生化实验课-琥珀酸脱氢酶.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2015-10-09,#,丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用,一、实验目的要求,学习和掌握竞争性抑制作用的特点。,观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。,二、实验,原理,化学结构与酶作用的底物结构相似的物质，可与底物竞争结合酶的活性中心，使酶的活性降低甚至丧失，这种抑制作用称为竞争性抑制作用。,琥珀酸脱氢酶是位于动物细胞线粒体内膜上的一种氧化酶，它直接与电子传递链相连，是机体内参与三羧酸循环的一种重要的脱氢酶，也是呼吸链的标志酶。在体内，琥珀酸脱氢酶可以使琥珀酸脱氢生成延胡索酸。脱下的氢进入,FADH2,呼吸链，通过一系列传递体，最后传递给氧而生成水。当在缺氧的情况下，脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色的甲烯白。这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。,二、实验原理,丙二酸,的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀酸竞争，而和琥珀酸脱氢酶结合。若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种现象称为竞争性抑制。如相对地增加琥珀酸的浓度，则可减轻丙二酸的抑制作用。,三器材与试剂,1.,器材,大白鼠、手术剪、镊子、磁盘、匀浆器、量筒、烧杯、纱布、滤纸、试管及试管架、恒温水箱、电热水浴锅,2.,试剂,0.2mol/L,琥珀酸溶液、,0.02mol/L,琥珀酸溶液、,0.2mol/L,丙二酸溶液、,0.02mol/L,丙二酸溶液、,1/15mol/L,磷酸缓冲液（,pH 7.4,）、,0.02,甲烯蓝、液体石蜡,四,.,操作,步骤,1.,酶提取液的制备：,取大白鼠的肝脏、心脏、肾脏,，,称重,?,，用,冷水洗,3,次，,剪小块,。加入,10X(,重量,),1/15mol/L,磷酸缓冲液（,pH 7.4,），在匀浆器中进行,匀浆（,最大速度,1-2,分钟,），,然后,用,4,层纱布过滤，,滤纸过滤,(4000RPM10MIN),，用,干净的烧杯收集过滤液，备用。,六,注意,事项,1,、酶提取液的制备应操作迅速，以防止酶活性降低。,2,、加入液体石蜡的作用是隔绝空气，以避免空气中的氧气对实验造成影响，因此加石蜡时试管壁要倾斜，注意不要产生气泡。,3,、,37,水浴保温过程中，不能摇动试管，避免空气中的氧气接触反应溶液，使得还原型的甲烯白重新氧化成蓝色。,4,、,37,水浴保温过程中，要注意随时观察各试管的褪色情况。,5,、实验结果结束后，一定要洗干净试管内的液体石蜡,。,七临床意义,竞争性抑制是可逆抑制过程,不破坏酶结构,不改变酶,浓度。,磺胺药与二氢叶酸结构类似，可竞争性抑制二,氢叶酸,合成酶活性，,进而减少菌体内四氢叶酸的,合成，达到抑制细菌生长的作用。,八思考题,1.,随着竞争物浓度与底物浓度的比值（,I/S,）增加，褪色时间如何变化，为什么？,2.,试阐述竞争性抑制作用的特点，并举例说明其临床意义。,