑制。,P,lac,O,目的基因,（2）乳糖启动子,lac,9/30/2025,24,阻遏物与操纵基因结合,9/30/2025,25,阻遏物与DNA的结合,9/30/2025,26,（3）色氨酸启动子trp,trpR,P,1,O,trpE,trpD,P,2,trpC,trpB,trpA,trpR,阻遏蛋白基因；,P,1,P,2,启动子；,O,操纵基因；,衰减子,来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。,9/30/2025,27,trpR,P,1,O,trpE,trpD,P,2,trpC,trpB,trpA,邻氨基苯甲,酸合成酶,吲哚甘油,硼酸合成酶,色氨酸,合成酶,链,链,分支酸,邻氨基,苯甲酸,磷酸核糖基,邻氨基苯甲酸,CDRP,吲哚甘,油-磷酸,色氨酸,阻遏物,转录,（P1是主要启动子，P2的作用只有3%。）,没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，能转录合成色氨酸所需要的酶。,9/30/2025,28,trpR,P,1,O,trpE,trpD,P,2,trpC,trpB,trpA,阻遏物,色氨酸,结合,不转录,用于表达载体的trp启动子一般只包含启动基因、操纵基因、和部分trpE基因。,P,1,O,trpE,目的基因,有色氨酸时，阻遏蛋白与色氨酸结合后才能与操纵基因结合，从而阻止色氨酸合成酶类的转录（称为corepressor）。,9/30/2025,29,9/30/2025,30,三、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,1.细胞质中表达,2.周质中表达,3.胞外表达,9/30/2025,31,三、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,1.细胞质中表达,（1）包涵体（inclusion body）,是存在于细胞质中的一种,不溶性蛋白质,聚集折叠而成的晶体结构物。,9/30/2025,32,在大肠杆菌细胞内表达人生长激素（,h,uman,g,rowth,h,ormone,hGH）。,例：,使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞。,回收的蛋白生物活性差。,缺点,优点,9/30/2025,33,9/30/2025,34,9/30/2025,35,2.周质中表达,（1）周质（periplasm）,革兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。,蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理目前不完全清楚,优点：,容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。,9/30/2025,36,phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、,-内酰胺酶（lactamase）、,肠毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等,常用的原核信号肽,大肠杆菌的信号肽：,能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。,（2）信号肽（signal peptide）,一般位于N端。,9/30/2025,37,胡萝卜欧氏杆菌的PelB蛋白。,金黄色葡萄球菌的蛋白A。,枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶,（endoglucanase）。,9/30/2025,38,由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。,用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性融合蛋白；,使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白,分泌到细胞外,的培养基中。,3.胞外表达,或与细菌素释放蛋白（bacteriocin release protein)共表达。,9/30/2025,39,9/30/2025,40,载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。,S-D序列,AUG-外源基因-TAG,优点:,四、几种类型的原核表达载体,1.非融合型表达载体,产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。,缺点：,容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。,9/30/2025,41,哈佛大学的Gilbert实验室建立的。表达能力强。,（1）pKK223-3 载体,组成结构：,强启动子:tac（trp-lac）:,trp的-35区,lacUV5的-10区,lac操纵基因,操纵基因：,乳糖操纵子系统。,9/30/2025,42,终止子：,调节基因：,Lac I,宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。,如JM105菌。,rrnB的强终止子,rrnB强终止子,S-D,插入位点区,S-D序列和插入位点区：,9/30/2025,43,tac P,Lac O,S-D,插入位点区,rrnB T,宿主lac I,载体的其余部分：,来自pBR322质粒。,表达诱导物：,IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）,阻遏物,IPTG,9/30/2025,44,必须选择一个有,lacI,（,-半乳糖苷酶的调节基因,）的宿主菌。,条件：,9/30/2025,45,载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。,如：pIN III系列：,2.分泌型表达载体,pIN III-comA1,pIN III-comA2,pIN III-comA3,（1）组成结构,9/30/2025,46,Ipp,lac P,lac O,S-D/AUG,ompa,插入位点,Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。,调节基因：,lac I,S-D序列和起始密码AUG。,分泌信号肽：,大肠杆菌外膜蛋白基因,ompa,。,插入位点区（多克隆位点）。,强启动子：,9/30/2025,47,pIN III-comA,1,以pBR322为基础构建的。,调节基因不必借助于宿主的,lacI,.,9/30/2025,48,表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。,启动子：,tac,操纵基因：,lacP,调节基因：,lacI,S-D序列,3.融合蛋白表达载体系统-pGEX系列,（1）优点,（2）组成结构,便于融合蛋白的分离和纯化。,9/30/2025,49,lacI,tac,lac O,S-D/ATG,GST,插入位点,TGA,lacP,ori,：pBR322,ori,融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）,GST融合蛋白用Glutathione Sepharose（,谷胱甘肽琼脂糖凝胶,）,亲和层析柱,分离纯化。,（3）产物提纯,9/30/2025,50,（4）产物分离,用凝血酶或Xa因子（,一种丝氨酸蛋白酶,）可以把外源蛋白从GST上切下来。,柱（column）,GST,外源蛋白,凝血酶,外源蛋白,柱（column）,GST,GST,洗脱,柱（column）,可再利用,9/30/2025,51,5,-TTGACA-3,5,-TATAAT-3,-35box,-10box,（Pribnow Box）,五、影响外源基因表达效率的因素,1.启动子的结构对表达效率的影响,RNA聚合酶,亚基的识别位点,（1）一致顺序,9/30/2025,52,（2）-35区与-10区之间的距离,间隔为,17bp,时，启动子最强。,（3）-35区和-10区的碱基顺序,越接近一致顺序，启动子越强。,5,-TTGACA,TATAAT,一致顺序,lac,trp,P,L,recA,tac I,tac II,5,-TTTACA,TATGTT,5,-TTGACA,TTAACT,5,-TTGACA,GATACT,5,-TTGATA,TATAAT,5,-TTGACA,TATAAT,5,-TTGACA,TTTAAT,-35box,-10box,9/30/2025,53,5-AGGAGGU-3,S-D序列后面的4个碱基：,如果是,A（T）,翻译效率最高；,如果是,G（C）,效率只有50%或25%。,2.转译起始序列对表达效率的影响,（1）S-D序列,？,9/30/2025,54,AUG左侧的三个碱基也有影响。,（2）起始密码AUG,-半乳糖苷酶的mRNA中：,AUG左侧如果是,UAU或CUU,时，最为有效；,如果是,UUC、UCA或AGG,时下降20倍。,9/30/2025,55,3.启动子与外源基因之间的距离,9/30/2025,56,转录终止区的存在保证载体,不会转录非必须基因,，不必浪费资源量和能量、不会干扰正常的表达。,增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目。增加表达效率。,4.转录终止区对表达效率的影响,5.载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响,6.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响,但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。,9/30/2025,57,选择强启动子序列，如,tac,等,六、提高表达水平常用的方法,2.调整S-D序列与AUG的距离,距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离。,3.改变起始密码下面的几组密码子,能提高翻译的起始效率。,9/30/2025,58,4.增加mRNA的拷贝数和稳定性,在外源基因的下游插入“,重复性基因外回文序列,”能防止mRNA受到3,5外切酶的攻击。,5.减轻宿主细胞的代谢负荷,合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。,9/30/2025,59,N末端：由原核基因编码一段多肽，,C末端：是完整的真核外源基因。,（1）设计成融合蛋白,这是避免被降解的最好措施。,质粒基因产物,目的基因产物,N,C,切割,6.提高表达产物的稳定性,防止被宿主的酶降解。,9/30/2025,60,使用次黄嘌呤核苷（,lon,）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。,大肠杆菌的,htp R,基因突变也减少蛋白酶的降解作用。,T4噬菌体的,pin,基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把,pin,增加到载体上。,（2）使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解,减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。,9/30/2025,61,（3）表达分泌蛋白,细胞质,外膜,内膜,周间质,质粒,染色体,“外排”：,蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。,“分泌”：,蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。,9/30/2025,62,七、细菌表达载体举例,colE ori,lacI,intein,CBD,MCS,T7Promotor,Amp,r,M13 ori,rop,维持拷贝数,pTYB1，pTYB2，pTYB11，pTYB12,几丁质结合,1.pTYB1，pTYB2:intein在C端,pTYB系列,E.coli,表达载体：,9/30/2025,63,intein,指蛋白质的内含子。同mRNA一样，一些前体蛋白质具有内含子(intein)序列，位于多肽序列的中间,经加工切除后，两端的蛋白质外显子(extein)连接为成熟蛋白质分子。特点：.切割位点保守：内含子前面常为半胱氨酸，后面序列是组氨酸天门冬酰胺；内含子后面外显子序列的前面常是半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸；存在一些保守序列。.具有自动切割加工能力：如果蝇胚胎发育的内含子蛋白质(Hedgehog)。.蛋白质内含子片段具有核酸内切酶活性：杂合体中，无内含子的DNA序列，经内含子的切割跳跃而成为纯合子。,9/30/2025,64,2.pTYB11，pTYB12:intein在N端,9/30/2025,65,利用Intein 分离纯化外源蛋白,Intein与Chitin柱结合,DTT或-巯基乙醇或半胱氨酸能够诱导Intein的自我裂解活性,9/30/2025,66,9/30/2025,67,八、外源蛋白质表达后的正确修饰,分子内二硫键、分子间二硫键。二硫键异构酶催化。使蛋白质能够正确折叠。,1.形成正确的二硫键,9/30/2025,68,人胰岛素分子,9/30/2025,69,抗体分子,人血红蛋白分子,9/30/2025,70,如信号肽、内含肽（intein）等序列的切割。,2.前体切割,9/30/2025,71,（1）,O-糖基化（Ser,Thr）,增加蛋白质的稳定性和某些特殊性质。,3.蛋白质糖基化,糖基,9/30/2025,72,（2）N-糖基化（Asn）,Dol：长醇,Mannose：甘露糖,Glucose：葡萄糖,N-AcGlc：N乙酰氨基葡萄糖,9/30/2025,73,磷酸化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸化、羰基化、豆冠酸化、软脂化,4.氨基酸残基的修饰,羟脯氨酸,甲基组氨酸,羟赖氨酸,羧基谷氨酸,9/30/2025,74,缺乏蛋白质的加工。,（如糖基化、氨基酸修饰等）。,九、原核细胞表达的缺陷,9/30/2025,75,酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。,第二节 外源基因在真核细胞中的表达,真核或病毒启动子,MCS,PolyA信号,终止子,外源基因,9/30/2025,76,能在,E.coli,中克隆和扩增。,1.酵母克隆载体,一、在酵母中表达,Leu2,+,、His,+,、Ura3,+,、Trp1,+,;,有合适的克隆位点。,有酵母的选择标记,Ori,有,大肠杆菌的选择标记,Amp,r,、Tet,r,。,9/30/2025,77,Leu,-,酵母,原生质体,感受态,酶去壁,CaCl,2,、,PEG,整合到染色体上，,或独立在酵母细胞内,转化,Leu营养缺陷型,培养基筛选,转化子克隆生长,酵母载体,大肠杆菌,提取,插入外源基因,鉴定克隆,发酵表达,外源基因产物,分离、纯化,2.酵母转化和表达的一般过程,9/30/2025,78,诊断试剂,丙肝病毒蛋白,HIV-1抗原,种类,名称,疫苗,乙肝病毒表面抗原,疟原虫环子孢子蛋白,HIV-1外壳蛋白,3.在啤酒酵母中表达的重组蛋白,9/30/2025,79,人类治疗用蛋白药物,上皮生长因子,胰岛素,类胰岛素生长因子,血小板源生长因子,胰岛素前体,成纤维细胞生长因子,集落刺激因子,1抗胰蛋白酶,凝血因子VIIIa,9/30/2025,80,（1）细胞质内表达,例：人Cu/Zn-SOD在酵母中表达：,4.在啤酒酵母中表达外源蛋白的方式,超氧化物,H,+,H,2,O,2,H,2,O,过氧化物酶,表达出的SOD修饰正确：,起始氨基酸被切掉，,第二个氨基酸丙氨酸也被乙酰化。,SOD(超氧化物歧化酶),9/30/2025,81,宿主：,亮氨酸合成缺陷型酵母。,GAPD：,甘油醛磷酸脱氢酶,9/30/2025,82,（2）表达分泌型蛋白,在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白质才能被糖基化。,需要糖基化的重组蛋白必须是分泌蛋白。,方法：,构建载体,在重组蛋白的前面加一段编码酵母菌交配类型因子a1的前导肽，与重组蛋白的N端通过Lys-Arg相连。,前导肽（leader peptide）：,9/30/2025,83,蛋白质分泌到壁膜间隙时，酵母菌的,内切蛋白酶,识别这个切点信号，把重组蛋白正确切下来。,信号肽的切割：,前导肽,Lys-Arg,重组蛋白（水蛭素）,内切蛋白酶,9/30/2025,84,5.其它酵母表达系统,（1）,乙肝表面抗原在嗜甲烷酵母中表达,在大型发酵反应器中容易生长；,以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。,有甲醇时，表达的,乙醇氧化酶,高达胞内总蛋白的40%！,嗜甲烷酵母（,Pichia pastoris,）的特点,9/30/2025,85,HBsAg:乙肝表面抗原。可以作为疫苗。,Aox1：乙醇氧化酶基因1启动子（受甲醇激活调控）。,His4：组氨酸合成所需的组氨酸脱氢酶基因。,3-aox1：整合到特定染色体的位点序列。,表达载体构建（整合型）：,诱导物：甲醇。,产量：,9,10,6,剂疫苗/240L发酵液。,9/30/2025,86,整合到染色体中,9/30/2025,87,（2）牛溶菌酶C2在嗜甲醇酵母中的表达,作为饲料添加剂促进反刍动物消化。,产量：10L，200h连续发酵产出50g溶菌酶。,9/30/2025,88,二、昆虫培养细胞表达系统,1.杆状病毒（Baculovirus）,广泛侵染包括许多昆虫在内的无脊椎动物。,（1）侵染周期：,两种形式,单独病毒粒子形式,病毒,粒子,宿主细胞,病毒,粒子,侵染,释放,9/30/2025,89,病毒,粒子,宿主细胞,侵染,宿主细胞,侵染,合成多,角体蛋白,裂解,释放,多面体溶解,一般使用苜蓿银纹夜蛾细胞核型多角体病毒（,A,utographa,c,alifornia,m,ultiple,n,uclear,p,olyhedrosis,v,irus，AcMNPV）,多面体形式,9/30/2025,90,（2）杆状病毒的表达特点,感染后36-48h，病毒开始合成大量的,多角蛋白。,多角蛋白的启动子特别强。,多角蛋白基因可以被替换掉而不影响,病毒的繁殖。,9/30/2025,91,多角体基因被外源基因取代后，病毒仍然能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形成多面体。,3.转化子筛选,通过显微镜检查看是否有多面体形成。,源自草地夜蛾的细胞株，在这种细胞中，多角蛋白的,启动子特别活跃,。,2.最普遍应用的宿主细胞株,9/30/2025,92,（1）,转移载体的构建,大肠杆菌质粒,，插入两段AcMNPV序列以供同源重组。,4.杆状病毒转化载体,杆状病毒的基因组太大（13kb环状DNA），不能直接插入。,必须使用同源重组的办法。,多角蛋白的启动子和终止子及polyA加尾信号。,启动子与终止子之间插入多克隆位点,9/30/2025,93,转移载体,9/30/2025,94,（2）,杆状病毒载体转化过程,转移载体中插入外源基因,转移载体与野生型AcMNPV DNA共同转染宿主细胞,转移载体与病毒基因组发生双交换,外源基因被交换转入病毒基因组中,重组病毒侵染宿主4-5天后即可收获重组蛋白。,9/30/2025,95,9/30/2025,96,4.目前已经用杆状病毒在真核生物细胞中表达的外源蛋白,外源蛋白,外源蛋白,干扰素,腺苷酸脱氢酶,淀粉酶前体蛋白,干扰素,Blue tongue virus中和抗原,红细胞生成素,HIV-1外壳蛋白,流感病毒凝集素,白细胞介素2,Lassa virus蛋白,鼠单克隆抗体,脊髓灰质炎病毒蛋白,类狂犬病病毒蛋白,狂犬病病毒糖蛋白,Simian rotavirus外壳蛋白抗原,组织型纤溶酶原激活剂,9/30/2025,97,5.杆状病毒大规模表达存在的问题,杆状病毒侵染昆虫幼虫，在幼虫体内表达外源蛋白，成为“,低成本蛋白工厂,”。,22只粉蚊夜蛾幼虫4天后表达的人腺苷酸脱氢酶占幼虫总蛋白的2%-5%。共产出9mg很纯的产物。,（1）寿命短,感染4-5天后宿主细胞裂解或幼虫死亡。,（2）共同转染率低,0.1%-1%。,9/30/2025,98,三、外源基因在植物中表达,根瘤,存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（,t,umor,i,nducing plasmid）。,1.Ti质粒:,9/30/2025,99,Ti plasmid,9/30/2025,100,环状双链DNA，1.5,10,5,-2.0,10,5,bp（185kb）,(相当于细菌染色体的3%-5%）。,（1）Ti质粒的结构,9/30/2025,101,转移DNA，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的染色体上。长度一般为12-24kb，是Ti质粒最重要的部分。,左边界,右边界,生长素,基因,细胞分裂,素基因,冠瘿碱,合成基因,T-DNA（transfer-DNA）,生长素基因:,iaaM（tms1）和iaaH（tms2）编码合成,吲哚乙酸,（植物生长激素）的酶,iaaM:色氨酸-2-单加氧酶,9/30/2025,102,色氨酸-2-单加氧酶,色氨酸,吲哚-3-乙酰胺,iaaH:吲哚-3-乙酰胺水解酶,吲哚-3-乙酰胺水解酶,吲哚-3-乙酰胺,吲哚乙酸,细胞分裂素基因,tmr（ipt）：异戊烯转移酶,催化：,二磷酸异戊烯（IPP）,异戊烯酰嘌呤单磷酸（IPA）,5-AMP,9/30/2025,103,毒性基因（vir）,决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的,转移，进入和整合,。,vir的产物能诱导Ti质粒产生T-DNA区域的单链拷贝。单链拷贝从Ti质粒脱离后，可与vir的产物VIR D2蛋白结合，并在VIR D4和VIR B蛋白的帮助下穿过农杆菌内膜、外膜、壁和植物细胞壁、细胞膜及核膜，最后整合到植物染色体上。,9/30/2025,104,章鱼碱代谢基因和胭脂碱代谢基因：,不相容性基因,控制Ti质粒的不相容性。,冠瘿碱代谢基因,分别编码代谢这两种冠瘿碱的酶。维持农杆菌生长。,9/30/2025,105,（1）第一步:植物受伤,植物受伤后能分泌,酚类化合物,（如乙酰丁香酮、,羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的,毒性基因表达,。,2.农杆菌的感染和生存,9/30/2025,106,（2）第二步 感染植物,（3）第三步 毒性基因（vir）表达,T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。,农杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的基部）。,virA、virG、virD、virB,（4）第四步 T-DNA转移,T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞核里，整合到植物基因组中。,（5）第五步 诱导冠瘿瘤,9/30/2025,107,9/30/2025,108,（6）第六步 土壤农杆菌代谢冠瘿碱。,9/30/2025,109,裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶植物。,（1）能够自发地整合到植物的染色体上。,（2）能转化多种植物。,（3）强启动子,3.Ti质粒转化的对象,4.Ti质粒作为载体的可能性,T-DNA的冠瘿碱合成酶基因上有一个强启动子，能启动外源基因的表达。,9/30/2025,110,（1）分子量太大（200kb）！,（2）限制性酶切位点太多。,（3）被转化的植物细胞成为肿瘤，不能,再分化。,（4）在大肠杆菌中不能复制。,5.天然Ti质粒作载体的缺点,9/30/2025,111,（4）冠瘿碱合成对于植物无意义，应剔除掉;,（5）,加入大肠杆菌的ori和选择标记,;,（6）加上真核生物的,转录信号,和,结束信号,以,及,添加polyA的信号序列,。,（1）保留T-DNA的转移功能部分（,vir基因，,左右边界,）;,（2）减少限制性酶切位点，引入,单一插入位,点,;,（3）取消T-DNA的致瘤基因，使被转化的植,物细胞不再成为肿瘤，能正常,分化,;,6.Ti质粒的改造,9/30/2025,112,改造后的Ti质粒载体模式,left,right,M,C,S,AMP,r,ori,Vir,select,9/30/2025,113,7.Ti载体的类型,（1）共整合载体（cointegrate vectors）,pGV3850,是一种受体质粒，外源基因不能直接插入，而是需要借助于pBR322质粒作为中间载体。,9/30/2025,114,9/30/2025,115,9/30/2025,116,外源基因,Kan,r,pBR322,土壤农杆菌,含pGV3850,植物组织,卡那霉素筛选,胭脂碱筛选,抗卡那霉素,的土壤农杆菌,外源基因,表达鉴定,转化,插入,感染,pBR322与pGV3850重组,整合到,染色体上,pBR322不能在土壤农杆菌中复制，只能同pGV3850重组。只有这样，,土壤农杆菌才能得到抗卡那霉素性状。,9/30/2025,117,转化后可诱导愈伤组织分化成转基因植物,9/30/2025,118,（2）双元载体（binary vectors）,既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个,穿梭载体,。,Ti质粒被剔除了T-DNA、冠瘿碱代谢基因、vir基因。,大幅度减小质粒的体积。（10kb）,双元载体的结构,9/30/2025,119,9/30/2025,120,双元载体的转化,转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都在大肠杆菌里操作。,受体农杆菌内要求带有整套,vir基因,（但缺失T-DNA及左右边界）的“帮助质粒”提供vir产物。,1）基因插入,2）,帮助质粒,（helper plasmid）,9/30/2025,121,左,右,外源基因,双元载体,Vir,帮助质粒,农杆菌,Vir,农杆菌,左,右,外源基因,感染植物,转化,左,右,外源基因,进入植物细胞核，整合，表达,E.coli,9/30/2025,122,（3）三亲融合法(triparental matig),含双元载体的大肠杆菌：,含有,外源基因,和,左右边界,。,含有帮助质粒的辅助细菌：,含,vir基因,。,受体农杆菌（空）：,三种菌混合培养，然后通过各自的抗菌素抗性标记选择吸收了,外源基因,、,左右界,、和,Vir,的农杆菌。,三亲,9/30/2025,123,四、在哺乳动物细胞中表达,1.动物细胞基因克隆和表达载体-SV40病毒,常用的SV40载体，是从猿猴空泡病毒SV40（,s,imian,v,acuolating virus40）改造而来的。,9/30/2025,124,20面体外壳：,由VP1、VP2和VP3三种病毒外壳蛋白构成。,5243bp的环状双链。,DNA：,（1）SV40病毒的结构,9/30/2025,125,SV40,猿猴细胞,细胞裂解,释放SV40,啮齿类细胞,细胞癌变,SV40DNA整合到寄主染色体上,permissive,nonpermissive,（2）SV40感染和生存方式,9/30/2025,126,T-抗原（,t,umor antigen）:,两个6聚体的T抗原结合在SV40 DNA的复制起始点上，分别向相反方向移动，将双链DNA解螺旋。,随后单链DNA结合蛋白（ssB）与解开的单链DNA结合维持解旋状态。,(3)SV40 DNA的复制,解链,SV40编码的蛋白。功能是在SV40 DNA复制的时候解开DNA双链。,9/30/2025,127,9/30/2025,128,9/30/2025,129,T抗原,SV40 DNA双链,9/30/2025,130,SV40 复制起始位点,5-CTCA,CTACTTC,TG,GAATAG,C,3-GAGT,GATGAAG,AC,CTTATC,G,1,20,早期回文序列,TCA,GAGGC,C,GAGGC,GGCCTCGGCCTCT,AGTCTCCGGCTCCGC,CGGAG,C,CGGAG,A,21,47,T抗原结合位点,GC,ATAAATAAAAAAAATTA,GTC,CG,TATT,TATTTT TTTTAAT,CAG,富含AT区,48,69,9/30/2025,131,早期表达区：,(4)SV40病毒的转录和翻译,编码大,T抗原,（控制DNA复制）和小,t抗原,。,晚期表达区：,在DNA复制一段时间后表达，产物是,VP1、VP2和VP3三种外壳蛋白,。,9/30/2025,132,对非受纳细胞（non permissive cells），只有T 抗原表达，随后病毒基因组随机整合到宿主染色体上。,SV40,整合,(5)SV40病毒的整合,9/30/2025,133,去掉一部分DNA(T抗原或者VP基因）。,助手型SV40,去掉T抗原基因的病毒，,保留晚期复制启动子,。,提供外壳蛋白。,(6)SV40基因组的改造,不能复制，但能包装。,9/30/2025,134,需要这两种缺陷型病毒混合感染，才能互补。既能使插入SV40的外源基因复制，又能使外源基因被包装进病毒颗粒，得以扩增。,去掉VP基因，插入,外源基因,的病毒，,保留早期表达启动子,。不能包装，但能复制。,重组型SV40,包装重组型SV40,提供重组DNA和T抗原。,9/30/2025,135,助手型SV40:,提供VP外壳蛋白。,重组型SV40：,提供T抗原。,包装成的病毒颗粒中，,既有含外源基因的重组型,，又有助手型DNA。,(7)SV40混合传染过程,感染细胞，整合,9/30/2025,136,用复制起点有缺陷的SV40病毒侵染的猴细胞株CV-1得到的。所以称COS（,C,V-1，,O,rigin,S,V40）,病,毒不能复制，但能产生T抗原（类似重组型SV40）。,DNA,整合,到猴染色体上。所以COS细胞中只有T抗原，无游离的SV40DNA。,(8)COS细胞,COS细胞的特点：,有SV40的T抗原,。有利于SV40来源的载体复制,9/30/2025,137,9/30/2025,138,利用COS细胞扩增外源基因,9/30/2025,139,只保留SV40的,复制起始区,（ori）、早期区域（T抗原）的,启动子,、,Poly A,化位置以及t抗原的内含子。如pSV2:,a区:1-323bp，SV40的,复制起始区、T抗原启,动子、转录起始区,。,b区：324-3369bp，pBR322的,复制起始区、,氨苄青霉素抗性,基因。,c区：3370-4217bp，t抗原内含子（拼接信,号）、,Poly A化位置,。,d区：外源基因插入位置。,(9)SV40 DNA载体,9/30/2025,140,电刺激或脂质体转化法送入动物细胞。,9/30/2025,141,基因工程总结,目的基因的获得,载体的提纯,重组载体的构建(酶切/连接）,转化/转染细胞的筛选,宿主细胞的转化/转染,宿主细胞的培养,目的基因的诱导表达,9/30/2025,142,